HIF-1α 納米抗體的制備及其抑制黑素瘤生長(zhǎng)的作用

李佳敏 ，賈 瓊 ，秦蓉芬 ，遲志端 ，王富明 ，范瑞文

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.晉中市莊子鄉(xiāng)綜合便民服務(wù)中心，山西 晉中 030600）

氧是生命活動(dòng)中所必需的物質(zhì)，且在其中起重要作用[1]。缺氧在惡性腫瘤中是較為常見的，且缺氧還是腫瘤生長(zhǎng)環(huán)境最顯著的特征之一[2]。組織和細(xì)胞是通過缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia inducible factor，HIF）誘導(dǎo)相應(yīng)靶基因來適應(yīng)氧氣濃度[3]。HIF-1、HIF-2 及HIF-3 是HIF 的3 種亞型，均由氧調(diào)節(jié)型α 亞基和組成型β 亞基構(gòu)成，α 亞基是活性亞基，又分為HIF-1α，HIF-2α 和HIF-3α[4]。HIF-1α 與氧濃度的關(guān)系密切，HIF-1α 是缺氧細(xì)胞基因表達(dá)的關(guān)鍵，其穩(wěn)定性和活性受各種翻譯后修飾、羥基化、乙?；土姿峄恼{(diào)節(jié)[5]。HIF-1α 成為許多適應(yīng)低氧微環(huán)境疾病的主要參與者，如癌癥、中風(fēng)和心臟病[6]。因此，阻斷HIF-1α 的表達(dá)或阻斷其相互作用的蛋白質(zhì)會(huì)抑制腫瘤生長(zhǎng)[7]。HIF-1α 在腫瘤組織中表達(dá)增高，一方面與腫瘤組織增生過快造成局部組織缺氧有關(guān)，另一方面，HIF-1α 是多種依賴氧張力的調(diào)節(jié)因子[8]，與某些癌基因激活或抑癌基因失活有關(guān)。因此，HIF-1α 的表達(dá)量可作為檢測(cè)惡性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)。

黑色素瘤來源于黑色素細(xì)胞，是一種具有侵襲性的皮膚癌[9-10]。黑色素瘤雖然發(fā)病率不高，但其死亡率較高[11-12]。黑色素瘤多發(fā)于哺乳動(dòng)物皮膚和黏膜，均具有侵襲性和致死性，且預(yù)后差[13-14]。HIF-1α 的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，研究其在黑色素瘤發(fā)病和發(fā)展機(jī)制中的作用對(duì)于改善患者的臨床結(jié)果至關(guān)重要[15]。HIF-1α 介導(dǎo)不同過程的基因轉(zhuǎn)錄，包括應(yīng)激適應(yīng)、代謝、凋亡、腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和侵襲[16]。近年來研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 參與了PI3K/Akt/mTOR、Ras/RAF/MEK/ERK、JAK/STAT、Wnt/β-catenin、Notch 等信號(hào)通路[17-18]，這些路徑及其相關(guān)的復(fù)雜變化影響黑色素瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展、新陳代謝、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞凋亡[19]。

傳統(tǒng)抗體藥物分子較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，較易失活且價(jià)格昂貴。納米抗體的優(yōu)勢(shì)在于分子小、滲透性強(qiáng)，能夠針對(duì)傳統(tǒng)單抗所不能觸及的抗原表位設(shè)計(jì)藥物，使其更好地到達(dá)腫瘤內(nèi)部以及穿透血腦屏障[20]。因此，基于HIF-1α 表達(dá)受到抑制將發(fā)揮抗腫瘤功能，結(jié)合納米抗體的優(yōu)勢(shì)，本研究以羊駝源黑色素瘤B16 噬菌體文庫(kù)制備HIF-1α 納米抗體，并驗(yàn)證其在黑素瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展過程中的作用，旨在為抑制腫瘤生長(zhǎng)提供新思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌TG1、輔助噬菌體M13K07、B16 細(xì)胞和羊駝源黑色素瘤B16 噬菌體文庫(kù)、正常小鼠腦組織切片均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實(shí)驗(yàn)室保存提供。HIF-1α 多肽購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HIF-1α 納米抗體的篩選 將HIF-1α 多肽稀釋至終質(zhì)量濃度為20 μg/mL，包被免疫管，4 ℃靜置過夜，以備用。將TG1 接種于5 mL 2YT 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 過夜振蕩培養(yǎng)以活化。

