口腔鱗狀細胞癌組織中miR-138、FOXD1 表達與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

梁偉騰，王麗娟，劉凡琪，李玲玲，咸鈞，牟戎

1 天津市第四中心醫(yī)院口腔科，天津 300140；2 保定市第一中心醫(yī)院口腔科；3 吉林市中心醫(yī)院口腔科；4 天津市第四中心醫(yī)院麻醉科

口腔癌是最常見的口腔頜面部惡性腫瘤之一，據(jù)報道，2022 年中國口腔癌新發(fā)31 733 例，死亡15 745 例［1］?？谇击[狀細胞癌（OSCC）占所有口腔癌的90%以上，目前手術(shù)仍是主要治療方法，但受限于OSCC 的高轉(zhuǎn)移傾向，5 年生存率較低［2］。研究表明，微小核糖核酸（miRNA）能通過調(diào)控多種機制參與OSCC 發(fā)生發(fā)展［3］。miR-138 是一種高度保守的miRNA，miR-138 參與食管鱗癌、膀胱癌等惡性腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲［4-5］。研究報道，miR-138與非肌層浸潤性膀胱癌患者預(yù)后有關(guān)［6］。叉頭框蛋白（FOX）D1 是一種轉(zhuǎn)錄因子，能通過調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄參與惡性腫瘤進程［7］，F(xiàn)OXD1 在OSCC 組織中異常高表達［8］。2014年3月—2023年3月，我們探討了OSCC 組織中miR-138、FOXD1 表達及與患者病理特征和預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014 年3 月—2018 年3 月于天津市第四中心醫(yī)院行手術(shù)切除的80例OSCC患者癌組織和對應(yīng)癌旁正常組織（距離癌組織＞3 cm）?；颊吣?2 例、女28 例，年齡≥60 歲56 例、＜60 歲24例；腫瘤最大徑：≥3 cm 43 例、＜3 cm 37 例；分化程度：低分化36 例、中高分化44 例；TNM 分期［9］：Ⅰ～Ⅱ期53 例、Ⅲ期27 例；浸潤深度≥5 cm 29 例、＜5 cm 51 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22 例。納入標準：①患者或家屬書面知情同意；②年齡≥18 歲；③經(jīng)病理檢查確診為OSCC。排除標準：①非首次確診，在入院前接受相關(guān)治療；②合并其他部位惡性腫瘤；③資料不完整；④合并血液、免疫系統(tǒng)損害；⑤精神疾病患者。電話或門診方式對OSCC 患者隨訪5 年（第1 年每3 個月1 次，后每6 個月1 次），隨訪至患者死亡或終點時間2023 年3 月，統(tǒng)計5 年總生存率。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（倫理批號：IRM-DWLL-2019139）。

1.2 癌及癌旁正常組織中miR-138、FOXD1檢測 將癌組織和癌旁正常組織剪碎后，加入TRIzol溶液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，編號：R0016）振蕩混勻提取總RNA，分光光度計測定純度和濃度合格后，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，編號：RR014B］反轉(zhuǎn)錄為cRNA。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，編號：D0033）進行擴增。反應(yīng)總體積：cDNA 1 μL、正反向引物各2.5 μL、2×Hieff?Robust PCR Master Mix 10 μL、ddH2O 加至總體積25 μL；循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 3 min 1 次，94 ℃ 10 s、55 ℃20 s、72 ℃ 30 s循環(huán)35次。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計和合成，miR-138 正向引物：5'-GCGAGCTGGTGTTGTGAATC-3'，反向引物：5'-AGTGCAGGGTCCGAGCTATTF-3'；FOXD1 mRNA正向引物：5'-CCTGTCCAGTGTCGAGAACT-3'，反向引物：5'-AAATAGAGGGACCCGCAGAGF-3'；U6正向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCCTCTCAT-3'，反向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAF-3'；GAPDH正向引物：5'-AATCCCATCACCATCTTCC-3'，反向引物：5'-CATCACGCCACAGTTTCC-3'。程序完成后繪制熔解曲線，miR-138以U6為內(nèi)參，F(xiàn)OXD1以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計算組織中miR-138、FOXD1 mRNA相對表達量。通過TargetScan 網(wǎng)站預(yù)測miR-138 與FOXD1的結(jié)合位點。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以±s表示，組間比較采用配對或獨立t檢驗；OSCC 組織中miR-138 與FOXD1 mRNA 表達的相關(guān)性使用Pearson 相關(guān)性分析；不同miR-138、FOXD1 mRNA 表達OSCC 患者生存曲線采用Kaplan-Meier 法繪制，組間生存率比較采用Log-rank 檢驗；OSCC 患者預(yù)后的影響因素使用多因素Cox回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 OSCC組織與癌旁正常組織中miR-138、FOXD1mRNA表達比較 OSCC組織、癌旁正常組織中miR-138 相對表達量分別為0.78 ± 0.24、1.23 ± 0.26，F(xiàn)OXD1 mRNA相對表達量分別為2.18 ± 0.40、1.47 ±0.37，OSCC組織中miR-138表達低于癌旁正常組織，F(xiàn)OXD1 mRNA表達高于癌旁正常組織（P均＜0.05）。

