外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)桑黃發(fā)酵產(chǎn)黃酮的影響

宋 剛 張偉杰 張 德 凡軍民 余甜幸

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 茶與食品科技學(xué)院，江蘇 句容 212400）

桑黃（Sanghuangporusspp.）隸屬擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、銹革菌目（Hymenochaetales）、桑黃孔菌屬（Sanghuangporus），世界范圍內(nèi)共有14種[1-2]。桑黃是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，其名稱最早出自唐初甄權(quán)所著《藥性論》[1]，又名桑耳，國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)都有分布。《本草綱目》記載，桑黃能“利五臟，宣腸胃氣，排毒氣”，中醫(yī)認(rèn)為桑黃具有活血止血、化飲、止瀉、緩解腹痛等功效[3]?，F(xiàn)代研究表明，桑黃具有多種藥理活性，不僅能夠調(diào)節(jié)免疫，還可抗腫瘤、抗氧化和降血糖等[4-6]。

桑黃的藥理功效與其所含的活性物質(zhì)密切相關(guān)，其中黃酮和多糖是最為重要的兩種成分，含量的高低直接影響其藥用價(jià)值[7]。總黃酮含量可作為桑黃抗氧化功效的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)液體發(fā)酵生產(chǎn)桑黃黃酮已逐漸成為研究熱點(diǎn)[8-9]。而培養(yǎng)基中碳源、氮源及初始pH影響桑黃黃酮的生物合成[10]，通過(guò)優(yōu)化液體培養(yǎng)基組成可提高桑黃中黃酮類化合物的含量[11-13]。研究表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為外源添加物，可較大幅度地提高食藥用菌代謝物產(chǎn)量[14-16]。目前，已有脫落酸（ABA）可促進(jìn)桑黃中黃酮產(chǎn)量的報(bào)道[17]，其他類型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)桑黃發(fā)酵培養(yǎng)影響的研究還比較少。

本研究以團(tuán)隊(duì)前期篩選出的產(chǎn)黃酮優(yōu)勢(shì)桑黃菌株[18]為材料，通過(guò)在其液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加8種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，比較不同處理不同發(fā)酵時(shí)間菌絲體產(chǎn)量和胞內(nèi)黃酮含量，探討植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)桑黃液體發(fā)酵菌絲生長(zhǎng)和胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量的影響，以期為桑黃液體發(fā)酵生產(chǎn)黃酮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

桑黃菌株為桑樹(shù)桑黃品種‘SH-8’，由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院江蘇食用菌研究所提供。8種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：細(xì)胞分裂素類的6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和激動(dòng)素（KT），生長(zhǎng)素類的萘乙酸（NAA）、2,4-二氯-苯氧乙酸（2,4-D）及吲哚丁酸（IBA），水楊酸（SA），赤霉素（GA3），脫落酸（ABA）。

種子培養(yǎng)基。采用PDA加富培養(yǎng)基，即馬鈴薯200 g、葡萄糖25 g、酵母膏1 g、蛋白胨1 g、K2HPO42 g、MgSO42 g、瓊脂20 g、水1 000 mL，pH自然。高壓蒸汽滅菌后倒平板備用。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。采用吳亞召等[12]設(shè)計(jì)優(yōu)化的桑黃黃酮發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉2.0%、葡萄糖1.5%、黃豆粉1.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏0.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.05%、維生素B1100 mg/L，pH自然。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后備用。

1.2 方法

種子液制備。從冰箱保存的斜面試管菌種中挑取1小塊菌絲塊，接種至PDA加富平板28 ℃活化培養(yǎng)5天后，用9 mm打孔器取6塊菌絲塊，接種至含100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在160 r/min、28 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7天得到種子液。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基制備。參考王然等[19]方法將水楊酸（SA）、細(xì)胞分裂素（6-BA，KT）、生長(zhǎng)素（NAA，2,4-D，IBA）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）共8種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配置成1 mg/mL溶液，取1 mL滅菌（高溫或常溫過(guò)濾滅菌，IBA、GA3采用的過(guò)濾滅菌）加入裝有發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基99 mL的250 mL三角瓶中，使其在培養(yǎng)基中濃度為10 mg/L。以不添加為對(duì)照處理。

搖瓶培養(yǎng)。將種子液以10%（V/V）的接種量接種到添加了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的發(fā)酵培養(yǎng)基三角瓶中，恒溫?fù)u床28 ℃、160 r/min培養(yǎng)。分別于第7、9、11天取樣，測(cè)菌絲體生物量和胞內(nèi)黃酮含量，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

