利用InDel分子標(biāo)記鑒定雜交秈稻中秈粳交雜株

潘偉芹，馬卉，許學(xué)，鮑翔宇，麥霄黎，林玲，吳爽，汪秀峰

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，合肥 230031）

0 引言

水稻是中國主要糧食作物，雜種優(yōu)勢在水稻中的利用大幅度地提高了單產(chǎn)水平，有力地保障了國家糧食安全。目前中國雜交水稻主要是利用“兩系法”與“三系法”培育而成[1]，雜交水稻在制種過程中，環(huán)境溫度的改變、外來花粉造成的生物學(xué)混雜和機(jī)械混雜會導(dǎo)致雜交稻種子純度降低[2]，直接影響了雜交稻的品質(zhì)與產(chǎn)量[3]。若在制種過程中，秈型不育系接受了外來的粳稻花粉，產(chǎn)生的F1因雜交不親和而在田間種植時(shí)表現(xiàn)為大青棵，反之亦然。大青棵分蘗力強(qiáng)、生長繁茂，在與正常雜交稻競爭中占較大的優(yōu)勢，影響周邊植株正常生長。正季長日高溫下，它的營養(yǎng)生育期一般較長，抽穗遲，甚至不能抽穗，進(jìn)而不能正常成熟、結(jié)實(shí)，從而造成產(chǎn)量損失[4-5]。此外，大青棵在田間很扎眼，即使只有1‰也會影響種子的推廣。

目前，雜交水稻純度鑒定主要是依靠在海南進(jìn)行田間種植，通過對水稻全生育期進(jìn)程的農(nóng)藝性狀觀察、比對，以鑒別F1及雜株[6]。該方法不僅鑒定費(fèi)用高、周期長、時(shí)效性低[7]；更重要的是海南短日照高溫的氣候使育性和生育期等發(fā)生變化，從而引起鑒定結(jié)果產(chǎn)生偏差[8]。例如正季表現(xiàn)為不能抽穗的大青棵單株在海南卻能夠正常抽穗結(jié)實(shí)，所以很難被準(zhǔn)確地鑒定[9]。因此，建立快速準(zhǔn)確的雜交稻種子純度檢測及秈粳交雜株鑒定的分子檢測體系，不僅可以預(yù)估雜交稻種子純度和預(yù)判雜株類型，而且可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)制種環(huán)節(jié)中的問題從而指導(dǎo)制種生產(chǎn)，同時(shí)對配組親本的選擇也提供參考。

SSR（Simple Sequence Repeats，簡單重復(fù)序列）因其具有數(shù)量豐富、重復(fù)性好、多態(tài)性高、遺傳上呈共顯性、實(shí)驗(yàn)操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于主要農(nóng)作物真實(shí)性與純度的輔助鑒定[10-12]。雖然有學(xué)者將SSR 標(biāo)記用于水稻秈粳分化的研究[13-14]，但是研究所用SSR 標(biāo)記數(shù)量較多，工作量大，耗時(shí)、耗力，且該部分標(biāo)記并非秈、粳特異性標(biāo)記，不具有廣適性。隨著SHEN等[15]完成粳稻日本晴與秈稻9311全基因組測序，建立包含479 406 個(gè)InDel(Insetion/Deletions)數(shù)據(jù)庫，并證實(shí)了InDel 標(biāo)記在秈、粳亞種間具有多態(tài)性，從此InDel標(biāo)記開始越來越多地被應(yīng)用于水稻秈粳分化屬性的判定、親緣關(guān)系、雜種優(yōu)勢的預(yù)測[16-18]。蔡星星等[19]開發(fā)出45 對InDel 標(biāo)記，可準(zhǔn)確地對92 份水稻進(jìn)行秈粳屬性的界定。LU等[20]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)34個(gè)InDel 位點(diǎn)與秈、粳遺傳分化密切相關(guān)，并針對水稻秈粳屬性判定提出了“InDel 分子指數(shù)法”。王林友等[21]利用19對InDel標(biāo)記準(zhǔn)確地鑒別出48份秈稻、粳稻以及中間型材料的秈粳屬性，與程式指數(shù)法的結(jié)果完全一致。以上研究說明InDel標(biāo)記用于水稻秈粳鑒定是完全可行的。目前關(guān)于大青棵產(chǎn)生的分子水平的研究較少，亦未見InDel 分子標(biāo)記用于秈粳交雜株分子鑒定的報(bào)道。