OSCC 是一系列基因組和表觀遺傳改變導(dǎo)致的結(jié)果［14］。miRNA 是一類新型的表觀遺傳改變調(diào)控分子，能通過與靶基因完全或不完全互補調(diào)控基因表達，進而參與OSCC 發(fā)生發(fā)展［15］。miR-138 是定位于人染色體3p21.32 上的一個miRNA，既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-138 能作為免疫功能調(diào)節(jié)基因維持機體免疫功能，進而參與心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等過程［16］。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-138 還參與腫瘤過程，如miR-138能靶向下調(diào)Sp1轉(zhuǎn)錄因子/富含亮氨酸重復(fù)序列G 蛋白偶聯(lián)受體5 促進結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲［17］；miR-138 能靶向下調(diào)表皮生長因子受體促進膽囊癌細胞增殖、凋亡和遷移［18］。已有實驗報道，miR-138 在OSCC 中呈低表達，上調(diào)miR-138有助于OSCC 惡性進展抑制［19］。有研究指出，miR-138 低表達與乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良有關(guān)［20］。本研究結(jié)果顯示，OSCC 組織中miR-138低表達，與分化程度、TNM 分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-138 表達降低參與OSCC 發(fā)生發(fā)展。分析原因可能是miR-138 表達降低激活了Zeste 增強子同源物2，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，OSCC 細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力增強，導(dǎo)致OSCC 惡性進展［19］。同時miR-138 表達降低會導(dǎo)致γδT 細胞介導(dǎo)的免疫殺傷作用降低，促進OSCC 逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視而持續(xù)生長［21］。

就一頓飯光陰，梅先生以他雷厲風行、篤定爽朗的工作作風，磅礴天地的與我開始了他怎樣從那個天高皇帝遠的小鎮(zhèn)，懷揣著“要當科學家”的理想、行積跬步至翱翔于祖國計算機事業(yè)之天上人間的。

圖1 miR-138與FOXD1的結(jié)合位點

OSCC 指起源于唇黏膜、硬腭黏膜、口底黏膜、舌體黏膜（界溝前2/3）、磨牙后三角區(qū)黏膜、牙齦黏膜和頰黏膜等口腔黏膜上皮，并伴有鱗狀分化的惡性腫瘤，發(fā)病可能與吸煙、飲酒、人乳頭瘤病毒感染、咀嚼檳榔、環(huán)境、飲食習慣等有關(guān)［10］。手術(shù)是早期OSCC 的有效治療方法，但臨床超過60%的OSCC患者初診時即處于晚期；另有10%～40%的OSCC患者伴有隱匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)治療機會或手術(shù)治療效果欠佳［11］。雖有部分分子靶向藥物、免疫檢查點抑制劑被用于OSCC治療，但受限于其高異質(zhì)性和侵襲性，患者預(yù)后仍較差［12-13］。

表1 不同臨床病理特征OSCC患者癌組織中miR-138、FOXD1 mRNA表達比較

張愛玲在散文《談跳舞》中說：“我喜歡反高潮，——艷異空氣的制造與突然跌落，可以覺得傳奇里的人性呱呱啼叫起來?！币源擞^照其創(chuàng)作實踐，她在敘事中較少采用因果分明的邏輯安排,每當情節(jié)即將接近高潮時,總是克制地宕開一筆，以別具慧心的隱喻和象征暗示故事情節(jié)的突變和人物命運的陡轉(zhuǎn)。就這樣，以非常規(guī)、非邏輯、非線性的方式，在看似應(yīng)當出現(xiàn)高潮的地方不出現(xiàn)這種高潮，在看似應(yīng)當出現(xiàn)某一種結(jié)局的地方不出現(xiàn)這種結(jié)局，使敘事更加具有吸引力和表現(xiàn)力，從而達到表現(xiàn)生活本質(zhì)和剖析真實人性的目的，同時也造成在驚奇之余又能悟到這是意料之外、情理之中的必然的表達效果。

圖2 不同miR-138、FOXD1 mRNA表達OSCC患者Kaplan-Meier生存曲線

猶如突然被五百萬砸中，她的第一反應(yīng)不是高興，而是被砸蒙了，懷疑是假的。顏曉晨愣愣地看著沈侯，遲遲不說話，讓沈侯很不耐煩，“到底同意不同意？痛快一點！”

