我國部分地區(qū)不同哺乳期母乳中脂肪酸含量的分析

王 蕾，李菊芳，米麗娟，逄金柱，葉興旺，3，劉正冬，3*，閆志遠(yuǎn)，3，金青哲，韋 偉*，王興國

（1 江南大學(xué)食品學(xué)院 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心 江蘇無錫214122 2 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司 北京101107 3 雅士利國際集團(tuán)有限公司 廣州 510335）

母乳為嬰兒的生長發(fā)育提供所需營養(yǎng)物質(zhì)。脂肪約占母乳的3%～5%，是母乳中主要的供能成分，為嬰兒生長提供約50%的能量、必需脂肪酸以及脂溶性維生素等[1]。近年來，人們對母乳的脂肪酸組成做了廣泛的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸（Saturated fatty acid，SFA）約占母乳中總脂肪酸的37%～56%，單不飽和脂肪酸（Monounsaturated fatty acid，MUFA）約占25%～43%，多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA）約占10%～20%[2]。母乳中脂肪酸的含量受地理位置、飲食習(xí)慣、經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平、哺乳期和母親基因等因素的影響[3-6]。有研究表明，母乳中二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA，C22 ∶6 n-3）的含量與魚類的攝入量顯著相關(guān)[7，8]。最新的一項(xiàng)研究表明，母乳中亞油酸（Linoleic acid，LA，C18∶2 n-6c）含量與大豆和豆制品的消費(fèi)量呈正相關(guān)關(guān)系，而與海產(chǎn)品的消費(fèi)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[9]。

目前的研究幾乎都是通過歸一化方法將脂肪酸含量以g/100 g 的形式表示[10-12]。將脂肪酸數(shù)據(jù)歸一化雖有許多優(yōu)點(diǎn)，但這種方法忽略了由脂肪提取不完全而造成的偏差，不能說明母乳中脂肪酸的絕對含量。Cruz-Hernandez 等[13]報(bào)道了一種以十一烷酸甲酯（C11∶0）為內(nèi)標(biāo)物的方法，通過計(jì)算不同脂肪酸的相應(yīng)因子，建立了一種可以測定母乳中脂肪酸絕對含量的方法。本團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上[14]，優(yōu)化母乳脂肪酸甲酯化的前處理方法，以定量分析母乳中碳鏈長度從4 到24 的脂肪酸含量。

本文將采用絕對含量的形式表征母乳中脂肪酸含量，并探究哺乳期間母乳中脂肪酸含量的變化規(guī)律以及地理位置對其的影響。本研究結(jié)果將為嬰兒配方奶粉的研發(fā)和評估嬰兒的脂肪酸攝入量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

母乳樣本從中國6 個(gè)城市采集，分別來自包頭（40 例）、北京（41 例）、濟(jì)南（20 例）、昆明（33例）、深圳（21 例）和西寧（49 例），由內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司提供。母乳樣本采集方案經(jīng)過北京首都兒科研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（SHERLL2013007）。脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品（C4～C24，18919-1AMP）和十一烷酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（≥98.0%），美國Sigma-Aldrich 有限公司；色譜級甲醇和正己烷，上海百靈威科技有限公司；分析純氨水、無水乙醇、無水乙醚、石油醚、氫氧化鉀、無水硫酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7820 氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；TGL-16B 高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SE812 氮吹儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；AR2140 電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-W600 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市榮華儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 母乳脂肪的提取 采用經(jīng)典的羅茲-哥特里法提取母乳中的脂肪[15]。取5 mL 母乳樣品，加入1 mL 氨水，充分混合后放入（65±5）℃電熱恒溫振蕩水浴鍋中振蕩20 min。取出冷卻至室溫，依次加入5 mL 無水乙醇、10 mL 無水乙醚和10 mL 石油醚，將混合物充分振蕩混勻并靜置2 h，待上清液明顯與水相分離，收集上清液。將所用溶劑減半，重復(fù)上述操作，進(jìn)行第2 次提取，得到的上清液與第1 次提取液合并，用氮?dú)鈱⑷軇┐蹈芍梁阒?，得到母乳脂肪，稱重后計(jì)算乳脂含量，結(jié)果以g/100 mL 母乳形式表示。

1.3.2 脂肪酸甲酯制備 采用氫氧化鉀-甲醇法制備脂肪酸甲酯[14]。稱取一定量上述母乳脂肪于離心管中，加入200 μL 質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的C11∶0 脂肪酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液，然后加入800 μL 正己烷，再加入500 μL 濃度為2 mol/L 的氫氧化鉀-甲醇溶液，混合振蕩2 min 使脂肪酸充分甲酯化。加入適量無水硫酸鈉，振蕩脫水。以10 000 r/min離心3 min，吸取上清液，過膜后采用氣相色譜進(jìn)行分析。

