中華獼猴桃花藥組織培養(yǎng)及植株再生

劉 磊，李 薇，李爭(zhēng)艷，雷 華，宋正江，蘇彩晴，高本旺

（三峽植物園管理處，湖北 宜昌 443000）

獼猴桃隸屬于獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia），包含54 個(gè)種和21 個(gè)變種，共約75 個(gè)分類(lèi)單元［1］。我國(guó)蘊(yùn)含著豐富的獼猴桃野生資源，除尼泊爾獼猴桃（A. strigosaHook. f. & Thomson，尼泊爾）和白背葉獼猴桃（A. hypoleucaNakai，日本）為周邊國(guó)家特有分布外，其余獼猴桃在我國(guó)均有分布。獼猴桃作為一種重要的經(jīng)濟(jì)果樹(shù)，其栽培馴化史僅100 余年，其中中華獼猴桃和美味獼猴桃被廣泛種植。依托豐富的野生種質(zhì)資源，我國(guó)科研人員開(kāi)展直接選優(yōu)、實(shí)生選種、雜交育種、化學(xué)誘變，直至現(xiàn)在的分子標(biāo)記輔助、轉(zhuǎn)基因和基因編輯定向育種等多種育種技術(shù)，在果實(shí)顏色上逐漸形成了獼猴桃市場(chǎng)的綠肉、黃肉、紅肉以及即食型軟棗獼猴桃的多樣化格局［2］。

獼猴桃為多年生、功能性雌雄異株植物［3］，該屬植物具有重疊分布區(qū)域，并普遍存在天然雜交和基因漸滲現(xiàn)象［4］。在自然狀態(tài)下，獼猴桃屬植物有二倍體、四倍體、六倍體和八倍體及少量的三倍體、五倍體和非整倍體等多種倍性，且在種間及種內(nèi)呈網(wǎng)狀分布格局［5］。自然界頻繁的種間雜交和種內(nèi)連續(xù)的倍性變異，意味著在獼猴桃屬植物分布區(qū)內(nèi)存在自然雜交帶，形成網(wǎng)狀進(jìn)化格局［6］。因此，像獼猴桃這樣雌雄異株、遺傳背景復(fù)雜的植物，雜交育種耗時(shí)費(fèi)力，育種周期長(zhǎng)，很難獲得純合系。而基于野生資源直接選育栽培品種具有很大的盲目性和偶然性。

單倍體和雙單倍體技術(shù)的應(yīng)用，可以顯著縮短育種周期，一步獲得100%純合系。同時(shí)，因單倍體植株遺傳背景單一，便于基因組測(cè)序拼接和基因功能驗(yàn)證。單倍體可以自然發(fā)生，但頻率很低，需要人工誘導(dǎo)來(lái)滿(mǎn)足植物育種的需求。通過(guò)發(fā)育不成熟的子房、花藥或者分離小孢子體外培養(yǎng)的方法可以獲得單倍體或雙單倍體再生植株［7-8］。研究人員通過(guò)未受精的子房培養(yǎng)獲得補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia）［9］、三花龍膽（Gentiana triflora）［10］等植物的單倍體和雙單倍體植株，通過(guò)離體小孢子培養(yǎng)獲得苜蓿（Medicago sativaL.）［11］、硬質(zhì)小麥（Triticum turgi-dumL.）［12］單倍體和雙單倍體植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)獲得單倍體植株是一種常用的方法，在非洲堇屬（Saintpaulia）［13］、麻風(fēng)樹(shù)（Jatropha curcasL.）［14］、紅掌（Anthurium andraeanum）［15］等植物中均有應(yīng)用。

