薏米黃酮類物質(zhì)組成差異與功能分析

李祥棟 ，陸秀娟 ，潘 虹 ，魏心元 ，楊小雨 ，石 明

（1.黔西南州農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 興義 562400；2.貴州省薏苡工程技術(shù)研究中心，貴州 興義 562400；3.貴州省亞熱帶作物研究所，貴州 興義 562400）

薏苡為禾本科薏苡屬的1年生或多年生草本植物，其籽粒脫殼之后稱為“薏（苡）仁米”或“薏米”，可入饌、入藥和釀酒，是典型的藥食兼用作物。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，薏米不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)組分而且富含多類生物活性分子，具有抗腫瘤、降血糖、促進(jìn)新陳代謝、抑制腫瘤血管生成及提高免疫力、防止皮膚粗糙和美容等多種藥理作用[1-3]。黃酮類化合物是一類對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和代謝均具有重要作用的次生代謝物，系統(tǒng)分析薏米中黃酮類物質(zhì)的組成及含量差異，對(duì)于薏苡藥理學(xué)和功能分子挖掘利用均具有重要指導(dǎo)意義。薏苡作為狩獵采集性生產(chǎn)向耕作栽培型農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)型時(shí)期的重要作物，在我國(guó)的文化和中醫(yī)藥領(lǐng)域均發(fā)揮了不可或缺的作用。迄今為止，我國(guó)薏苡產(chǎn)業(yè)歷經(jīng)超過10 a 的積累和探索，逐步發(fā)展為極具區(qū)域特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)，主產(chǎn)區(qū)主要分布在黔、滇、桂、閩、浙、臺(tái)等地?；谵曹拥乃幨惩捶A賦，在加工方面薏苡常規(guī)食品（米、面、糕等）、功能食品（薏仁面膜、洗發(fā)乳等）和藥品（抗癌藥物）等研發(fā)產(chǎn)品也不斷涌現(xiàn)。在薏苡藥用開發(fā)方面，除了傳統(tǒng)的中藥飲片和藥方配伍，以薏苡中性油（薏苡酯）為基礎(chǔ)的抗癌藥物康萊特注射液的研發(fā)和應(yīng)用最具代表性，它能夠阻滯腫瘤細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，影響腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)和抗惡病質(zhì)等作用，對(duì)肝癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有極強(qiáng)的殺傷及抑制作用[4]。除了薏苡酯和脂肪酸類，薏苡仁中仍有多種生物活性物質(zhì)，如甾醇、三萜類、多糖類、氨基酸、維生素、黃酮類等。寶宇翔等[5]以河北小黑殼薏米籽粒為研究對(duì)象，采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用方法對(duì)種殼、種皮、帶麩皮的紅薏米、不帶麩皮的白薏米、胚芽5 個(gè)部分的代謝物輪廓檢測(cè)分析，共檢出基礎(chǔ)代謝物質(zhì)60 種，包括氨基酸19 種、糖類8 種、脂肪酸及其甲酯和有機(jī)酸33 種。前期李祥棟等[6]亦采用廣泛靶向代謝組學(xué)分析方法對(duì)4 個(gè)薏米品種萌芽前后的代謝物進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)2 份紅皮薏米品種代謝組輪廓類似聚為一類，而2 份黃皮品種則聚為另一類。黃酮類化合物是植物的重要次生代謝物之一，往往與植物抗逆性、顏色、口感及風(fēng)味的形成等息息相關(guān)。目前，在薏苡仁中只鑒定出了槲皮素、山柰酚和蘆丁3 種黃酮類組分，但在薏苡仁麩皮中發(fā)現(xiàn)多種黃酮單體[7-8]，而且薏苡仁總黃酮具有效清除DPPH 自由基，保護(hù)線粒體免受自由基損傷的生理活性[9]。由于目前對(duì)于薏苡黃酮組分的鑒定還十分有限，而且不同薏米品種間的累積特征也不清楚。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用代謝組學(xué)方法對(duì)薏苡黃酮及相關(guān)功能分子進(jìn)行定量鑒定和功能分析，并比較不同品種間的組分差異，以期為薏苡優(yōu)異種質(zhì)篩選和功能產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為8 份具有代表性的栽培薏苡材料，根據(jù)種仁麩皮的顏色，分為黃皮品種（YC）和紅皮品種（RC）2 種，其中，黃皮類型4 份（安薏1 號(hào)、薏珠1 號(hào)、薏珠2 號(hào)、薏珠4 號(hào)）、紅皮類型4 份（安國(guó)薏苡、日本薏米、薏珠5 號(hào)和冀輻19-41），具體材料信息如表1 所示。8 份薏苡材料于2021年4月在貴州省興義市木賈試驗(yàn)基地按小區(qū)種植，小區(qū)面積30 m2（6 m×5 m），密度4.0 萬(wàn)株/hm2，除草、施肥等田間管理按照統(tǒng)一方式進(jìn)行，成熟期收獲籽粒、曬干和剝殼，挑選籽粒飽滿、完整的糙米以備后續(xù)分析。