1.3.3 脂肪酸的定性分析 氣相色譜檢測條件[16]：色譜柱為DB-Fast FAME 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，Agilent，CA，USA）；采用氫火焰離子化檢測器，進(jìn)樣器溫度260 ℃。升溫程序：初始溫度為80 ℃，保持0.5 min；以40 ℃/min 的速度升溫至165 ℃并保持1 min；再以2 ℃/min 的速度升溫至220 ℃，保持1 min。載氣為氮?dú)?，流?5 mL/min；分流比為100∶1；進(jìn)樣體積為1 μL。根據(jù)37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對母乳中脂肪酸進(jìn)行定性。

1.3.4 脂肪酸的定量分析 根據(jù)前期研究結(jié)果[14]對母乳中脂肪酸進(jìn)行定量。首先，根據(jù)式（1）計(jì)算混合標(biāo)準(zhǔn)品中每個(gè)脂肪酸甲酯的響應(yīng)因子Ri。

式中，mi′——混合標(biāo)準(zhǔn)液中每種脂肪酸甲酯的相對百分質(zhì)量，%；A0′——混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖中C11∶0 的峰面積；m0′——混合標(biāo)準(zhǔn)品C11∶0 的相對百分質(zhì)量，%；Ai′——混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖中每種脂肪酸甲酯的峰面積。

根據(jù)式（2）對母乳中脂肪酸進(jìn)行定量，結(jié)果以mg/g 脂肪形式表示：

式中，F(xiàn)Ai——母乳中每種脂肪酸的含量，mg/g；m0——加入的內(nèi)標(biāo)C11∶0 的質(zhì)量，mg；Ri——每種脂肪酸的響應(yīng)因子；Ai——樣品的色譜圖中每種脂肪酸甲酯的峰面積；Si——將脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)換為脂肪酸的換算系數(shù)；A0——樣品的色譜圖中內(nèi)標(biāo)C11 ∶0 的峰面積；m——進(jìn)行甲酯化時(shí)稱取的母乳脂肪的質(zhì)量，mg。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IBM SPSS Statistics 25 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用方差分析法（ANOVA）中的Ducan 檢驗(yàn)分析各組數(shù)據(jù)間的顯著性差異，P<0.05 時(shí)認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用GraphPad prism 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 母乳脂肪含量

本研究所用的204 例母乳來自全國6 個(gè)城市的不同哺乳期乳母，根據(jù)哺乳時(shí)間，將母乳劃分為初乳產(chǎn)后0～7 d，共28 例；產(chǎn)后1 月齡乳共67 例和產(chǎn)后4 月齡乳共109 例；根據(jù)母乳采集地點(diǎn)，將母乳來源區(qū)域劃分為包頭（40 例）、北京（41 例）、濟(jì)南（20 例）、昆明（33 例）、深圳（21 例）和西寧（49 例）6 個(gè)地區(qū)。對不同哺乳期和地理位置的母乳中脂肪含量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同哺乳期（a）和不同地區(qū)（b）母乳中脂肪含量Fig.1 Fat content（g/100 mL）of human milk in different lactation periods（a）and different regions（b）

隨著哺乳期的延長，母乳中的脂肪含量會(huì)表現(xiàn)出較大變化[17]。從圖1a 可以看出，從初乳到成熟乳，脂肪含量呈顯著增加趨勢（P<0.05），由初乳的（2.67±1.09）g/100 mL 增加到1 月齡乳的（3.25±1.08）g/100 mL，進(jìn)而又增加到4 月齡乳的（3.31±1.54）g/100 mL，然而1 月齡乳和4 月齡乳的脂肪含量無顯著差異（P>0.05）。這與Qi 等[10]和Thakkar等[11]的研究結(jié)果一致，即母乳中的脂肪含量在初乳中最低，在成熟乳中含量最高。