目前獼猴桃花藥培養(yǎng)報(bào)道較少。最早始于20世紀(jì)80 年代，只獲得體細(xì)胞胚，沒(méi)有實(shí)現(xiàn)小孢子胚胎發(fā)生［16-17］。2018年在軟棗獼猴桃花藥培養(yǎng)中才真正意義上成功獲得單倍體植株［18］，但基于中華獼猴桃和美味獼猴桃花藥培養(yǎng)獲得單倍體或雙單倍體植株的研究尚未報(bào)道。本文以二倍體中華獼猴桃栽培品種‘桂海4 號(hào)’雄株花藥為實(shí)驗(yàn)材料，擬通過(guò)處于單核期花藥培養(yǎng)獲得獼猴桃單倍體或雙單倍體再生植株。

1 材料與方法

1.1 材料

以三峽植物園管理處獼猴桃種質(zhì)資源圃?xún)?nèi)中華獼猴桃授粉品種‘桂海4 號(hào)’花藥為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)花蕾形態(tài)與花粉發(fā)育時(shí)期關(guān)系［19］，采集小孢子發(fā)育處于單核期、健壯、無(wú)病蟲(chóng)害花蕾，于4℃冰箱黑暗冷藏5天。

1.2 外植體處理及消毒

將花蕾依次用自來(lái)水沖洗30 min，75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3 次 ，0.1% HgCl2浸泡7 min，無(wú)菌水沖洗3次，備用。

1.3 愈傷組織誘導(dǎo)

在無(wú)菌條件下，去除花萼及花瓣，取出完整花藥，接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)愈傷組織的基本培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基，添加2，4-D（濃度為0 mg/L，1 mg/L，2 mg/L）、5 mg/L 6-BA、30 g/L蔗糖、6 g/L 瓊脂以及0.1 g/L PVP（聚乙烯吡咯烷酮），PH 5.8。每瓶接種約30 個(gè)花藥，每個(gè)處理接種2瓶，重復(fù)3次。置于25 ± 2℃的培養(yǎng)室，黑暗條件下培養(yǎng)15 天，后在光照強(qiáng)度2 000 ~ 3 000 Lx、光周期為16 h 光照/8 h 黑暗條件下培養(yǎng)。接種30 天后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率 = （誘導(dǎo)出愈傷組織的花藥/各處理接種的花藥總數(shù)） × 100%。

1.4 體細(xì)胞胚誘導(dǎo)、繼代及植株再生

將愈傷組織轉(zhuǎn)接到體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加0.05 mg/L NAA，或0.05 mg/L 2，4-D，或不同濃度的IBA 和6-BA，或同愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)接至上述培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞胚增殖率，即（增殖的體細(xì)胞胚數(shù)/接種的體細(xì)胞胚總數(shù)）× 100%。挑選發(fā)育成熟的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)接至再生培養(yǎng)基進(jìn)行體細(xì)胞胚萌發(fā)，植株再生培養(yǎng)基為培養(yǎng)條件為光強(qiáng)2 000 ~ 3 000 Lx，光周期為16 h光照/8 h黑暗，4~5 周后，統(tǒng)計(jì)成苗數(shù)量，計(jì)算再生率 = （叢生芽數(shù)量/接入胚體數(shù)量） × 100%。

1.5 生根培養(yǎng)

待幼苗長(zhǎng)出2~3片真葉，苗高2~3 cm，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基見(jiàn)表4，培養(yǎng)條件同植株再生培養(yǎng)時(shí)。

1.6 倍性檢測(cè)

