HSP70和S100A9蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其意義*

廖秋林,彭大云,賴?yán)m(xù)文

(1.廣東祈福醫(yī)院,廣東 廣州 511495;2.中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院,廣東 廣州 510010)

作者前期進(jìn)行了腫瘤實(shí)體組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,鑒定出了較多低級別膠質(zhì)瘤與胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮腫瘤(DNT)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)[1]。其中,差異蛋白質(zhì)熱休克蛋白70(HSP70)屬于HSP家族中最重要的成員,也是研究最為熱門的一個(gè),其具有“分子伴侶”功能,與蛋白質(zhì)的合成、折疊、寡聚化和運(yùn)輸密切相關(guān),在蛋白質(zhì)的生物合成和細(xì)胞間運(yùn)輸起著紐帶作用[2]。S100鈣離子結(jié)合蛋白A9(S100A9)是S100家族的重要成員,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和誘發(fā)腫瘤免疫抑制的作用[3]。HSP70與S100A9之間作用機(jī)制并無直接關(guān)聯(lián),選做驗(yàn)證研究是因?yàn)樵谇捌谛迈r組織用同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)(iTRAQ)對比研究中發(fā)現(xiàn)這2種蛋白質(zhì)在低級別膠質(zhì)瘤組織與DNT組織中的表達(dá)有顯著差異,為作進(jìn)一步的驗(yàn)證,本研究顯著增加樣本量,采用石蠟標(biāo)本進(jìn)行回顧性研究。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測膠質(zhì)瘤組織中HSP70和S100A9的表達(dá)情況,分析這2種蛋白質(zhì)在膠質(zhì)瘤臨床分期和預(yù)后中的意義,為膠質(zhì)瘤的診斷和鑒別診斷、臨床分期和預(yù)后判斷尋找新的生物學(xué)標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 所有病理標(biāo)本取自2015年1月至2020年12月廣東祈福醫(yī)院和南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院確診的160例膠質(zhì)瘤初診患者,根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織(WHO)膠質(zhì)瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級,WHO Ⅰ級膠質(zhì)瘤40例,包含毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤34例、毛黏液樣型星形細(xì)胞瘤4例、室管膜下巨細(xì)胞星形細(xì)胞瘤2例;WHO Ⅱ級膠質(zhì)瘤40例,包含彌漫性星形細(xì)胞瘤23例、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤12例、混合型少突-星形細(xì)胞瘤5例;WHO Ⅲ級膠質(zhì)瘤40例,包含間變性星形細(xì)胞瘤32例、間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤8例;WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤40例,包含星形細(xì)胞瘤來源的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤25例、少突膠質(zhì)細(xì)胞來源的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤15例。其中,不包含WHO Ⅰ級的星形細(xì)胞來源的腫瘤共80例,少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤35例,混合型少突-星形細(xì)胞瘤5例。也可根據(jù)2016年WHO膠質(zhì)瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)簡單分為低級別膠質(zhì)瘤(WHO Ⅰ級和WHO Ⅱ級)和高級別膠質(zhì)瘤(WHO Ⅲ級和WHO Ⅳ級),各80例。所有病例中男111例,女69例;年齡21～78歲,中位年齡58歲。所有病例均為初診患者,均無嚴(yán)重并發(fā)癥,無基礎(chǔ)性代謝性疾病,均為初診患者,術(shù)前未行放化療及靶向治療,常規(guī)病理取材,10%中性緩沖福爾馬林固定液固定6～8 h,常規(guī)脫水處理及石蠟切片,所選取的蠟塊均包含腫瘤旁正常腦組織。本實(shí)驗(yàn)通過廣東祈福醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法 免疫組織化學(xué)法試劑HSP70和S100A9均購自Abcam公司,均為兔抗人多克隆抗體,工作濃度均為1∶50,所選蠟塊以4 μm厚度常規(guī)切片,涂膠片撈片,脫蠟,采用微波修復(fù)抗原,檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒所附操作說明書的步驟進(jìn)行。采用縮短一抗/二抗孵育時(shí)間,并多次以不同抗體濃度、多次預(yù)實(shí)驗(yàn)等以選擇最合適的工作濃度及實(shí)驗(yàn)方法,進(jìn)而大規(guī)模染片、判讀、打分及統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2免疫組織化學(xué)法結(jié)果判讀 由2位副主任醫(yī)師各自獨(dú)立觀察判斷,2個(gè)免疫標(biāo)記均以細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒著色為陽性細(xì)胞,從正常著色細(xì)胞、著色位置、內(nèi)對照及外對照等綜合判斷染片質(zhì)量,排除非特異染色干擾。選取5～10高倍鏡視野(400倍),計(jì)數(shù)500～1 000個(gè)細(xì)胞。采用二級計(jì)分法判定結(jié)果,陽性細(xì)胞數(shù)低于5%為0分;5%～25%為1分;>25%～50%為2分;>50%～75%為3分;>75%為4分。染色強(qiáng)度分類:淡黃色為1分;黃色或深黃色為2分;褐色或棕黃色為3分。兩者相加低于2分為陰性(-);2～3分為陽性(+);4～5分為中等陽性(++);6～7分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示,采用κ系數(shù)檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HSP70和S100A9在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) HSP70主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì),偶爾表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞核;正常人體組織較少表達(dá)HSP70。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,HSP70在膠質(zhì)瘤組表達(dá)陽性率為85.0%(136/160),在正常腦組織表達(dá)陽性率為23.1%(37/160),二者比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。S100A9在大部分腫瘤細(xì)胞陰性表達(dá),主要表達(dá)于反應(yīng)性或出血灶中的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核,部分細(xì)胞質(zhì)也有表達(dá)。S100A9在膠質(zhì)瘤組表達(dá)陽性率為7.5%(12/160),在正常腦組織組表達(dá)陽性率為4.4%(7/160),二者比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1。