母乳中的脂肪含量還會(huì)受到地理位置的影響。從圖1b 可以看出，濟(jì)南地區(qū)母乳中脂肪含量最高，為（5.07±1.60）g/100 mL；其次是西寧、包頭和北京，約為3.2 g/100 mL；昆明和深圳地區(qū)母乳中脂肪含量最低，均<3.0 g/100 mL。Chen 等[18]發(fā)現(xiàn)哈爾濱地區(qū)成熟乳中脂肪含量【（3.29±1.17）g/100 mL】 低于鄭州 【（3.90±1.41）g/100 mL】 和武漢【（3.89 ± 1.66）g/100 mL】母乳的脂肪含量。Wan等[19]報(bào)道的華北地區(qū)52 位乳母的成熟乳脂肪含量為（4.02±1.43）g/100 mL，推測不同地區(qū)母乳中脂肪含量的差異可能與母親的個(gè)體差異和母親的膳食習(xí)慣有關(guān)。

2.2 不同哺乳期母乳的脂肪酸含量

使用氣相色譜對母乳中脂肪酸組成進(jìn)行分析，共鑒定33 種脂肪酸，包括出14 種SFA、8 種MUFA 和11 種PUFA，并根據(jù)內(nèi)標(biāo)物C11 ∶0 的添加量，計(jì)算了母乳中脂肪酸的含量（mg/g 脂肪），不同哺乳期母乳中脂肪酸的含量如表1 所示。

表1 不同哺乳期母乳的脂肪酸含量（mg/g 脂肪）Table 1 Fatty acids concentration in human milk during lactation（mg/g Fat）

在3 個(gè)哺乳期中，總SFA 在初乳中的含量最低，為324.30 mg/g 脂肪，在1 月齡乳和4 月齡乳中含量相似，為341.14 mg/g 脂肪和339.94 mg/g脂肪，然而3 個(gè)哺乳期中SFA 的含量無顯著性差異（P>0.05）。棕櫚酸（C16∶0）是含量最豐富的SFA，在整個(gè)哺乳期中含量比較穩(wěn)定，約為192 mg/g 脂肪。何光華等[20]發(fā)現(xiàn)滬浙地區(qū)產(chǎn)后0～12 個(gè)月母乳中C16∶0 的含量穩(wěn)定在20%，與本文的研究結(jié)果相似。此外，隨著哺乳期延長，硬脂酸（C18∶0）含量顯著增加（P<0.05），由初乳中49.18 mg/g脂肪增加到1 月齡乳的57.02 mg/g 脂肪進(jìn)而又增加到61.81 mg/g 脂肪。3 種中鏈脂肪酸（C8 ∶0、C10 ∶0 和C12∶0）均在1 月齡乳中表現(xiàn)出最高含量，在初乳中含量最低。這可能是因?yàn)殡S著哺乳期延長，嬰兒對能量的需求增加，而中鏈脂肪酸在體內(nèi)水解后，直接經(jīng)門靜脈運(yùn)輸至肝臟，能夠快速為嬰兒提供能量[21]。此外，母乳中的中鏈脂肪酸來自于乳腺細(xì)胞的從頭合成，而哺乳早期乳腺的代謝尚未成熟，因此初乳中的中鏈脂肪酸含量較低[22]。

隨著哺乳期延長，母乳中總MUFA 含量顯著下降（P<0.05），由初乳中的361.02 mg/g 脂肪減少到1 月齡乳的331.41 mg/g 脂肪又減少到4 月齡乳的321.05 mg/g 脂肪，這與Giuffrida 等[23]報(bào)道的MUFA 在不同哺乳期之間的變化趨勢一致。油酸（C18∶1 n-9c）是母乳中含量最多的脂肪酸[2]，在本研究中，C18∶1 n-9c 在初乳中含量顯著高于1 月齡乳和4 月齡乳（P<0.05），初乳中含量為327.68mg/g 脂肪，而在1 月齡乳和4 月齡乳中僅為約300 mg/g 脂肪。母乳中另一含量豐富的MUFA，棕櫚油酸（C16∶1 n-7）在4 月齡乳中的含量顯著低于初乳和1 月齡乳（P<0.05）。

