平菇小白平的母種培養(yǎng)基篩選

周光燕 溫子欣 張貴合* 賀欒勁芝 周星辰 王名煒 程婉瑩 趙 丹

（1. 貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 551400；2. 貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550018）

平菇（Pleurotusostreatus）又名糙皮側(cè)耳，在分類學(xué)上隸屬于擔(dān)子菌門，傘菌綱，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬[1]。因其具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病性強(qiáng)、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，是我國(guó)最早栽培的大宗食用菌之一。平菇市場(chǎng)價(jià)格穩(wěn)定，肉肥質(zhì)嫩，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，備受廣大消費(fèi)者的喜愛[2-3]。隨著平菇產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，栽培技術(shù)不斷完善，但仍存在一些平菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約因素。其中，優(yōu)良母種是保障平菇高產(chǎn)的重要基礎(chǔ)，栽培過程中應(yīng)重視菌種選育工作[4]。而在實(shí)際生產(chǎn)中，往往把PDA培養(yǎng)基用作平菇母種的培養(yǎng)和傳代，若長(zhǎng)期使用單一培養(yǎng)基易加速菌種退化或變異，最終影響平菇產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

研究顯示，果皮、中藥渣、菌渣等均可用于平菇栽培[5-7]。利用中藥渣、植物莖葉以及香蕉皮等廢棄原料栽培，不僅能夠滿足平菇營(yíng)養(yǎng)需求，還能明顯提高子實(shí)體的粗纖維和多糖含量[5]。菌渣用于食用菌菌種制作和再生產(chǎn)，不僅能夠降低栽培成本，還能提高產(chǎn)量[8]。鹿茸菇作為新興的食用菌工廠化栽培種類之一，由于工廠化生產(chǎn)中一般只采收一潮菇，其菌渣中仍含有大量糖類、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，與稻草為原料栽培草菇已確定可行[7]，而在平菇栽培和菌種繁育方面的應(yīng)用鮮有報(bào)道。

為進(jìn)一步開發(fā)平菇菌種培養(yǎng)基的適宜原料，培育優(yōu)良菌種，本文總結(jié)前人研究結(jié)果，設(shè)計(jì)6種供試培養(yǎng)基、3種碳源和3種氮源觀測(cè)平菇菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)，以期篩選出適宜平菇菌絲生長(zhǎng)的母種培養(yǎng)基、碳源和氮源，為廣大菇農(nóng)和食用菌企業(yè)在菌種活化、傳代培養(yǎng)、菌種保藏等生產(chǎn)環(huán)節(jié)選擇優(yōu)良的母種培養(yǎng)基提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）供試菌株。供試平菇品種為小白平，屬于秋冬季栽培的廣溫特色平菇品種，來源于江蘇省高郵市科學(xué)食用菌研究所。其菇色純白，光澤好，肉質(zhì)厚實(shí)，菇體葉片大小勻稱整齊（圖1），冬季出菇優(yōu)良，貴州省未見大面積栽培。子實(shí)體采集于貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院貴州省珍稀食用菌工程中心種源基地，通過組織分離方法獲得母種并保存。

圖1 小白平子實(shí)體形態(tài)

菌種活化。原母種采用CPDA培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）保存，為了保證母種活性一致，采用CPDA培養(yǎng)基對(duì)母種進(jìn)行活化，接種后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 天左右，備用。

（2）供試培養(yǎng)基。綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（CPDA）[9]：去皮馬鈴薯（切片）200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，維生素B110 mg，瓊脂20 g，水1 000 mL。用于活化平菇試管母種，略有改動(dòng)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯（切片）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。作為對(duì)照。

改良沙氏瓊脂培養(yǎng)基（GSDA）：葡萄糖25 g，蛋白胨1 g，酵母膏0.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

改良蔗糖硝酸鈉培養(yǎng)基（GCZA）：蔗糖25 g，NaNO31 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

蘋果培養(yǎng)基（ApA）：蘋果100 g，蛋白胨2 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基（GGSA）：可溶性淀粉25 g，葡萄糖10 g，KNO31 g，K2HPO40.1 g，MgSO40.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

豆芽培養(yǎng)基（BSA）：新鮮黃豆芽250 g，蛋白胨5 g，葡萄糖30 g，酵母膏1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