（1）菌絲體生物量。將100 mL發(fā)酵液中菌絲用20目篩網(wǎng)收集起來(lái)，于清水沖洗，直至培養(yǎng)基完全被洗凈，再將菌絲平攤到紗布上，在烘箱中60 ℃烘干，稱量得到菌絲干重（g）。

（2）胞內(nèi)黃酮含量。采用NaNO2-Al3+-NaOH體系分光光度法[20]測(cè)定，略有改動(dòng)。

材料和試劑：菌絲體磨碎干粉樣品、95%乙醇、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液、NaOH溶液。

供試液制備：稱取菌絲研磨干粉樣品0.1 g，置于三角瓶?jī)?nèi)，加入50%乙醇100 mL，75 ℃水浴提取1 h，然后過(guò)濾到100 mL容量瓶中，將過(guò)濾后的液體加入50%乙醇，使其定容到100 mL，然后搖勻，作為供試液。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL和5.0 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液倒入6個(gè)25 mL的容量瓶中，加入50%乙醇到5.0 mL，再加0.7 mL 5%NaNO2溶液，使其混合均勻，靜置反應(yīng)5 min；各加0.7 mL 10% Al(NO3)3溶液混合均勻，靜置反應(yīng)5 min；各加5 mL 10%NaOH溶液混合均勻后，用50%乙醇定容，放置10 min后，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以吸光度為縱軸，蘆丁液濃度為水平軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁濃度為0、20、40、60、80、100 mg/L。

胞內(nèi)黃酮含量測(cè)定：精確吸取3 mL供試液，于25 mL容量瓶中，加2.0 mL 70%乙醇，搖勻，再加0.7 mL 5%的NaNO2，搖勻，靜置5 min；將0.7 mL 10%Al(NO3)3加入混合液混合，靜置5 min；將5 mL 10%NaOH溶液加入混合液混勻，用50%乙醇定容，10 min后，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。通過(guò)回歸方程及樣品稀釋倍數(shù)，計(jì)算出樣品中黃酮含量（μg/mL）。

（3）胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量。根據(jù)第11天時(shí)菌絲胞內(nèi)黃酮含量和菌絲體生物量計(jì)算胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量。計(jì)算公式：菌絲體黃酮產(chǎn)量(μg/mL) =［胞內(nèi)黃酮含量（μg/mL）×100 mL/0.1g］×菌絲體干重（g/100 mL）。

將公式計(jì)算得到的黃酮產(chǎn)量（μg/mL）單位換算為mg/L，即為所得產(chǎn)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)處理取3次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果用SPSS 25.0進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，采用NaNO2-Al3+-NaOH比色體系獲得的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線在0～120 mg/L的濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，線性方程為：y= 0.01x+ 0.004，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，可以用于桑黃總黃酮含量計(jì)算。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)桑黃菌絲體生物量的影響

在接種后第7、9、11天分別過(guò)濾發(fā)酵液，獲得桑黃菌絲體，菌絲體呈黃色顆粒狀，且發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)顆粒越大，顏色逐漸變淺。

測(cè)定結(jié)果顯示，外源添加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)桑黃菌絲體生物量影響明顯（表1）：接種后第7～11天，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，添加6-BA、KT處理菌絲體生物量整體呈上升趨勢(shì)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；添加NAA、SA及對(duì)照（CK）處理的菌絲體生物量均呈先增加后下降趨勢(shì)，差異顯著；添加GA3和2,4-D處理的菌絲生物量呈逐漸下降趨勢(shì)，差異顯著；添加IBA、ABA處理的菌絲體生物量變化差異不顯著。在上述處理中，外源添加2,4-D發(fā)酵7天和KT 11天處理的桑黃菌絲體生物量最高，與其他處理間差異顯著。

表1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的桑黃菌絲體生物量

綜合比較，添加6-BA、KT、IBA、SA、2,4-D處理與CK相比，均能促進(jìn)桑黃菌絲體生物量增加，尤其6-BA和KT處理，100 mL培養(yǎng)液菌絲最大生物量分別達(dá)0.90 g、0.95 g，是CK最大生物量0.35 g的2.6倍和2.7倍；2,4-D在第7天的生物量達(dá)到1.02 g/100 mL，是CK最大生物量的2.9倍。NAA無(wú)明顯影響，而GA3和ABA處理引起桑黃菌絲體生物量下降。