取再生植株幼嫩葉片，以‘桂海4號(hào)’雄株的幼嫩葉片為對(duì)照，由中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所利用Gytoflexs 流式細(xì)胞儀（Beckman，美國(guó)）進(jìn)行倍性測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 2，4-D濃度對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將花藥均勻接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（表1），花藥在M2 和M3 號(hào)培養(yǎng)基上逐漸由黃色變?yōu)楹稚?，花藥開(kāi)始膨大，接種30 天后，可以觀察到愈傷組織從花藥一端或開(kāi)裂的花藥中長(zhǎng)出。需要注意的是要保持花藥的完整性，帶有花絲的花藥極易由花絲形成愈傷組織，破損花藥極易由花藥壁形成愈傷組織。而M1 號(hào)培養(yǎng)基上的花藥隨著接種時(shí)間的推移，花藥褐化枯萎不能形成愈傷組織，說(shuō)明2，4-D 在中華獼猴桃花藥培養(yǎng)中具有促進(jìn)愈傷組織誘導(dǎo)的作用。當(dāng)2，4-D濃度為1 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率為58.48%，當(dāng)2，4-D濃度為2 mg/L 時(shí)誘導(dǎo)率為51.50%，但兩個(gè)處理之間差異不顯著，愈傷組織均為淡黃色、結(jié)構(gòu)致密（圖1 A）。

圖1 中華獼猴桃花藥培養(yǎng)獲得再生植株過(guò)程Fig.1 Anther culture and plantlet regeneration of A. chinensis

表1 2，4-D濃度對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.1 Effects of 2，4-D concentrations on anther callus induction

2.2 體細(xì)胞胚誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)及植株再生

將上述愈傷組織轉(zhuǎn)接至表2 中1~14 號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)60 天。觀察發(fā)現(xiàn)添加2，4-D 的2 號(hào)和7~10 號(hào)培養(yǎng)基中的愈傷組織均為非胚性愈傷組織，為白色松散狀，而其它編號(hào)培養(yǎng)基均可產(chǎn)生體細(xì)胞胚，可見(jiàn)綠色或黃綠色新生組織（圖1 B），在解剖鏡下可觀察到球形胚、心形胚、魚(yú)雷胚（圖1 D-F），說(shuō)明2，4-D 不利于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)。體細(xì)胞胚繼代至1 號(hào)、3~6 號(hào)和11~14 號(hào)培養(yǎng)基上，約20 天肉眼可觀察到綠色或黃綠色增殖。35 天后統(tǒng)計(jì)體細(xì)胞胚的增殖情況，其中1 號(hào)、3 號(hào)和6 號(hào)培養(yǎng)基中的體細(xì)胞胚均褐化，4 號(hào)、11 號(hào)和14 號(hào)培養(yǎng)基中的體細(xì)胞胚褐化較多或部分褐化，且有分化現(xiàn)象，5 號(hào)、12 號(hào)和13 號(hào)培養(yǎng)基中的體細(xì)胞胚褐化較少或部分褐化、無(wú)分化現(xiàn)象且增殖率較高，增殖率分別為46.70%、53.30%和46.70%?？傮w看，12號(hào)培養(yǎng)基作為體細(xì)胞胚繼代培養(yǎng)基效果最佳。

表2 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)及增殖Tab.2 Induction and proliferation of somatic embryos

將上述體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)接至植株再生培養(yǎng)基（表3），20天后觀察到除D11號(hào)培養(yǎng)基外，其它培養(yǎng)基均可觀察到已分化的綠色芽點(diǎn)或叢生芽（圖1 C）。35 天后統(tǒng)計(jì)再生率，再生率的范圍為6.7%~40.0%，D10 號(hào)培養(yǎng)基的再生率最低，為6.7%，D7 號(hào)培養(yǎng)基的再生率最高，為40.0%。

表3 不同激素組合對(duì)植株再生的影響Tab.3 Effects of different hormone combinations on plant regeneration

表4 IBA濃度對(duì)生根的影響Tab.4 Effects of IBA concentrations on rooting

2.3 生根培養(yǎng)

待再生植株長(zhǎng)出2~3 片真葉，苗高2~3 cm，，轉(zhuǎn)接至R1~R3 生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)添加0.5 mg/L IBA 的R2 培養(yǎng)基的生根效果最佳，生根數(shù)量多且粗壯，R1 和R3 生根培養(yǎng)基生根情況較差，根的數(shù)量少且細(xì)弱，并且R3 培養(yǎng)基中再生植株的易形成愈傷組織（圖1 G-I）。