本研究以三系雜交稻粵泰A/R2020 為研究對象，利用親本間22 對多態(tài)性SSR 標(biāo)記對田間的疑似雜株進(jìn)行基因型分析，同時(shí)利用篩選出的適用于本組合的13對InDel標(biāo)記對8株雜株進(jìn)行串粉來源分析，為指導(dǎo)雜交水稻制種技術(shù)以提高種子純度和親本選擇提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

粵泰A/R2020是本單位小面積試制的紅蓮型雜交稻，粵泰A/R2020的F1和雙親、8株田間表型鑒定為大青棵的雜株以及23 份典型秈稻（‘9311’、‘桂99’、‘恒豐A’、‘粵泰A’、‘荃9311A’、‘粵禾絲苗’、‘五山絲苗’、‘盛泰A’、‘華占’、‘粵農(nóng)絲苗’）和粳稻（‘日本晴’、‘遼粳1415’、‘云粳30號’、‘鹽粳172’、‘武育粳3號’、‘鄭稻CB26’、‘南農(nóng)6427’、‘連粳9823’、‘泰粳4366’、‘南粳53015’、‘秀水42’）以及秈粳交雜交稻（‘嘉優(yōu)中科1號’、‘甬優(yōu)1540’）均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供。

1.2 田間鑒定

粵泰A/R2020 于2021 年5 月10 日在合肥市崗集基地播種。6 月3 日單苗移栽，種植500 株，栽插密度為16.7 cm×26.7 cm，田間管理基本同常規(guī)方法，化肥、除草劑減量使用。在整個(gè)生長階段觀察每個(gè)單株的表型，在抽穗期或成熟期取疑似雜株的葉片用于分子檢測。

1.3 室內(nèi)檢測

1.3.1 親本間多態(tài)性標(biāo)記篩選DNA的制備、引物序列參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR 標(biāo)記法》(NY/T 1433—2014)。PCR 擴(kuò)增采用10 μL 體系：25 mmol/LMgCl21μL，10μmol/L上、下游引物各0.5μL，5×PCR緩沖液2μL，2.5 mmol/L dNTPs混合溶液1μL，20 ng/μL DNA溶液2μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，共進(jìn)行30 次循環(huán)；72℃延伸8 min；4℃保存。PCR 產(chǎn)物采用3730 DNA 分析儀進(jìn)行電泳；電泳程序：預(yù)電泳15 kV，3 min，1.6 kV電壓上樣15 s，15 kV電壓運(yùn)行26 min，Data Collection收集原始數(shù)據(jù)。GeneMapper軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并記錄兩個(gè)親本在48 對標(biāo)記下的片段大小。

1.3.2 疑似雜株SSR 真實(shí)性檢測剪取F1以及田間疑似雜株1 cm 左右葉片。采用CTAB 法提取水稻基因組DNA，Nanodrop2000 核酸檢測儀檢測DNA 樣品濃度和質(zhì)量，統(tǒng)一將樣品稀釋至20 ng/μL 左右的終濃度，-20℃保存，備用。采用1.3.1篩選得到的22對多態(tài)性標(biāo)記對F1及雜株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系、程序同1.3.1。擴(kuò)增產(chǎn)物采用10%非變性聚丙烯酰胺膠進(jìn)行電泳；電泳條件：電壓180 V，電流80 mA，時(shí)間1 h，電泳結(jié)束后銀染。制膠及銀染操作參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR 標(biāo)記法》(NY/T 1433-2014)進(jìn)行，銀染結(jié)束后拍照，統(tǒng)計(jì)疑似雜株在每對標(biāo)記下的帶型。

1.3.3 秈粳特異性InDel 標(biāo)記篩選驗(yàn)證利用已公開的InDel標(biāo)記[19-21]對本實(shí)驗(yàn)保存的23份秈稻、粳稻以及秈粳雜交稻的秈粳屬性進(jìn)行篩選驗(yàn)證。PCR 擴(kuò)增采用10μL體系：25 mmol/L MgCl21μL，10μmol/L上、下游引物各0.5μL，5×PCR緩沖液2μL，2.5 mmol/L dNTPs混合溶液1μL，20 ng/μL DNA溶液2μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共進(jìn)行35次循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 秈粳交雜株的分子鑒定選取1.3.3 中擴(kuò)增條帶清晰且能明顯區(qū)分秈粳類型的18 對InDel 引物（表1）對父本、母本、F1及疑似雜株的秈粳屬性進(jìn)行鑒定。PCR反應(yīng)體系、程序等同于1.3.3。

表1 用于水稻秈粳屬性鑒定的InDel引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間多態(tài)性標(biāo)記篩選

