血管生成素1 對大鼠脈絡(luò)膜新生血管的治療作用及其初步機制

徐歡，姚浩，雷武龍，周希瑗

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科/眼科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400010

老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是老年致盲的主要疾病，而脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是AMD 患者發(fā)生不可逆視覺障礙的主要原因[1-5]，且發(fā)病因素較復(fù)雜[6-7]?？寡軆?nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是CNV 治療的主要方式，但有部分患者對抗VEGF 治療應(yīng)答不明顯[8-10]。目前非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、二甲雙胍、激素治療(hormone therapy，HT)及年齡相關(guān)眼病補充劑(age related eye disease supplements，AREDS)等藥物已被證實在AMD的治療中具有一定作用[11-13]。血管生成素(angiopoietin，Ang)在血管形成、重塑、成熟及維持中起重要作用[14-15]，酪氨酸激酶-2(tyrosine kinase-2，Tie-2)/Ang通路調(diào)節(jié)可作為視網(wǎng)膜疾病的治療策略[16]。Ang 是一族分泌型的生長因子，在血管重塑、胚胎血管發(fā)育、血管生成等過程中起著重要作用。有研究證實，Ang2 與VEGF 合作并通過破壞現(xiàn)有血管的穩(wěn)定來啟動血管生成，引發(fā)血管的重新塑型及內(nèi)膜去穩(wěn)定作用[17-18]。而Ang1 在病理性血管生成中起保護作用，使新生血管趨于表現(xiàn)出靜止的成熟血管表型，具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮之間、內(nèi)皮-基質(zhì)之間相互作用的功能；Ang1 還能穩(wěn)定內(nèi)皮細胞(endothelial cells，EC)并促進其生長、抑制其凋亡[19-20]。Ang1作用于血管內(nèi)皮-鈣黏蛋白(VE-cadherin)，其作用是通過rap1或小分子G蛋白rap1進行調(diào)節(jié)的，關(guān)于Ang1在CNV治療過程中的作用機制尚待進一步明確。本研究采用多波長氪激光建立大鼠CNV模型，并通過玻璃體腔注射Ang1來評估Ang1 對CNV 的治療效果，探討Ang1 在CNV治療中的作用機制，旨在為臨床治療CNV提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 30 只6～8 周齡SPF 級挪威(BN)大鼠，體重(180±30) g，雌雄不限，購于重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心，飼養(yǎng)于本校動物中心實驗室。將30 只大鼠隨機分為正常組、模型組、Ang1 治療組，每組10只。實驗過程中對動物的各種處理均遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中有關(guān)動物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 主要試劑與儀器 多波長氪激光儀(美國Lumenis 公 司)，Western blotting 儀(美 國Bio-Rad 公司)，石蠟切片機、倒置顯微鏡、正置顯微鏡(德國Leica公司)。Ang1(中國義翹神州科技有限公司)，蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒、Anti-Rap1 抗體、Anti-小分子G 蛋白Rap1(GAPRap1)抗體、TBS、HRP-羊抗鼠IgG(武漢塞維爾生物科技有限公司)，VE-cadherin 多克隆抗體(蘇州百遠生物公司)，Anti-Ang1(杭州華安生物技術(shù)有限公司)，HRP-羊抗兔IgG(中國武漢博士德生物工程有限公司)，特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(中國大連美侖生物技術(shù)有限公司)，熒光素鈉注射液(美國愛爾康公司)，F(xiàn)ITC 標記葡聚糖(FITC-dextran)(中國西安瑞禧生物科技有限公司)，多聚甲醛(中國蘭杰柯科技有限公司)，大鼠脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞(rat choroid vascular endothelial cells，RCVECs，中國北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司)，LipofectamineTM8000 轉(zhuǎn)染試劑盒(中國碧云天生物技術(shù)有限公司)，GAPRap1-SiRNA 試劑盒(中國擎科生物技術(shù)有限公司)。

1.3 體內(nèi)實驗

1.3.1 大鼠CNV模型建立 30只挪威大鼠中隨機取20 只造模。造模方法：大鼠麻醉后采用復(fù)方托比卡胺眼液散瞳，雙眼用蓋玻片壓平后，找到視盤，以視盤為中心的2PD(視盤直徑)范圍為使用波長532 nm 的氪激光(功率140 mW，直徑100 μm，曝光時間0.07 s)光凝7 個點，以氣泡產(chǎn)生為標志表示Bruch膜破裂，造模成功。

1.3.2 動物分組及處理 造模成功后第1 天，各組大鼠完全麻醉后，在其結(jié)膜囊滴用鹽酸丙美卡因進行眼部表面麻醉，Ang1 治療組大鼠玻璃體腔注射20 μl Ang1(200 μg/L)，模型組在同一時間注射等量生理鹽水，正常組不予任何處理。