表1 薏苡品種信息Tab.1 Information of coix cultivars

1.2 試驗(yàn)方法

利用冷凍抽干機(jī)對(duì)樣本進(jìn)行冷凍干燥，液氮研磨后稱100 mg，分別加入300 mL 體積比為2∶2∶1 的甲醇-乙腈-水溶液和10 μL 內(nèi)標(biāo)Phenylalanine-d5（質(zhì)量濃度10 μg/mL），渦旋振蕩30 s，低溫超聲波輔助萃取30 min，2 次；然后-20 ℃放置1 h 沉淀蛋白，過濾；濾液采用12 000 r/min、4 ℃低溫離心20 min，取上清冷凍干燥。采用超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法對(duì)薏米類黃酮物質(zhì)進(jìn)行代謝組學(xué)定量檢測(cè)，每份樣品重復(fù)4 次。吸取100 μL 標(biāo)品溶液向樣本中加入200 μL 提取液和10 μL 內(nèi)標(biāo)，其余方法按上述樣本制備方法來(lái)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

液相條件采用色譜柱Waters BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×150 mm，流動(dòng)相A 相為超純水（加入0.1%的甲酸），B 相為乙腈（加入0.1%的甲酸）；洗脫梯度為0～3 min B 相5%～20%，3.0～4.3 min B相為20%，4.3～9.0 min B 相為20%～45%，9.0～11.0 min B 相為45%～98%，11.0～13.0 min B 相為98%，13.1～13.5 min B 相維持在5%；流速0.4 mL/min；柱溫4 ℃；進(jìn)樣量2 μL。質(zhì)譜采用6500 QTRAP 質(zhì)譜儀（AB SCIEX）在負(fù)離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。6500 QTRAP ESI 源條件如下：source temperature 500 ℃；ion Source Gas1（Gas1）：40；Ion Source Gas2（Gas2）：40；Curtain gas（CUR）：30；ionSapary Voltage Floating（ISVF）-5 500 V；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)待測(cè)離子對(duì)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用MultQuant 軟件定量分析，采用Excel 2003 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 薏米黃酮類物質(zhì)代謝組輪廓

8 份薏米中共檢測(cè)出17 種黃酮及其衍生物，包括黃酮5 種、異黃酮3 種、黃酮苷5 種和黃烷4 種，其中有11 種在所有樣品中均有檢出。聚類熱圖顯示（圖1），同一品種的不同重復(fù)均聚在一起，說明檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠；除了薏珠2 號(hào)單獨(dú)聚為一支，其余7份薏米品種則聚為2 類，即黃皮品種（YC）和紅皮品種（RC）；相同種皮顏色的薏米樣品整體表現(xiàn)出相似的代謝組輪廓，暗示種皮顏色可能與黃酮類組分差異相關(guān)。

圖1 薏米黃酮類物質(zhì)的代謝組輪廓Fig.1 Metabolome profile of flavonoids in coix seeds

2.2 薏米黃酮及其衍生物的組成特征

由表2 可知，8 份薏米品種的總黃酮含量為192.83～2 214.41 ng/g，平均1 130.62 ng/g，其中冀輻19-41 含量最低，日本薏米含量最高；除了日本薏米外，整體上黃皮品種總黃酮含量高于紅皮品種。異槲皮苷、蘆丁、圣草酚和木樨草素在總黃酮中的占比相對(duì)較高，分別為45.35%、32.77%、6.04% 和5.37%；其余組分占比相對(duì)較低，為0.04%～2.27%（圖2）。因此，異槲皮苷、蘆丁、圣草酚和木樨草素4 種成分為薏米黃酮的主要特征組分，也是薏苡黃酮及其衍生物生理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。再者，紅皮品種日本薏米的4 種特征組分含量也獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，也是薏苡遺傳改良和黃酮物質(zhì)開發(fā)利用的重要資源。

表2 薏米黃酮及其衍生物含量Tab.2 Contents of flavonoids and their derivatives in coix seedsng/g

2.3 不同種皮類型薏米黃酮及其衍生物組成與含量差異

在所有檢出的黃酮及其衍生物分子中，木樨草素、楊梅素和二氫槲皮素3 種成分僅在黃皮品種中存在，在紅皮品種中則基本上未檢出；而黃豆黃苷僅在4 個(gè)紅皮品種中微量存在，含量為2.16～3.09 ng/g，在黃皮品種中則未檢出（表2）。異槲皮苷、槲皮素、鷹嘴豆芽素A、柚皮苷、葛根素、木樨草素、牡荊素/異牡荊素、圣草酚和蘆丁9 種物質(zhì)在黃皮和紅皮品種中均存在顯著差異，與紅皮品種相比，異槲皮苷、木樨草素、槲皮素、牡荊素/異牡荊素、圣草酚、柚皮苷和葛根素7 種成分在黃皮品種中表現(xiàn)為顯著增加，柚皮素成分則表現(xiàn)為顯著減少，柚皮苷、蘆丁、7-O-葡萄糖苷木犀草素含量則在黃皮和紅皮品種中差異不顯著（圖3）。綜上所述，黃皮品種往往具有更高的黃酮類物質(zhì)積累，推測(cè)可能與不同地區(qū)的人為選擇和馴化差異有關(guān)。