母本‘粵泰A’與父本‘R2020’在3730 DNA 分析儀毛細(xì)管電泳檢測的結(jié)果見表2：父本與母本在16 個(gè)標(biāo)記下的擴(kuò)增片段大小一致，10個(gè)標(biāo)記下父本與母本片段大小差異小于5 bp（片段差異過小，PAGE膠上不易判讀結(jié)果），22個(gè)標(biāo)記下擴(kuò)增片段差值在6～51 bp之間，可用于該組合的真實(shí)性和純度鑒定（圖1）。

圖1 部分多態(tài)性引物PCR產(chǎn)物3730電泳圖譜

表2 親本間多態(tài)性引物及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小

2.2 疑似雜株SSR標(biāo)記分子檢測

8 個(gè)雜株在22 對標(biāo)記下有3 種帶型：母本帶型、F1帶型、串粉帶型（母本帶+非父本帶）。從表3可以看出22對標(biāo)記中，8對標(biāo)記檢測出雜株1-5為串粉帶型，9對標(biāo)記檢測出雜株6為串粉帶型，11對標(biāo)記檢測出雜株7為串粉帶型，10對標(biāo)記檢測出雜株8為串粉帶型；8個(gè)雜株在3對標(biāo)記（RM278、RM493、OSR28）下均為F1帶型（圖2A），6 對標(biāo)記（RM72、RM85、RM224、RM253、RM424、RM481）下均為串粉帶型（圖2B），以上結(jié)果證明了8個(gè)雜株均為串粉株。

圖2 疑似雜株的SSR標(biāo)記電泳圖（部分）

表3 疑似雜株的SSR標(biāo)記真實(shí)性鑒定

2.3 秈粳特異性InDel標(biāo)記的篩選

利用本實(shí)驗(yàn)室保存的秈稻、粳稻以及秈粳雜交稻等23份水稻品種進(jìn)行InDel標(biāo)記篩選，其中有18對引物如R2M10標(biāo)記能較好的擴(kuò)增出秈稻特帶異、粳稻特異帶以及秈-粳交雜合帶（圖3），可用于下一步研究。

圖3 InDel標(biāo)記R2M10在秈稻、粳稻以及秈粳雜交稻中PCR擴(kuò)增電泳圖

2.4 秈粳交雜株分子鑒定

利用篩選到的18 對InDel 標(biāo)記對親本、F1及疑似雜株進(jìn)行秈粳屬性的鑒定，母本‘粵泰A’均為秈稻特異帶，其秈型基因頻率為1，為典型秈稻。父本‘R2020’在R1M37、R2M50、R6M44、R9M42等標(biāo)記下為粳稻特異帶，粳稻基因頻率為0.22，秈型基因頻率0.78，表明‘R2020’是一個(gè)以秈稻為背景摻有少量粳稻血緣的恢復(fù)系；在R6M14標(biāo)記下6號雜株表現(xiàn)為秈稻純合帶型（圖4B），因此這5 個(gè)標(biāo)記不適于粵泰A/R2020 中雜株的秈粳屬性判定。初步篩選出13對特異性的InDel標(biāo)記用于雜株的秈粳屬性判定：R1M7、R2M10、R3M10、R3M53、R4M17、R5M13、R5M30、R7M7、R7M37、R8M33、R10M17、R11M23、R12M27。