2.4 倍性檢測(cè)

通過(guò)中華獼猴桃花藥培養(yǎng)獲得再生植株51株，以供體‘桂海4 號(hào)’雄株為對(duì)照，利用流式細(xì)胞儀測(cè)定其倍性?！鸷? 號(hào)’的均值為14 687.6，根據(jù)待測(cè)樣本均值與對(duì)照樣均值的比值判斷再生植株的倍性，若比值約等于0.5 則為單倍體，若比值約等于1則為二倍體，若比值約等于1.5 則為三倍體，若比值約等于2則為四倍體，以此類(lèi)推。結(jié)果顯示，參試的51 株再生植株中有單倍體2 株，占比3.92%，雙倍體32株，占比62.75%，三倍體10株，占比19.61%，四倍體6 株，占比11.76%，五倍體1 株，占比1.96%，如圖2。

圖2 再生植株倍性鑒定Fig.2 Identification of ploidy of regenerated plants

3 討論

單倍體和雙單倍體技術(shù)可以一步獲得100%純合系，有效縮短育種周期，花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株是一種常用的方法。

在植物花藥培養(yǎng)中，植物生長(zhǎng)素種類(lèi)及濃度將決定小孢子發(fā)育途徑，如2，4-D 可以誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生，而IAA和NAA可以促進(jìn)胚胎直接發(fā)生［20-21］，并且2，4-D在花藥培養(yǎng)中的作用具有階段性。本研究在獲得愈傷組織過(guò)程中2，4-D 起著重要促進(jìn)作用，而在由愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚中則不利于體細(xì)胞胚的產(chǎn)生。李艷敏等［22］在芍藥花藥培養(yǎng)中同樣經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的途徑進(jìn)行植株再生，僅在愈傷組織誘導(dǎo)階段添加不同濃度2，4-D，在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)和成苗培養(yǎng)基中均未添加。2，4-D在軟棗獼猴桃花藥培養(yǎng)中同樣發(fā)揮重要作用，添加2，4-D的愈傷組織誘導(dǎo)率基本在50%以上，明顯高于其它激素組合［18］，本文中添加2，4-D 的愈傷組織誘導(dǎo)率也達(dá)到50%以上，未添加的則不能形成愈傷組織。此外，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)花藥絲或破損的花藥壁更容易誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞愈傷組織，Reinert［23］同樣認(rèn)為在花藥培養(yǎng)中要保證花藥的完整性，否則會(huì)刺激花藥壁形成體細(xì)胞愈傷組織。

體細(xì)胞胚胎的發(fā)育過(guò)程與合子胚的發(fā)育過(guò)程相似，均有球形胚、心形胚、魚(yú)雷胚、子葉胚和成熟胚歷程。本研究中愈傷組織經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織，在體視鏡下能夠觀察到球形胚、心形胚和魚(yú)雷胚，其后在不同的分化培養(yǎng)基中的分化率為6.7%~40.0%，添加0.05 mg/L IBA 和3 mg/L ZT 的分化率最佳，為40.0%。王廣富等［18］在軟棗獼猴桃花藥愈傷組織培養(yǎng)中，添0.1 mg/L IBA 和3 mg/L ZT 的分化率最佳，為64.55%。此外，本文發(fā)現(xiàn)在胚性愈傷組織繼代過(guò)程中存在分化能力下降現(xiàn)象。肖望等［24］研究發(fā)現(xiàn)隨著繼代時(shí)間的延長(zhǎng)，貢蕉胚性懸浮細(xì)胞的體胚能力下降， 含有正常二倍體染色體數(shù)目的細(xì)胞數(shù)目減少，二者具有一定的相關(guān)性，但需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。許智宏［25］認(rèn)為長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)的愈傷組織分化能力下降以致喪失，其原因可能與繼代培養(yǎng)中形成大量多倍體及非整倍體細(xì)胞有關(guān)。本文中繼代胚性愈傷組織的分化能力與繼代時(shí)間的關(guān)系以及分化能力下降程度未做深入研究，今后將開(kāi)展這方面的工作。