圖3 黃皮和紅皮類型薏米的黃酮及其衍生物組成差異Fig.3 Components difference in he flavonoids and their derivatives in yellow and red testa coix seeds

2.4 薏米黃酮類分子的藥理學(xué)功能

根據(jù)上述分析結(jié)果，對(duì)占比最高的4 種成分（異槲皮苷、木樨草素、蘆丁和圣草酚）在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中進(jìn)行檢索。從表3 可以看出，木樨草素和圣草酚的OB 值和DL 值相對(duì)較高（OB≥30，DL≥0.18），說明其口服而被吸收的程度更好，也更具有類藥性。根據(jù)文獻(xiàn)檢索，4 種成分均具有抗氧化、抗炎生理活性，甚至具有抗腫瘤、抗細(xì)菌和病毒、調(diào)節(jié)代謝和神經(jīng)保護(hù)等多重生理功效。

表3 薏米主要黃酮類分子的藥理學(xué)特征Tab.3 Pharmacological characteristics of main flavonoid molecules in coix seeds

3 結(jié)論與討論

薏苡的營(yíng)養(yǎng)和藥用功效是其不可分割的2 個(gè)部分，在蛋白質(zhì)和氨基酸[18]、脂肪酸[19]等主要營(yíng)養(yǎng)組分評(píng)價(jià)方面已有諸多報(bào)道。李祥棟等[20]在前期也對(duì)86 份地方薏苡資源的淀粉、脂肪酸、蛋白質(zhì)和氨基酸進(jìn)行分析并篩選優(yōu)異資源。在薏苡的藥用成分方面，脂肪酸及其酯類、甾醇類、酚和醌類、生物堿類、木質(zhì)素類等多種化合物被鑒定出來(lái)[2]。在藥物開發(fā)方面，則主要以薏苡酯類物質(zhì)（中性油）為主，也發(fā)現(xiàn)了薏苡螺環(huán)烴內(nèi)酰胺A、薏苡螺環(huán)烴內(nèi)酰胺B、薏苡螺環(huán)烴內(nèi)酰胺C、薏苡內(nèi)酰胺、二氧吲哚-3-醋酸甲酯和薏苡素這些具有抗腫瘤功效的活性分子[21-22]。魏艷梅等[23]從薏苡糠殼中分離出15 種化合物，而且發(fā)現(xiàn)香豆酸、2-羥乙基-香豆酸酯、3-羥基-4-甲氧基苯甲酸、1，3，5-三甲基苯和methyl（3-hydroxy-2-oxo-2，3-dihydroindol-3-yl）-acetate 5 種化合物對(duì)種子萌發(fā)具有抑制作用。黃酮類化合物在植物組織中廣泛存在并具有較強(qiáng)的生物活性，而且黃酮類物質(zhì)的合成往往與植物組織器官的品質(zhì)、色澤、生長(zhǎng)發(fā)育、紫外保護(hù)和生物脅迫等生理過程息息相關(guān)。已有研究表明，紅花通過C-葡萄糖基醌查爾酮的合成調(diào)控賦予其白色、黃色、淺紅色和深紅色不同的顏色特征[24]；也有學(xué)者在紅、白、黑、黃不同顏色的藜麥品種中檢測(cè)到了17 個(gè)類黃酮相關(guān)的代謝物并揭示了其合成調(diào)控機(jī)制[25]；另外，對(duì)不同顏色糜子的抗氧化性研究發(fā)現(xiàn)，有色糜子的抗氧化活性均高于白色糜子，而且很可能是酚酸和黃酮物質(zhì)導(dǎo)致其抗氧化活性的差異[26]。本研究也表明，除了日本薏米外，黃皮薏米的總黃酮含量整體上高于紅皮薏米，而且在12 個(gè)黃酮差異代謝物中7 個(gè)顯著增加、1 個(gè)顯著減少；薏米種皮顏色相同的品種整體上表現(xiàn)出相似的代謝組輪廓。除個(gè)別品種外，黃皮品種黃酮物質(zhì)含量比紅皮品種更高，揭示出黃皮品種比大多數(shù)紅皮品種在黃酮種類和含量方面更具優(yōu)勢(shì)，推測(cè)這種品種間黃酮含量差異形成可能與不同地區(qū)的選擇馴化和生物適應(yīng)性相關(guān)。盡管如此，有關(guān)薏苡黃酮和其他生物活性分子的合成機(jī)制仍然知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，異槲皮苷、蘆丁、圣草酚和木樨草素4 種成分為薏米黃酮的主要特征組分，在諸多報(bào)道中均表現(xiàn)出抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗細(xì)菌和病毒、調(diào)節(jié)代謝和神經(jīng)保護(hù)等多種生理活性。因此，通過基因組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)深入解析薏苡包括黃酮在內(nèi)藥用分子的合成代謝機(jī)理并挖掘其藥理學(xué)功能，也是薏苡高值化產(chǎn)品開發(fā)和利用的重要內(nèi)容。