圖4 串粉株在R2M10標(biāo)記(A)、R6M14標(biāo)記(B)PCR擴(kuò)增電泳圖

3 討論

3.1 提高雜交水稻純度鑒定準(zhǔn)確性的途徑

SSR標(biāo)記檢測主要基于串聯(lián)重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)差異進(jìn)行的DNA水平的檢測，結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好；而田間鑒定是根據(jù)植株表型差異來判定，表型受基因與環(huán)境共同影響，田間情況復(fù)雜，病害、自然環(huán)境條件以及技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)差異都可能會導(dǎo)致室內(nèi)檢測與田間結(jié)果的產(chǎn)生差異[22-23]。趙虹等[24]認(rèn)為單個(gè)引物純度鑒定時(shí)，利用每個(gè)品種特異性SSR 標(biāo)記才能檢測出混雜的相近品種；彭鎖堂等[25]用引物RM17 對‘汕優(yōu)63’、‘兩優(yōu)培九’的室內(nèi)純度檢測，其結(jié)果與田間結(jié)果一致。本研究中8 株疑似雜株在RM72、RM85、RM224、RM253、RM424、RM481 等標(biāo)記下均表現(xiàn)為串粉帶型（圖2B），這些標(biāo)記可以區(qū)分F1與串粉株。然而，研究者發(fā)現(xiàn)部分田間異株在室內(nèi)純度鑒定時(shí)未被檢出。例如陳榮林等[26]發(fā)現(xiàn)RM17可快速鑒定‘桂兩優(yōu)2號’種子純度，但是田間表現(xiàn)為變異株的個(gè)體未能檢出；王立廣等[27]通過對‘荃兩優(yōu)2118’純度檢測，發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記對串粉混雜和變異株較難區(qū)分；廖芳麗等[28]發(fā)現(xiàn)田間的異形株被多個(gè)標(biāo)記都判為正常株。本研究也有8 個(gè)雜株在RM278、RM493、OSR28 等標(biāo)記下表現(xiàn)F1帶型而未被檢出的現(xiàn)象（圖2A）；因?yàn)榇垭s株在這些引物標(biāo)記下基因型與父本恢復(fù)系基因型相同而無法檢測出，此類標(biāo)記不能區(qū)分真實(shí)的F1與串粉雜株，導(dǎo)致室內(nèi)鑒定結(jié)果偏高，這與朱國奇等[2]研究結(jié)果一致。宗凱等[29]利用不同引物對同一樣品進(jìn)行純度鑒定時(shí)，結(jié)果存在差異，進(jìn)而提出為控制誤差，宜用多對引物同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；趙虹等[30]亦通過田間鑒定與室內(nèi)多引物檢測結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)純度低樣品應(yīng)采用多對引物鑒定，否則差異較大。本研究中表3可以看出，不同引物鑒別能力不同，多對引物可提高雜株檢測率。所以在進(jìn)行雜交稻純度鑒定時(shí)，若對親本穩(wěn)定性、田間制種環(huán)境、收獲運(yùn)輸過程的機(jī)械混雜類型等不了解，可選取選擇合適的、多對引物，以降低誤差，提高室內(nèi)分子檢測準(zhǔn)確率。

3.2 水稻秈粳交雜株類型的鑒定

雜交稻制種過程中，如果制種基地附近為粳稻種植區(qū)，難以避免粳稻花粉竄入而產(chǎn)生秈粳交雜株，所以在雜交水稻室內(nèi)分子純度檢測中，有必要對來源于秈粳混栽區(qū)的雜交種中檢出的串粉株再進(jìn)行秈粳屬性鑒定，從而發(fā)現(xiàn)制種生產(chǎn)過程中存在的問題，避免秈粳交雜株的產(chǎn)生。張馨月[31]利用廣親和基因S5-n的功能標(biāo)記對秈粳交亞種間組合進(jìn)行鑒定，但方法具有一定的局限性，僅適用于父本與母本僅一方具有廣親和基因的配組方式。桂君梅等[32]證實(shí)了InDel 分子標(biāo)記對判定參試組合是屬于粳粳雜交稻，還是屬于秈粳雜交稻是十分有效的。本研究從18對InDel分子標(biāo)記中成功篩選出13對InDel標(biāo)記可用于粵泰A/R2020組合中雜株的秈粳屬性的鑒定。結(jié)果顯示8株大青棵均來源于粳稻花粉混入到制種田的秈型不育系柱頭上并能正常受精結(jié)實(shí)，這與制種田附近種植有常規(guī)粳稻相吻合，與RM72、RM85、RM224、RM253、RM424、RM481等SSR標(biāo)記下表現(xiàn)為串粉帶型結(jié)果也一致，說明InDel 分子標(biāo)記用于水稻秈粳屬性鑒定的準(zhǔn)確性、可靠性。雜交稻制種時(shí)為避免秈粳交類大青棵的產(chǎn)生，應(yīng)選擇無粳稻種植的區(qū)域或遠(yuǎn)離粳稻種植區(qū)作為制種基地、花期盡可能錯開。如果以上條件達(dá)不到就必須采用屏障隔離或在基地四周栽插父本等措施以減少粳稻的影響。通過本研究可推測雜交稻親本選擇時(shí)，如果雙親在以上InDel位點(diǎn)上存在差異就有可能產(chǎn)生大青棵。由于本研究只調(diào)查了粵泰A/R2020 這個(gè)組合，結(jié)果存在較大的局限性，還需要進(jìn)一步研究以篩選出更精準(zhǔn)和廣適的分子標(biāo)記。

4 結(jié)論

本研究將田間表型與室內(nèi)分子檢測相結(jié)合，增加室內(nèi)檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。篩選得到的13對InDel標(biāo)記用于田間大青棵秈粳屬性的驗(yàn)證，證實(shí)了粳稻花粉的竄入是產(chǎn)生大青棵的分子證據(jù)，從而對制種基地的選擇和隔離措施都提出了更高的要求，也為親本的選擇提供分子依據(jù)。