由表1 還可以看到，初乳中總n-6 PUFA 的含量為159.77 mg/g 脂肪，顯著低于1 月齡乳和4月齡乳中總n-6 PUFA 的含量（P<0.05）。亞油酸（LA，C18∶2 n-6c）是含量最豐富的n-6 PUFA，其含量隨著哺乳期延長表現(xiàn)出顯著增加的趨勢，從初乳的134.22 mg/g 脂肪增加到1 月齡乳的160.52 mg/g 脂肪（P<0.05）進(jìn)而又增加到174.08 mg/g 脂肪（P<0.05）。這與本實(shí)驗(yàn)室前期檢測的無錫地區(qū)不同哺乳期母乳中C18∶2 n-6c 的增長趨勢一致[14]。母乳中花生四烯酸（Arachidonic acid，ARA，C20∶4 n-6）含量在哺乳期間表現(xiàn)出顯著降低的趨勢（P<0.05）。與哺乳期間總n-6 PUFA 含量變化趨勢一致，母乳中總n-3 PUFA 含量雖隨著哺乳期延長也表現(xiàn)出增加的趨勢，但變化不顯著。亞麻酸（α-Linolenic acid，ALA，C18∶3 n-3）作為含量最豐富的n-3 PUFA，在整個(gè)哺乳期表現(xiàn)出顯著增加的趨勢（P<0.05），初乳中C18∶3 n-3 含量僅為9.74 mg/g 脂肪，而在4 月齡乳中可以達(dá)到15.08 mg/g 脂肪。母乳中的DHA（C22∶6 n-3）在初乳中的含量（3.82 mg/g 脂肪）顯著高于1 月齡乳（2.51 mg/g 脂肪）和4 月齡乳中的含量（2.64 mg/g 脂肪）。LA/ALA 的比值在1 月齡乳中最低，約為14，而3 個(gè)哺乳期LA/ALA 的比值無顯著性差異，這與前期的研究結(jié)果一致[10，24]。ARA/DHA 的比值在1 月齡乳中最高，約為1.93，且顯著高于4月齡乳（P<0.05）。

2.3 不同地區(qū)母乳中脂肪酸含量

不同地區(qū)母乳中脂肪酸的含量如表2 所示。濟(jì)南和北京母乳中總SFA 含量較高，均約為350 mg/g 脂肪；而深圳和西寧兩地母乳中總SFA 含量較低，均<330 mg/g 脂肪；包頭和昆明兩地母乳中總SFA 含量接近，約為343 mg/g 脂肪。包頭地區(qū)的母乳含有最高的C8 ∶0、C10 ∶0 和C12 ∶0 含量，分別為0.89，9.61 mg/g 脂肪和36.41 mg/g 脂肪。北京、濟(jì)南和昆明3 地母乳中C16∶0 的含量顯著高于包頭、深圳和西寧地區(qū)（P<0.05）。包頭、濟(jì)南和昆明地區(qū)母乳中C18∶0 含量（>60 mg/g 脂肪）高于其它3 座城市（<55 mg/g）。

表2 不同地區(qū)母乳中脂肪酸含量（mg/g 脂肪）Table 2 Fatty acids concentration in human milk from different cities（mg/g Fat）

不同地區(qū)母乳中總MUFA 含量表現(xiàn)出較大差異。其中，昆明和西寧兩地母乳中總MUFA 含量顯著高于其它城市（P<0.05）。6 地區(qū)母乳中含量最豐富的脂肪酸均是C18∶1 n-9c，而不同地區(qū)母乳中C18∶1 n-9c 含量表現(xiàn)出較大差異。昆明地區(qū)母乳含有最多的C18∶1 n-9c（333.63 mg/g 脂肪），其次為西寧（317.10 mg/g 脂肪），然后是濟(jì)南（301.23 mg/g 脂肪），包頭、北京和深圳3 地母乳中C18 ∶1 n-9c 含量較為接近，約為286 mg/g 脂肪。已有文獻(xiàn)報(bào)道，高油酸飲食會(huì)導(dǎo)致母乳中的C18∶1 n-9c含量升高[25]，因此各地區(qū)母乳中C18∶1 n-9c 含量的差異反映出各地區(qū)乳母攝入膳食脂肪類型的差異。此外，包頭和北京兩地母乳中C16∶1 n-7 的含量顯著高于深圳和西寧兩地（P<0.05）；濟(jì)南和昆明兩地母乳中C16∶1 n-7 的含量比較接近，分別為14.00 mg/g 脂肪和14.54 mg/g 脂肪。

地理位置對母乳中PUFA 含量的影響也比較明顯，其中以C18∶2 n-6c 最為顯著。母乳中C18∶2 n-6c 含量最高的城市是深圳，為206.35 mg/g 脂肪；其次是包頭和北京，分別為178.41 mg/g 脂肪和170.72 mg/g 脂肪；而昆明地區(qū)母乳中C18 ∶2 n-6c 含量最低，僅為133.05 mg/g 脂肪。包頭和西寧兩地區(qū)母乳中C18∶3 n-3 含量顯著高于其余4個(gè)城市（P<0.05）；濟(jì)南和深圳兩地母乳中DHA 含量顯著高于包頭、北京、昆明、西寧地區(qū)（P<0.05）。這與Urwin 等[26]發(fā)現(xiàn)的沿海和沿湖城市母乳中DHA 含量高于內(nèi)陸地區(qū)的結(jié)果相一致。