1.3.3 FITC-dextran心臟灌注及CNV滲漏面積檢測玻璃體腔注藥后10 d，對各組大鼠進行麻醉，暴露心臟，用生理鹽水注入右心室，將體內(nèi)血液從右心房排凈后，注射4%多聚甲醛溶液固定，再灌注FITC-dextran 溶液，直至大鼠雙唇及四肢出現(xiàn)熒光黃。取下眼球，剔除前節(jié)組織及玻璃體，小心取出視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體進行鋪片。通過熒光滲漏點大小測量CNV滲漏面積。

1.3.4 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)損傷程度 各組玻璃體腔注藥10 d后隨機抽取2只大鼠，取其眼球進行石蠟切片，并選取視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)完整連續(xù)的石蠟切片，放入60 ℃恒溫箱中烤片20 min；使用二甲苯液脫蠟，使用體積分數(shù)75%、95%、100%的乙醇梯度脫水；漂洗后使用蘇木精染色5 min，再次漂洗后使用1%鹽酸乙醇分化10 s，再用氨水返藍15 s；繼續(xù)使用蒸餾水漂洗3次，伊紅染色5 min，蒸餾水漂洗3 次；中性樹脂封片并在顯微鏡下觀察脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)的損傷程度。

1.3.5 Western blotting 檢測組織蛋白表達水平 SDS裂解法提取大鼠眼球視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體及細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，煮沸15 min 后，取20 μg 樣品進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)PVDF 膜，用快速封閉液封閉15 min，加入Rap1、GAPRap1、VE-cadherin及內(nèi)參β-actin一抗(稀釋比例1∶1000) 4 ℃過夜，TBST洗膜3次，加入二抗(稀釋比例1∶5000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，超敏ECL顯色液曝光顯影。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示蛋白相對表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.4 體外實驗

1.4.1 細胞轉(zhuǎn)染與處理 取對數(shù)生長期的RCVECs細胞接種于6 孔板(2×105個/孔)。加入20 μmol/L VEGF后于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細胞融合至70%時按照轉(zhuǎn)染試劑操作說明進行細胞轉(zhuǎn)染，設(shè)置陰性對照組(siRNA-NC 組，轉(zhuǎn)染siRNA-NC)、GAPRap1-siRNA組(轉(zhuǎn)染GAPRap1 siRNA)及GAPRap1-siRNA+Ang1 組(轉(zhuǎn)染GAPRap1 siRNA)，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6 h，吸出培養(yǎng)基，3 組均加入完全培養(yǎng)基，GAPRap1-siRNA+Ang1 組 加 入200 μmol/L 的Ang1 繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h，提取蛋白進行Western blotting 實驗。實驗重復(fù)3次。

1.4.2 細胞免疫熒光染色 將RCVECs 接種于24 孔板(5×104個/孔)的細胞爬片上，按“1.4.1”的方法對細胞進行轉(zhuǎn)染并加藥。培養(yǎng)后對爬片上的細胞用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛溶液固定20 min，山羊血清溶液封閉30 min，VE-cadherin 抗體(1∶200) 4 ℃過夜，山羊抗兔Alexa Fluor R488 染料(1∶400)室溫孵育1 h，DAPI(1 μg/ml)染色核3 min，PBS 清洗3 次，防淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 25.0、Image J 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 脈絡(luò)膜鋪片及各組CNV 滲漏面積 BN 大鼠造模后14 d 眼底熒光素血管造影可見激光斑形成，提示造模成功(圖1)。FITC-dextran心臟灌注結(jié)果顯示，與模型組比較，Ang1治療組大鼠CNV滲漏面積明顯減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

圖1 大鼠造模成功后眼底熒光素血管造影結(jié)果Fig.1 Results of fundus fluorescein angiography after successful modeling in rats

圖2 模型組與Ang1治療組大鼠脈絡(luò)膜鋪片及CNV滲漏面積(n=12)Fig.2 Choroidal patches and the area of choroidal neovascular leakage in rats of model group and Ang1 treatment group (n=12)

2.2 組織切片HE 染色結(jié)果 正常組大鼠視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)完整、清晰；模型組大鼠視網(wǎng)膜、Bruch膜及RPE 層結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)、外核層處可見組織構(gòu)造不連續(xù)，并可見異常增生的細胞突破脈絡(luò)膜血管網(wǎng)基底膜。Ang1治療組大鼠視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜損傷面積及程度較模型組明顯減小(圖3)。

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)損傷程度觀察(HE ×400)Fig.3 Structural damage degree of retina and choroid of rats in each group (HE ×400)

2.3 大鼠視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜中Ang1、Rap1、GAPRap1、VE-cadherin 蛋白的表達 Ang1治療組Ang1蛋白表達水平高于其他兩組(P<0.05)；3組Rap1蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與正常組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜中GAPRap1、VE-cadherin 蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，Ang1 治療組大鼠視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜中GAPRap1、VE-cadherin 蛋白表達水平明顯增高(P<0.05，圖4)。

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜組織中Rap1、GAPRap1、VE-cadherin、Ang1蛋白表達比較(n=3)Fig.4 Expression levels of Rap1, GAPRap1, VE-cadherin and Ang1 proteins in retina and choroidal tissues of rats in each group (n=3)