將500 μL 噬菌體文庫(kù)溶于100 mL 2YT/AG溶液培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至D600nm值為0.4～0.6；加入100 μL 輔助噬菌體，混勻靜置30 min，再37 ℃、200 r/min 振蕩30 min，棄上清，加入100 mL 2YT/AK 液體培養(yǎng)基重懸沉淀，30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至過夜。次日，將TG1 接入30 mL 2YT 中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至D600nm=0.4備用。4 ℃、11 000 r/min 離心10 min，去上清加入1/5 體積遇冷的PEG/NaCl，冰上放置70 min。離心后用2.4 mL 無(wú)菌PBS 重新懸浮菌體沉淀，再次離心，回收上清加入事先包被20 μL/mLHIF-1α 多肽的免疫包被管中。37 ℃封閉1 h 后用PBS 沖洗，并加入三乙醇胺，緩慢振蕩15 min，加入Tris-HCl中和。將其涂布于2YT/AG 平板，30 ℃培養(yǎng)過夜。次日收集菌落，作為HIF-1α 一級(jí)文庫(kù)。

按上述方法，分別以10、5、2.5 μg/mL 的HIF-1α 質(zhì)量濃度進(jìn)行第2 輪、3 輪、4 輪的淘篩。從第4 輪篩選洗脫物滴定的平板上，隨機(jī)挑取96 個(gè)單克隆接種于2YTAG 中與30 ℃振蕩培養(yǎng)8 h，加入稀釋的噬菌體，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h 后離心，棄去上清用含有Kana 抗性的培養(yǎng)基重懸沉淀，37 ℃過夜培養(yǎng)。

將HIF-1α 蛋白和BSA 蛋白包被于96 孔板，用ELISA 法篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果，在NCBI基因庫(kù)中選擇VHH序列并用DNAMAN進(jìn)行比對(duì)和ORF Finder 軟件進(jìn)行氨基酸序列分析，選取能夠完整表達(dá)蛋白質(zhì)的菌株，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 載體的構(gòu)建 按陽(yáng)性克隆的DNA 序列設(shè)計(jì)引物（含BamHI、SalI 酶切位點(diǎn)）：HIF-1α-F：5'-CGGGATCCGAGTCGGGAGGAGGCTTGG-3'；HIF-1α -R：5'-GCGTCGACTGAGGAGACGGT GACTAGGG-3'。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL：2×Es Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板5 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR 產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳膠回收，將回收產(chǎn)物和PMD19-T 連接，PMD-19T 反應(yīng)體系為：PMD-19T 1 μL，回收產(chǎn)物4 μL，Solution Buffer 1 μL。之后再以BamHI、SalI 將19TNbHIF-1α 和pET-28a 進(jìn)行雙酶切并進(jìn)行T4 連接（雙酶切體系為：10×QuickCut Buffer 5 μL，BamHⅠ 1 μL，SalⅠ 1 μL，19TNbHIF-1α 質(zhì)粒8 μL，ddH2O 35 μL；T4 連接體系為：回收菌體質(zhì)粒6 μL，回收載體2 μL，T4 連接酶1 μL，T4Buffer 2 μL，ddH2O 9 μL，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，涂布于含100 μg/mL Kana 的LB 平板上37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆接種于LB-Kana 液體培養(yǎng)基搖至D600為0.4～0.6 后測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pET28a-NbHIF-1α。

1.2.3 HIF-1α 納米抗體表達(dá)與純化 將5 μL pET28a-NbHIF-1α 提取質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）中，冰浴30 min，42 ℃熱激45 s，再冰浴3 min，37 ℃、200 r/min 振蕩活化1 h，菌液接種于LBKana 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩至D600為0.6，加入0.3 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），28 ℃、200 r/min 搖菌4 h 后收菌，將菌液沉淀用PBS 清洗2 次后超聲破碎，16 000 g 離心30 min。使用AKTA 層析系統(tǒng)與鎳離子金屬螯合親和層析介質(zhì)（Ni-NTA）預(yù)裝柱對(duì)帶有His 標(biāo)簽的納米抗體進(jìn)行純化，分別用不同梯度咪唑和分子篩除去雜蛋白，將蛋白用超濾管濃縮后分裝，-80 ℃保存。

1.2.4 HIF-1α 納米抗體的應(yīng)用 將6 周齡正常小鼠腦組織研磨后提取總蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，將純化的HIF-1α 納米抗體作為一抗、HRPHis-Tag 作為二抗進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)腦組織中HIF-1α 蛋白的表達(dá)。

將制備的小鼠腦組織制備石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)，然后在3%雙氧水中室溫孵育30 min。用PBS 洗滌后，用5%BSA 在37 ℃封閉1 h，然后與純化的納米抗體或PBS（空白對(duì)照）孵育，之后于37 ℃在His-tag 抗體孵育1 h。DAB 顯色，隨時(shí)觀察停止顯色，然后用蘇木精復(fù)染，脫色封片，檢測(cè)小鼠腦組織中HIF-1α 表達(dá)分布。