對于嬰幼兒來說，維持LA 和ALA 以及ARA和DHA 之間的攝入平衡對認(rèn)知、視力和免疫等功能的發(fā)育非常重要[27]。如表2 所示，不同城市母乳中LA/ALA 比值的差異比較明顯（P<0.05）。深圳、北京、濟(jì)南、包頭3 地母乳中LA/ALA 比值較高且超出了國內(nèi)外的推薦值【（5∶1）～（15∶1）】[28]，其次為昆明，最低的城市為西寧。母乳中ARA/DHA 的比值則表現(xiàn)出LA/ALA 比值相反的趨勢，即西寧和包頭兩地母乳中ARA/DHA 的比值顯著高于深圳和濟(jì)南兩地（P<0.05）。Liu 等[12]對比分析了山東、長春、重慶、廣州和呼和浩特5 個(gè)地區(qū)母乳中脂肪酸組成的差異，發(fā)現(xiàn)5 座城市母乳中LA/ALA 比值范圍為10～34，其中山東和廣州兩地母乳中擁有較高的LA/ALA 比值，長春、重慶和呼和浩特母乳中擁有較高的ARA/DHA 的比值，與本文的研究結(jié)果相似。母乳中脂肪酸的組成在很大程度上受到飲食習(xí)慣的影響[29]，對于那些擁有較高LA/ALA和ARA/DHA 比值的城市，可能需要提高母親膳食總n-3 系列脂肪酸的攝入量。

2.4 不同國家成熟乳中脂肪酸含量比較

目前對于母乳中脂肪酸絕對含量的報(bào)道比較少，本文總結(jié)了目前研究中關(guān)于母乳脂肪酸絕對含量的數(shù)據(jù)，并對不同國家的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，結(jié)果如表3 所示。

表3 8 個(gè)國家成熟乳中脂肪酸含量（mg/100 mL）Table 3 Fatty acids concentration in mature human milk from eight countries（mg/100 mL）

由表3 可知，新加坡和哥倫比亞兩國母乳中幾乎所有脂肪酸含量均高于其它國家，可能是母乳樣本的個(gè)體差異。此外，不同國家母乳中脂肪酸組成和含量差異較大，這可能與檢測方法以及各國哺乳期婦女的飲食結(jié)構(gòu)有關(guān)。除新加坡和哥倫比亞之外，中國母乳中C18∶1 n-9c 和C18∶2 n-6c 含量高于其它國家。Yuhas 等[8]分析了世界范圍內(nèi)9 個(gè)國家母乳中脂肪酸含量，發(fā)現(xiàn)中國和加拿大母乳中C18∶1 n-9c 含量最高；智利和墨西哥母乳中C18∶2 n-6c 含量最高，其次是中國。母乳中脂肪酸組成與各個(gè)國家攝入的食用油種類有關(guān)，例如，南美洲是玉米的原產(chǎn)地，因此當(dāng)?shù)鼐用窨赡芤愿缓珻18∶2 n-6c 的玉米油作為主要的食用油來源。在中國，油菜和大豆是主要的油料作物，因此中國母乳中較高含量的C18 ∶1 n-9c 和C18 ∶2 n-6c 可能來源于油菜籽油和大豆油。此外，由表3還可以發(fā)現(xiàn)中國母乳中C20∶1 n-9 和C22∶1 n-9的含量高于其它國家，這也反映出中國哺乳期婦女較高的油菜籽油攝入量。

3 結(jié)論

本文采用氣相色譜法測定了204 例母乳中脂肪酸的含量，研究了哺乳期和地理位置對母乳中脂肪酸含量的影響。結(jié)果表明，隨著哺乳期延長，母乳脂肪含量顯著增加，飽和脂肪酸含量在整個(gè)哺乳階段較為穩(wěn)定，不飽和脂肪酸的含量隨著哺乳期變化而變化。特別地，與成熟乳相比，初乳含有更高含量的長鏈多不飽和脂肪酸如ARA 和DHA。不同城市間母乳脂肪酸的含量表現(xiàn)出較大差異，這可能反映出乳母膳食結(jié)構(gòu)的差異，因此需要更進(jìn)一步的研究來探究膳食與母乳脂肪酸組成之間的關(guān)系。結(jié)合母乳脂肪含量數(shù)據(jù)，對比了8 個(gè)國家母乳中脂肪酸的含量，發(fā)現(xiàn)中國母乳中C18∶1 n-9c、C20∶1 n-9 和C22∶1 n-9 含量高于其它國家。