花藥離體培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)范疇，花藥除了包含小孢子外還含有體細(xì)胞組織（ 花藥壁、藥隔、花絲） ，如何有效抑制體細(xì)胞的生長(zhǎng)而不影響小孢子的雄核發(fā)育是得到林木單倍體植株的關(guān)鍵［26］。此外，單倍體愈傷組織在植株再生過(guò)程中染色體自發(fā)加倍，從而發(fā)育成雙單倍體植株，因此經(jīng)花藥培養(yǎng)獲得植株存在倍性混亂、多倍體來(lái)源不明等問(wèn)題［26］。所以花藥培養(yǎng)中獲得的并非只是單倍體和雙單倍體，還包括非單倍體，如二倍體、三倍體、四倍體、五倍體、六倍體［27-28］，再生植株倍性鑒定顯得尤為重要。目前常用花藥培養(yǎng)再生植株倍性鑒定的方法有：一是組織細(xì)胞學(xué)觀察方法；二是流式細(xì)胞儀檢測(cè)法，進(jìn)一步確定雙倍體再生植株的純合性則采用分子標(biāo)記技術(shù)。Neeta 等［14］結(jié)合流式細(xì)胞儀和SSR 分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)麻風(fēng)樹(shù)（Jatropha curcasL.）花藥培養(yǎng)再生植株的倍性和純合性。李艷敏等［22］在芍藥花藥培養(yǎng)再生植株倍性鑒定中采用根尖細(xì)胞染色體觀察法。本研究采用了流式細(xì)胞儀檢測(cè)的方法鑒定中華獼猴桃花藥培養(yǎng)再生植株倍性，參試的51 株再生植株中有單倍體2 株，占比3.92%，雙倍體32 株，占比62.75%，三倍體10 株，占比19.61%，四倍體6株，占比11.76%，五倍體1株，占比1.96%。對(duì)與本文中的雙倍體再生植株的純合性需要進(jìn)一步采用分子標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，以區(qū)分雙單倍體。

長(zhǎng)期以來(lái)獼猴桃的優(yōu)良品種選育多以傳統(tǒng)方法為主，單倍體育種方面的工作開(kāi)展較少。獼猴桃花藥培養(yǎng)只獲得體細(xì)胞胚，沒(méi)有實(shí)現(xiàn)小孢子胚胎發(fā)生［16-17］。Chalak 和Legave 對(duì)美味獼猴桃栽培品種‘海沃德’（六倍體）的花粉進(jìn)行輻射，成功誘導(dǎo)三倍體再生植株［29］。Pandey 等［30］用輻射的獼猴桃花粉進(jìn)行授粉，誘導(dǎo)孤雌生殖。2018 年基于軟棗獼猴桃花藥培養(yǎng)成功獲得單倍體再生植株［11］，其單倍體植株誘導(dǎo)率為3.36%，與本研究中的單倍體植株誘導(dǎo)率3.92%相當(dāng)?？偟膩?lái)說(shuō)，獼猴桃屬植物中單倍體和雙單倍技術(shù)應(yīng)用較少。本研究初步建立花藥——愈傷組織——體細(xì)胞胚——植株再生的培養(yǎng)體系，可為中華獼猴桃或其它獼猴桃種的花藥培養(yǎng)獲得再生植株提供借鑒，再生單倍體或雙單倍體植株是獼猴桃的新種質(zhì)，可為獼猴桃育種提供重要育種材料。此外，獼猴桃屬植物倍性復(fù)雜，不利于該屬植物基因組測(cè)序和基因功能驗(yàn)證工作的開(kāi)展。單倍體和雙單倍植株的獲得，簡(jiǎn)化了全基因組測(cè)序的拼接工作，并且單一的遺傳背景便于基因功能的驗(yàn)證。