1.2.5 HIF-1α納米抗體對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖的影響待B16 細(xì)胞在培養(yǎng)皿中長(zhǎng)到80%～90%，與HIF-1α 納米抗體加入96 孔板中，并保證每孔2 000 個(gè)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中待6 h 后，在每孔中加入10 μL CCK-8 工作液，檢測(cè)0、3、6、9 h 的450 nm 波長(zhǎng)的吸光度。

1.2.6 HIF-1α 納米抗體對(duì)黑素瘤細(xì)胞遷移的影響 將培養(yǎng)到80%～90%的B16 細(xì)胞傳代至12 孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿12 孔板后，使用直尺與100 μL 槍頭在12 孔板劃平行線，用PBS 緩沖液洗凈殘留細(xì)胞。試驗(yàn)組加入HIF-1α 納米抗體。分別在劃痕0、12、24、36 h 后對(duì)同一位置進(jìn)行拍照，觀察細(xì)胞遷移結(jié)果。

1.2.7 HIF-1α 納米抗體對(duì)增值相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 選取培養(yǎng)狀態(tài)良好且培養(yǎng)到80%～90%的豐度，細(xì)胞傳代到6 孔板中，試驗(yàn)組和對(duì)照組各3 個(gè)孔。試驗(yàn)組中加入HIF-1α 抗體，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。用所提蛋白進(jìn)行Westen Blot 檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)細(xì)胞中Ras、RAF1、ERK1/2、RAC1 和VEGF 蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HIF-1α 納米抗體的篩選及序列特征

通過對(duì)陽(yáng)性克隆的序列進(jìn)行比對(duì)，篩選出6 個(gè)VHH 序列。經(jīng)過ELISA 法對(duì)6 個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行抗原結(jié)合力檢測(cè)，選取1A12 作為候選克隆（表1）。1A12 的核苷酸序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的VHH 序列相似性達(dá)到78%（圖1-A），通過對(duì)1A12 克隆的氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)該序列沒有形成跨膜區(qū)（圖1-B），為親水性蛋白（圖1-C）。1A12 的氨基酸序列由88 個(gè)氨基酸構(gòu)成，含有完整的4 個(gè)框架區(qū)（FR1～FR4）和3 個(gè)高度可變抗原結(jié)合區(qū)即互補(bǔ)決定區(qū)（CDR1～CDR3），其中CDR3 是抗原特異性識(shí)別的區(qū)域，含有11 個(gè)氨基酸（圖1-D）。

表1 HIF-1α 單克隆ELISA 篩選結(jié)果Tab.1 Monoclonal screening of HIF-1α by ELISA

2.2 納米抗體表達(dá)、純化與結(jié)合性檢測(cè)

以挑選出的VHH（1A12）序列質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出大小約為400 bp 的VHH 片段（圖2-A）。將VHH 片段與PMD19-T 連接后再連接到pET-28a 表達(dá)載體上以構(gòu)建質(zhì)粒（圖2-B）。

圖2 質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of the plasmid

構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)原核表達(dá)和純化后，用考馬斯亮藍(lán)染色以及Western Blot 進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，考馬斯亮藍(lán)染色得到的條帶較單一（圖3-A）；Western Blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大小約為16 ku 的特異性條帶（圖3-B），說明該蛋白為表達(dá)所得的特異蛋白。

選取小鼠腦組織，免疫組織化學(xué)一抗試驗(yàn)組用HIF-1α 納米抗體，用PBS 作對(duì)照，可看出大腦組織中的免疫陽(yáng)性信號(hào)（圖3-C），由此可見，HIF-1α 納米抗體可以與抗原HIF-1α 結(jié)合，用于HIF-1α 的組織定位。

Western Blot 試驗(yàn)中一抗用純化所得的HIF-1α 納米抗體，選取小鼠腦組織提取蛋白，結(jié)果顯示，HIF-1α 納米抗體作為一抗可以與抗原HIF-1α 結(jié)合，檢測(cè)到特異性的免疫陽(yáng)性條帶，分子質(zhì)量約為100、120、130 ku（圖3-D），說明腦組織中表達(dá)HIF-1α。由此可知，制備的HIF-1α 納米抗體可用于Western Blot 試驗(yàn)的一抗以檢測(cè)組織中HIF-1α 抗原表達(dá)的相對(duì)定量。

2.3 HIF-1α 納米抗體對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

將HIF-1α 納米抗體加入B16 細(xì)胞培養(yǎng)基中，用CCK-8 法檢測(cè)并觀察對(duì)B16 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，在HIF-1α 納米抗體作用下，在3～9 h 內(nèi)，加入HIF-1α 納米抗體的B16 細(xì)胞表現(xiàn)出了抑制效果（圖4-A）。將HIF-1α納米抗體加入B16細(xì)胞培養(yǎng)基中，用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)HIF-1α 納米抗體對(duì)B16細(xì)胞遷移的影響。B16 細(xì)胞在培養(yǎng)0、12、24、36 h 檢測(cè)，在12 h 時(shí)已出現(xiàn)抑制細(xì)胞遷移現(xiàn)象（圖4-B）。