培養(yǎng)基制作時(shí)，馬鈴薯和蘋果需切成片狀，黃豆芽保留原樣，先加一定量的水煮30 min后，紗布過濾，再加入其他試劑溶解，定容至1 000 mL，然后分裝至錐形瓶中。其他培養(yǎng)基均按照常規(guī)方法配制。在121 ℃、0.1 MPa條件下滅菌30 min，待冷卻后，在無菌條件下將培養(yǎng)基倒入90 mm的培養(yǎng)皿中制備平板，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）母種培養(yǎng)基的篩選。在無菌條件下，用直徑為7 mm的打孔器在長(zhǎng)有菌絲的CPDA平板上，制備大小、生長(zhǎng)趨勢(shì)一致的菌絲塊，用接種針挑取接至PDA、GSDA、GCZA、ApA、GGSA、BSA 6種供試培養(yǎng)基的中央，有菌絲的一面朝上，做好標(biāo)記。接種完成后，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，每處理5個(gè)重復(fù)。

觀察并記錄不同供試培養(yǎng)基的菌落形態(tài)特征，包括菌落圓整性、菌絲顏色、菌絲疏密程度和萌發(fā)情況。參照王振河等[10]研究方法將菌絲長(zhǎng)勢(shì)分為3級(jí)，即+++、++、+。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算不同培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速率：菌絲生長(zhǎng)速率（v）=菌落的平均半徑（cm）/培養(yǎng)時(shí)間（d）[9]。

（2）碳源試驗(yàn)?；谝陨吓囵B(yǎng)基篩選試驗(yàn)結(jié)果，小白平在豆芽培養(yǎng)基（BSA）上長(zhǎng)勢(shì)好。以BSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別等量添加（30 g/L）紅薯、玉米芯、香蕉皮代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源物質(zhì)葡萄糖，制成不同碳源平板，無菌接種大小相同的菌餅，25 ℃暗培養(yǎng)，觀測(cè)其生長(zhǎng)狀態(tài)，其余操作如上所述。

培養(yǎng)基制備操作步驟。按照上述配方稱取黃豆芽，取一定量的水煮黃豆芽30 min后，過濾，獲得濾液。等量稱取紅薯、玉米芯、香蕉皮，切成小塊，分別取一定量的水煮30 min后，過濾，獲得濾液。兩種濾液混合，再加入其他試劑溶解，定容至1 000 mL，然后分裝至錐形瓶中，滅菌。

（3）氮源試驗(yàn)。以BSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別等量添加（5 g/L）茶渣、鹿茸菌渣、麩皮代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源物質(zhì)蛋白胨，制成不同氮源平板，接種后25 ℃暗培養(yǎng)，觀測(cè)菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，其余操作如上所述。

培養(yǎng)基制備操作步驟。按照上述配方稱取黃豆芽，取一定量的水煮黃豆芽30 min后，過濾，獲得濾液。等量稱取茶渣、鹿茸菌渣、麩皮，取一定量的水煮20 min后，過濾，獲得濾液。兩種濾液混合，再加入其他試劑溶解，定容至1 000 mL，然后分裝至錐形瓶中，滅菌。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Office 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 在不同培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)

小白平在6種供試培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，但在不同培養(yǎng)基的菌落形態(tài)差異較大（圖2，表1）。其中，GCZA和GGSA培養(yǎng)基菌絲極為稀疏，生長(zhǎng)不良；ApA和BSA培養(yǎng)基菌落則表現(xiàn)中心發(fā)黃現(xiàn)象，可能是培養(yǎng)基所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加快了菌絲生理成熟所導(dǎo)致；BSA培養(yǎng)基的菌落大小和厚實(shí)度均優(yōu)于其他培養(yǎng)條件。菌絲長(zhǎng)勢(shì)由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋築SA＞ApA＞PDA＞GSDA＞GGSA＞GCZA。由此可推測(cè)，小白平對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用能力不一。

表1 在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速度

圖2 小白平在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征

小白平菌絲在6種培養(yǎng)基上的平均生長(zhǎng)速率不同（表1），以在BSA培養(yǎng)基上最快，為0.514 cm/d；在GGSA培養(yǎng)基上最慢，為0.252 cm/d。BSA培養(yǎng)基與其他培養(yǎng)基之間存在顯著差異，與GGSA、GCZA、GSDA培養(yǎng)基之間存在極顯著差異。GGSA與GSDA之間無顯著差異，但兩者與其他培養(yǎng)基之間均存在極顯著差異。

2.2 在不同碳源BSA培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明，小白平在不同碳源BSA培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，但菌絲長(zhǎng)勢(shì)、菌落大小和形態(tài)略有差異（表2、圖3）。在紅薯作為唯一碳源條件下，菌落中央出現(xiàn)局部發(fā)黃現(xiàn)象，而在葡萄糖、玉米芯、香蕉皮作為唯一碳源條件下，菌絲潔白。從菌落形態(tài)來看，葡萄糖更適宜小白平菌絲生長(zhǎng)，菌絲致密、菌落大、邊緣較圓整。