表3 OSCC患者預(yù)后的單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

2.3 OSCC組織中miR-138、FOXD1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 不同分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移OSCC組織中miR-138、FOXD1 mRNA表達比較差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），不同性別、年齡、腫瘤直徑OSCC組織中miR-138、FOXD1 mRNA表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表1。

2.4 miR-138、FOXD1 mRNA不同表達OSCC患者總生存率比較 80例OSCC患者隨訪5年，失訪4例，死亡36例，5年總生存率為55.00%（44/80）。miR-138高表達者（≥0.78）41例，F(xiàn)OXD1 mRNA高表達者（≥2.18）36例。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，miR-138高表達者、低表達者總生存率分別為65.85%（27/41）、43.59%（17/39），二者比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.911，P＜0.05）；FOXD1 mRNA高表達者、低表達者總生存率分別為66.67%（24/36）、45.45%（20/44），二者比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.569，P＜0.05），見圖2。

2.2 OSCC 組織中miR-138 與FOXD1 mRNA 表達的相關(guān)性 經(jīng)TargetScan 網(wǎng)站（www.targetscan.org）預(yù)測，miR-138 與FOXD1 的3'非翻譯端2942～2948處存在結(jié)合位點（圖1）。Pearson 相關(guān)性分析顯示，OSCC 組織中miR-138 與FOXD1 mRNA 表達呈負相關(guān)（r=-0.621，P＜0.05）。

2.5 OSCC 患者預(yù)后的單因素和多因素Cox 回歸分析結(jié)果 排除4 例失訪患者，以性別、年齡、腫瘤最大徑、分化程度、TNM 分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-138、FOXD1 mRNA 為自變量，隨訪時間為時間變量，生存狀態(tài)（死亡/存活=1/0）為因變量，建立多因素Cox 回歸模型。結(jié)果顯示，低分化、TNM 分期Ⅲ期、浸潤深度≥5 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FOXD1 mRNA≥2.18 為OSCC 患者死亡的獨立危險因素，miR-138≥0.78 為獨立保護因素（P均＜0.05）。見表3。

FOX 是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，參與代謝、胚胎發(fā)育、組織分化、免疫調(diào)節(jié)等多個生命過程，其家族成員異常表達在惡性腫瘤進展過程中發(fā)揮抑癌或促癌作用［6］。FOXD1 定位于人染色體5q13.2，能激活脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號通路，進而促進胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲［22］；沉默F(xiàn)OXD1 能抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路激活，進而抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲［23］。有研究報道，F(xiàn)OXD1在OSCC 組織中差異表達［24］。本研究結(jié)果顯示，OSCC 組織中FOXD1 mRNA 高表達，與分化程度、TNM分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示FOXD1 mRNA 表達升高參與OSCC 發(fā)生發(fā)展。分析原因可能是FOXD1表達升高能激活鋅指轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)OSCC 細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強OSCC 細胞遷移與侵襲能力，進而促進OSCC惡性進展［24］。

5.強化寬帶保障。加強信息基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)，持續(xù)推進寬帶中國戰(zhàn)略，實施重慶全光網(wǎng)絡(luò)城市建設(shè)，促進網(wǎng)絡(luò)提速降費，為商貿(mào)流通業(yè)線上線下互動創(chuàng)新發(fā)展提供網(wǎng)絡(luò)支撐。切實加強區(qū)縣農(nóng)村地區(qū)信息基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)，大力推進“寬帶鄉(xiāng)村”“行政村通光纖”工程，加快實現(xiàn)行政村通光纖全覆蓋，探索5G網(wǎng)絡(luò)有效覆蓋由場鎮(zhèn)區(qū)域向鄉(xiāng)村拓展，提升農(nóng)村地區(qū)網(wǎng)絡(luò)通信發(fā)展水平。

本研究通過在線網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-138 與FOXD1 存在堿基互補關(guān)系，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miR-138 與FOXD1 mRNA 在OSCC 組織中表達呈負相關(guān)，提示miR-138 與FOXD1 可能共同參與OSCC 發(fā)生發(fā)展。劉東等［25］實驗證實，上調(diào)miR-138 能靶向下調(diào)FOXD1表達，進而抑制OSCC細胞增殖和侵襲。本研究通過隨訪發(fā)現(xiàn)，miR-138 高表達和FOXD1 mRNA 低表達OSCC 患者5 年總生存率升高，且FOXD1 mRNA≥2.18 為OSCC 患者死亡的獨立危險因素，miR-138≥0.78 為獨立保護因素。說明OSCC組織中miR-138、FOXD1 mRNA 表達與患者預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，OSCC 組織中miR-138 表達降低，F(xiàn)OXD1 mRNA 表達升高，與分化程度、TNM 分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)，二者可能成為OSCC患者預(yù)后標志物。