2.4 RCVECs 細胞中GAPRap1、VE-cadherin 蛋白的表達 在沉默GAPRap1后，GAPRap1-siRNA+Ang1組的GAPRap1、 VE-cadherin 蛋白表達較GAPRap1-siRNA 組明顯增加(P<0.01)，但3 組Rap1 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖5)。

圖5 各組干擾GAPRap1后大鼠RCVECs細胞中Rap1、GAPRap1、VE-cadherin蛋白表達比較 (n=3)Fig.5 Expression of Rap1, GAPRap1 and VE-cadherin in RCVECs of rats after GAPRap1 interference in each group (n=3)

2.5 轉(zhuǎn)染細胞后免疫熒光檢測 免疫熒光檢測結(jié)果顯示，在GAPRap1干擾后，GAPRap1-siRNA+Ang1組的VE-cadherin 蛋白熒光強度較GAPRap1-siRNA 組明顯增加(P<0.01，圖6)。

圖6 各組大鼠RCVECs細胞VE-cadherin免疫熒光檢測(×200, n=3)Fig.6 Detection of VE-cadherin fluorescence in RCVECs of rats in each group (×200, n=3)

3 討 論

CNV 是濕性老年性黃斑病變(wet age-related macular degeneration，wAMD)晚期最嚴重的癥狀之一，如不及時治療還會不斷加重，給視力造成不可逆的損害[2,6]。目前CNV 的治療方法主要是抗VEGF治療，但臨床上發(fā)現(xiàn)有部分患者抗VEGF治療無效，很多眼科專家也在研究新的藥物或治療靶點，目前也有一些公司在研究雙抗藥物，可以雙途徑阻斷CNV 的發(fā)生發(fā)展，但仍沒有具體的藥物應(yīng)用于臨床[21]。Ang1可通過穩(wěn)定血管內(nèi)皮細胞而減少血管滲漏，促進未成熟血管成熟[22-23]。此外，Ang1 還可通過吸引血管周細胞及內(nèi)皮平滑肌細胞聚集并相互作用，增強血管內(nèi)皮細胞間連接，從而有利于維持血管壁完整，具有穩(wěn)定血管、防止血管滲漏的作用[24]，與本研究結(jié)果一致。本研究采用激光建立CNV模型成功后，玻璃體腔注射Ang1后脈絡(luò)膜鋪片可見脈絡(luò)膜血管滲漏較模型組減少，HE染色可見模型組大鼠視網(wǎng)膜、Bruch膜及RPE層結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)、外核層處可見組織構(gòu)造不連續(xù)，并可見異常增生的細胞突破脈絡(luò)膜血管網(wǎng)基底膜，Ang1治療組大鼠視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜損傷面積及程度較模型組明顯減小。

體外研究證實，GAPRap1 活性受鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)與GTPase 激活蛋白(GTPase activating protein，GAPs)的時空調(diào)節(jié)，且是多種細胞(包括內(nèi)皮細胞)中細胞-基質(zhì)及細胞-細胞黏附的重要調(diào)節(jié)劑[25-26]。在內(nèi)皮細胞中，GTP結(jié)合的Rap1可通過微調(diào)血管通透性來調(diào)節(jié)血管生成與內(nèi)皮屏障[27-28]。Rap1 在Ang1 刺激后被激活，且是Ang1對單層內(nèi)皮細胞發(fā)揮抗?jié)B透作用所必需的。在CNV的治療中，已有實驗證實活化的Rap1(GAPRap1)在CNV 中的表達明顯降低，而Rap1 的表達無明顯變化[29-30]。基于過去的研究，本實驗主要研究在Ang1 治療CNV 的過程中GAPRap1 是否作為下游因子調(diào)控VE-cadherin的表達。Western blotting檢測結(jié)果證實，Ang1 治療組大鼠脈絡(luò)膜組織中GAPRap1、VE-cadherin 的表達較模型組明顯增加。細胞實驗證實Ang1 可在rap1GTP 結(jié)合狀態(tài)下激活Rap1，從而誘導(dǎo)血-視網(wǎng)膜屏障信號通路的激活，表明GAPRap1(一種抑制Rap1活性的GTPase激活蛋白)的過度表達阻斷了內(nèi)皮細胞的血管生成發(fā)芽及成管活性[25,31]。本實驗證實，在Ang1 治療CNV 的過程中，GAPRap1 與VE-cadherin 對于調(diào)節(jié)黏附連接組裝及內(nèi)皮通透性的動力學(xué)至關(guān)重要，且Ang1刺激在血管生成發(fā)芽期間誘導(dǎo)這兩種蛋白質(zhì)之間的合作，揭示了GAPRap1 在Ang1 抑制大鼠CNV 生成及滲漏中的作用。

綜上所述，Ang1 對大鼠CNV 的滲漏有抑制作用，其作用機制可能是Ang1 激活下游因子Rap1，GAPRap1 促進大鼠CNV 中VE-cadherin 的生成，使血管黏附緊密，從而減少血管滲漏，抑制新生血管的繼續(xù)生長。但是對于激活GAP 后，下游是否存在其他蛋白因子改變還需進一步研究。