注:A.膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞中HSP70的典型陽性表達(dá),以細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核表達(dá)為主;B.S100A9的典型陽性形態(tài),以細(xì)胞核表達(dá)為主。

2.2HSP70和S100A9在不同級別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)陽性率比較 HSP70在WHO分級Ⅰ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)陽性率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。S100A9在WHO分級Ⅰ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)陽性率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 HSP70和S100A9在不同WHO分級膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)差異[n(%)]

2.3HSP70和S100A9在低級別膠質(zhì)瘤與DNT組織中的表達(dá)陽性率比較 HSP70在低級別膠質(zhì)瘤組表達(dá)陽性率顯著高于DNT組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);S100A9在DNT組與低級別膠質(zhì)瘤組表達(dá)陽性率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),無鑒別診斷意義。見表3。

表3 膠質(zhì)瘤組與DNT組HSP70、S100A9表達(dá)陽性率比較[n(%)]

2.4膠質(zhì)瘤組織中HSP70和S100A9表達(dá)的相關(guān)性分析 通過配對計(jì)數(shù)資料的κ系數(shù)檢驗(yàn),因?yàn)棣?0.4,可見HSP70和S100A9在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)無相關(guān)性。

3 討 論

HSP70是HSP家族的重要成員,主要作用是調(diào)控人體應(yīng)急狀態(tài)下的蛋白質(zhì)代謝水平,其表達(dá)水平與細(xì)胞的應(yīng)激能力及功能狀態(tài)密切相關(guān),也可在一定程度上反映細(xì)胞的老化程度[4]。在腫瘤患者中,不同分化程度和不同分期的腫瘤細(xì)胞中HSP70表達(dá)水平均有不同,部分研究發(fā)現(xiàn)繼發(fā)性耐藥的腫瘤患者HSP70表達(dá)水平升高[5]。也有研究認(rèn)為HSP70可能誘導(dǎo)和增強(qiáng)人體自主的抗腫瘤免疫反應(yīng),抑制腫瘤細(xì)胞生長。如,HSP70參與了腫瘤細(xì)胞表型改變及與腫瘤特異性多肽抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物,誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)識別腫瘤細(xì)胞,引發(fā)人體的抗腫瘤特異免疫反應(yīng);HSP70也可以間接或直接激活自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞),直接殺滅腫瘤細(xì)胞[6-7]。近年來,已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中HSP70高表達(dá),如膠質(zhì)瘤[7]、肝細(xì)胞癌[8]、乳腺癌[9]、胃癌[10]、肺腺癌[11]等。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,HSP70的表達(dá)在膠質(zhì)瘤與正常腦組織之間有顯著差異,且隨著膠質(zhì)瘤WHO級別的增加其表達(dá)水平升高,說明HSP70與膠質(zhì)瘤的分化程度有密切關(guān)系,可用于膠質(zhì)瘤的輔助診斷標(biāo)志。HSP70還可作為膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點(diǎn),如抑制HSP70的合成或阻斷其抗凋亡作用均可延長膠質(zhì)瘤患者的生存期。DNT分為復(fù)雜型和單純型,典型的星形細(xì)胞瘤與單純型DNT有比較好分辨的形態(tài)學(xué)特征,而復(fù)雜型DNT由于具有特殊的少突膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞,與少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤鑒別十分困難。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HSP70在DNT與低級別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤表達(dá)明顯升高,可用于兩者的輔助鑒別診斷,從而避免將復(fù)雜型DNT診斷為WHO Ⅱ級的少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤,繼而導(dǎo)致不必要的過度治療,加重患者負(fù)擔(dān)且浪費(fèi)醫(yī)療資源。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)沒有驗(yàn)證HSP70與Ki-67等現(xiàn)有膠質(zhì)瘤免疫標(biāo)記的相關(guān)性,也無證據(jù)表明與已有的膠質(zhì)瘤免疫組織化學(xué)指標(biāo)有相關(guān)性。

S100A9蛋白屬于鈣結(jié)合蛋白,其編碼基因位于染色體1q21區(qū),易發(fā)生重排、易位、缺失等改變,主要參與細(xì)胞的分化和增殖,以及部分蛋白磷酸化,也參與一些具有突變的腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。已有研究發(fā)現(xiàn),S100A9蛋白在肺癌[13]、鼻咽癌[14]、宮頸癌[15]、乳腺癌[16]、胃癌[17]等諸多腫瘤中表達(dá)升高,且S100A9表達(dá)陽性率與腫瘤的分化程度呈負(fù)相關(guān),可能與腫瘤的發(fā)展、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,S100A9在大多數(shù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中無表達(dá),僅少許腫瘤細(xì)胞弱表達(dá),而在腫瘤組織中出血灶表達(dá)增高,且主要表達(dá)于出血灶中的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,部分淋巴細(xì)胞也有表達(dá),這與大多數(shù)文獻(xiàn)研究不同,作者仔細(xì)研讀相關(guān)文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)很多文獻(xiàn)中的配圖也是表達(dá)于中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞,并不是表達(dá)于腫瘤細(xì)胞,作者在180例免疫組織化學(xué)中觀察到了這個(gè)現(xiàn)象,其原因尚不清楚。因此S100A9不能作為膠質(zhì)瘤的輔助診斷標(biāo)志物,不能用于判斷膠質(zhì)瘤的預(yù)后,與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系不明,也不能用于低級別膠質(zhì)瘤與DNT的鑒別診斷。鑒于S100A9主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及部分淋巴細(xì)胞,提示可用于腫瘤免疫微環(huán)境的監(jiān)測,但其具體臨床意義則需要大量的臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證才可得出結(jié)論。