圖4 HIF-1α 納米抗體對(duì)B16 細(xì)胞增殖、遷移及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of HIF-1α nano-antibody on proliferation，migration，and expression of the related proteins in B16 cells

在CCK-8 法檢測(cè)HIF-1α 納米抗體抑制B16細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)上，提取HIF-1α 納米抗體處理15 h后的B16 細(xì)胞總蛋白，用Western Blot 檢測(cè)VEGF、RAS、ERK、RAC 和RAF 蛋白的表達(dá)量，與對(duì)照組相比，HIF-1α 納米抗體處理B16 細(xì)胞后其蛋白量均呈下降趨勢(shì)（圖4-C、D）。

3 結(jié)論與討論

HIF-1α 亞基是堿性-環(huán)-螺旋（basic-helixloop-helix, Bhlh）–PAS（per/ARNT/Sim，PAS）)超家族成員之一[21]，HIF-1α 位于多種致癌和抑癌途徑的交匯點(diǎn)，包括PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信號(hào)通路，而這些信號(hào)通路是分子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心，控制著許多細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和生存，而腫瘤組織常高表達(dá)HIF-1α[22-23]。通過多種方式抑制HIF-1α 的表達(dá)有望成為治療黑色素瘤的方法。

本研究通過已建立的羊駝源黑素瘤噬菌體文庫(kù)，以HIF-1α 多肽進(jìn)行4 輪淘篩，篩選出1 株陽(yáng)性單克隆菌株，經(jīng)過原核表達(dá)載體構(gòu)建并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，鎳柱純化得到HIF-1α 納米抗體。所得的納米抗體抗原特異性識(shí)別區(qū)域CDR3 含有11 個(gè)氨基酸殘基超過了傳統(tǒng)抗體CDR3 的平均長(zhǎng)度（7～9 個(gè)氨基酸殘基），可增大與抗原的接觸面積，因此其與抗原具有較好的親和性。VEGF 家族是一類血管調(diào)節(jié)因子[24]，新生血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制之一，血管參與加速腫瘤生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等過程[25]。在黑素瘤細(xì)胞中，HIF-1α 納米抗體穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)中，與HIF-1α 結(jié)合后，抑制VEGF 下游靶基因表達(dá)，并抑制Ras 信號(hào)路徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)，同時(shí)使黑素瘤細(xì)胞中ERK 和P-ERK 表達(dá)下調(diào)，ERK 是絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族成員之一，該酶被激活后，成為磷酸化的ERK（P-ERK）。p-ERK 可以介導(dǎo)信號(hào)由胞漿向胞核傳遞，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、分裂等多種生理過程，其異常表達(dá)在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[26]。并且發(fā)現(xiàn)HIF-1α 納米抗體在黑素瘤細(xì)胞中引起RAF1 表達(dá)下調(diào)，通過PLC-γ-PKC-Raf-MEKMAPK 信號(hào)通路使細(xì)胞增殖和遷移速度下降[27]。此外，在腫瘤組織中，由于新生血管管壁僅有1 層內(nèi)皮細(xì)胞，缺乏基底膜，內(nèi)皮細(xì)胞間常有裂隙，同時(shí)VEGF 本身可提高血管通透性，并刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放膠原酶使腫瘤細(xì)胞與腫瘤組織分離脫落，為腫瘤的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件[28]。因此，HIF-1α 納米抗體在黑素瘤組織中可能會(huì)通過抑制血管形成而成為抑制腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展的新材料。

本研究獲得的HIF-1α 納米抗體分子質(zhì)量約為16 ku，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，具有親水性。HIF-1α 納米抗體在構(gòu)建原核表達(dá)載體時(shí)加入了His 標(biāo)簽，將HIF-1α 納米抗體作為Western Blot 和免疫組織化學(xué)技術(shù)中的一抗，與組織細(xì)胞中的HIF-1α 特異性結(jié)合，使用HRP-His-tag 抗體作為二抗，來檢測(cè)HIF-1α在組織中的含量及分布。將自備的HIF-1α 納米抗體作用于B16 細(xì)胞時(shí)，HIF-1α 納米抗體與HIF-1α結(jié)合，直接影響下游靶基因VEGF，并引發(fā)該信號(hào)通路的下調(diào)，抑制B16 細(xì)胞的增殖和遷移，揭示其可能在黑色素瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著較為重要的作用，可作為基因治療黑色素瘤的靶點(diǎn)。