表2 在不同碳源BSA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和生長(zhǎng)速度

圖3 在不同碳源BSA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征

小白平在4種碳源BSA培養(yǎng)基上的菌絲平均生長(zhǎng)速率略有差異（表2），由高到低依次為葡萄糖、紅薯、玉米芯、香蕉皮，分別為0.587 cm/d、0.581 cm/d、0.556 cm/d、0.485 cm/d。葡萄糖碳源培養(yǎng)基與紅薯、玉米芯碳源培養(yǎng)基不存在顯著差異；而與香蕉皮培養(yǎng)基之間的差異極顯著。表明，BSA培養(yǎng)基的4種供試碳源中以葡萄糖最適宜小白平菌絲生長(zhǎng)，其次是紅薯和玉米芯，香蕉皮較差。

2.3 在不同氮源BSA培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)

小白平在不同氮源BSA培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)表現(xiàn)見圖4。在茶渣作為唯一氮源時(shí)，菌絲潔白；在蛋白胨、鹿茸菇菌渣、麩皮作為唯一氮源時(shí)，菌絲局部發(fā)黃。其中，以麩皮為氮源時(shí)菌絲密集和菌落大小均優(yōu)于其他氮源。

圖4 在不同碳源培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征

小白平在不同氮源培養(yǎng)基上的平均生長(zhǎng)速率略有差異（表3）。菌絲平均生長(zhǎng)速率由高到低依次為麩皮、蛋白胨、鹿茸菇菌渣、茶渣，分別為0.578 cm/d、0.545 cm/d、0.543 cm/d、0.469 cm/d。麩皮為氮源，與鹿茸菇菌渣和蛋白胨為氮源不存在顯著差異，與茶渣為氮源差異顯著。由此表明，BSA培養(yǎng)基的4種供試氮源中以麩皮最適宜小白平菌絲生長(zhǎng)，其次是蛋白胨和鹿茸菇菌渣，茶渣較差。

表3 在不同氮源BSA培養(yǎng)基的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從菌落形態(tài)、菌絲長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速率3個(gè)方面比較了小白平在6種不同培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)，結(jié)果以在BSA培養(yǎng)基上菌絲表現(xiàn)密集，呈同心輪紋地毯狀，中心局部發(fā)黃，菌絲長(zhǎng)勢(shì)和生長(zhǎng)速率均優(yōu)于其他培養(yǎng)條件，表明BSA培養(yǎng)基可作為小白平母種的優(yōu)選培養(yǎng)基。

基于BSA培養(yǎng)基更換不同碳、氮源對(duì)小白平進(jìn)行菌絲培養(yǎng)，研究其菌絲生長(zhǎng)的更適宜條件，結(jié)果為：BSA培養(yǎng)基小白平適宜碳源為葡萄糖，與研究報(bào)道的平菇能夠很好地同化葡萄糖[12]的結(jié)果一致；適宜氮源為麩皮，與黃清榮等[13]研究發(fā)現(xiàn)麩皮是白平菇深層發(fā)酵法培養(yǎng)菌種中的優(yōu)選氮源，可顯著提高菌絲體產(chǎn)量和菌球均一性的結(jié)果一致。從而得到小白平的最佳培養(yǎng)基配方為新鮮黃豆芽250 g，麩皮5 g，葡萄糖30 g，酵母膏1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

本研究中，碳源試驗(yàn)葡萄糖培養(yǎng)基和氮源試驗(yàn)蛋白胨培養(yǎng)基均為BSA培養(yǎng)基，但兩個(gè)試驗(yàn)的菌絲長(zhǎng)勢(shì)和平均生長(zhǎng)速率有所差異。推測(cè)其可能是由于碳、氮源試驗(yàn)是獨(dú)立開展，且培養(yǎng)時(shí)間不同，均以長(zhǎng)勢(shì)最快最好的培養(yǎng)基作為數(shù)據(jù)采集時(shí)間點(diǎn)，加之菌種的代數(shù)、菌齡大小等因素影響導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果存在偏差。在保證試驗(yàn)條件一致的前提條件下，本試驗(yàn)所得配方與常用配方如CPDA加富培養(yǎng)基等的培養(yǎng)效果還有待于進(jìn)一步試驗(yàn)比較驗(yàn)證。