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)桑黃菌絲體胞內(nèi)黃酮含量的影響

在接種后第7、9、11天分別過(guò)濾發(fā)酵液，獲得桑黃菌絲體后測(cè)定胞內(nèi)黃酮含量（圖2）。結(jié)果顯示，與CK相比，發(fā)酵培養(yǎng)第7天時(shí)，各處理菌絲體胞內(nèi)黃酮含量接近，無(wú)明顯差異；第9天時(shí)，各處理黃酮含量均提高，以2,4-D處理最高，為32.7μg/mL，是對(duì)照含量8.1 μg/mL的4倍；到第11天，KT、6-BA、NAA、IBA處理及CK的黃酮含量達(dá)到峰值，以KT處理含量最高（35.8 μg/mL），為對(duì)照處理（27.4 μg/mL）的1.3倍，而SA、GA3、ABA處理的含量下降且低于CK?？梢?jiàn)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的調(diào)控效果受發(fā)酵時(shí)間的影響。

圖2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理桑黃胞內(nèi)黃酮含量的變化

綜合來(lái)看，2,4-D、KT、IBA、6-BA在發(fā)酵第7～11天均表現(xiàn)出顯著促進(jìn)桑黃胞內(nèi)黃酮含量的作用效果。其中，6-BA主要是在第9～11天作用明顯，SA、GA3、ABA則在第7～9天內(nèi)有提升效果。

2.4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)桑黃菌絲體胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量的影響

取發(fā)酵第11天時(shí)桑黃菌絲體干重與胞內(nèi)黃酮含量，計(jì)算菌絲體胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量并進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，細(xì)胞分裂素KT、6-BA處理桑黃胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量分別為339.7 mg/L和266.4 mg/L，顯著高于其他處理和CK（69.9 mg/L）（P＜0.05），IBA和SA處理其次，NAA、2,4-D處理與CK間差異不顯著，GA3和ABA處理顯著低于CK（圖3）。

圖3 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理桑黃菌絲體的胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量

3 結(jié)論與討論

世界范圍內(nèi)桑黃孔菌屬有14種[2]，本研究所用桑黃菌株為桑樹(shù)桑黃（Sanghuangporus sanghuang）。研究表明，桑樹(shù)桑黃在活性成分含量及抗氧化等藥理作用上都優(yōu)于暴馬桑黃（S.baumii）、楊樹(shù)桑黃（S.vaninii）等種[21-22]。

本研究比較了8種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為外源誘導(dǎo)因子對(duì)桑黃液體發(fā)酵菌絲體生物量及其胞內(nèi)黃酮含量的影響。結(jié)果表明，與CK相比，除ABA和GA3處理抑制桑黃生長(zhǎng)、NAA無(wú)明顯影響外，其余植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑都能促進(jìn)桑黃菌絲體生物量的提升，但發(fā)酵不同時(shí)期作用效果差異較大；胞內(nèi)黃酮含量，各植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的調(diào)控效果同樣受發(fā)酵時(shí)間的影響。綜合來(lái)看，與CK相比，KT、6-BA、IBA、SA均能顯著提高桑黃胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量（P＜0.05），GA3、ABA抑制桑黃黃酮代謝，NAA、2,4-D無(wú)明顯影響。其中，KT、6-BA和IBA在培養(yǎng)7～11天中能持續(xù)促進(jìn)菌絲體生物量和胞內(nèi)黃酮含量的增加，尤其KT處理，在發(fā)酵11天時(shí)，菌絲體生物量和胞內(nèi)黃酮含量分別是對(duì)照CK最高值時(shí)的2.7倍和1.3倍，顯著高于其他處理。因此，在桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)中添加KT有助于提高黃酮產(chǎn)量，但具體添加量及添加形式還需要進(jìn)一步深入研究。

本試驗(yàn)中，發(fā)酵9天時(shí)桑黃菌絲體胞內(nèi)黃酮含量8種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理都高于CK，其中6-BA處理含量是CK的1.1倍，接近王然等[19]研究結(jié)果的1.76倍。桑黃菌絲體胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量，根據(jù)發(fā)酵11天的計(jì)算結(jié)果，6-BA、KT、SA、IBA處理的黃酮含量均顯著高于CK，最高的KT、6-BA處理分別達(dá)到CK的4.86和3.81倍，而GA3、ABA處理的含量顯著低于CK，與雷萍等[17]采用5～10 mg/L的ABA處理使桑黃發(fā)酵液中黃酮含量增加3倍結(jié)果相反，這可能與ABA的使用濃度不同有關(guān)。