狹葉落地梅不同產(chǎn)地和部位抗氧化性研究

黃 樺，楊 菁，張敬杰，孫宜春，李慧馨，鄒 娟**，何 康*

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂（貴州）制藥有限公司，貴州 貴陽 550009）

狹葉落地梅（Lysimachia paridiformisvar. stenophylla）系報(bào)春花科珍珠菜屬植物，又名傘葉排草、涼風(fēng)草、追風(fēng)傘，主要分布于我國(guó)西南地區(qū)，是貴州苗族等少數(shù)民族的常用藥［1］。此藥味辛、苦，性溫，歸肝經(jīng)，以根或全草入藥，具有活血祛風(fēng)、通絡(luò)止痛之功效，常以煎湯、外敷、泡酒和燉豬肉服等方式用于治療跌打損傷、風(fēng)濕痹痛等癥［2-3］。狹葉落地梅主產(chǎn)于云南、四川、貴州、湖南等地，其中在貴州省的種植規(guī)模和產(chǎn)量較大，主要分布于貴陽、遵義、黔西、開陽等區(qū)域［4］。

現(xiàn)代研究表明，臨床上大多慢性非傳染性疾病的發(fā)生，均與體內(nèi)氧化劑和抗氧化物質(zhì)失衡而產(chǎn)生的氧化應(yīng)激有關(guān)［5-6］。多酚類成分作為常見的天然綠色抗氧化劑，廣泛存在于自然界中各植物體內(nèi)，因此，植物多酚不僅為抑制氧化應(yīng)激的重要原料來源，同時(shí)也是日常生活中非常重要的功能性食品及保健品，其結(jié)構(gòu)類型主要包括黃酮、酚酸、二苯乙烯和木脂素類等［7-8］。

文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)狹葉落地梅中含有豐富的黃酮、酚酸和揮發(fā)油類物質(zhì)［9-11］，其中黃酮類成分已被證實(shí)具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛以及抗氧化等功效［12-14］，而酚酸和揮發(fā)油類的活性研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此進(jìn)一步對(duì)該類物質(zhì)的活性進(jìn)行研究具有重要指導(dǎo)意義。目前，針對(duì)狹葉落地梅抗氧化活性的研究對(duì)象僅限于全草提取物，其與不同部位的抗氧化作用及其物質(zhì)基礎(chǔ)是否具有差異性方面存在空白，為了資源的合理開發(fā)利用，本試驗(yàn)以VC當(dāng)量抗氧化能力（Vitamin C equivalent antioxidant capacity， VCEAC）為指標(biāo)，優(yōu)化了貴州狹葉落地梅全草抗氧化有效物質(zhì)的提取工藝，進(jìn)一步通過測(cè)定其不同產(chǎn)地和部位的VCEAC、總黃酮、總多酚以及抗氧化活性，篩選出抗氧化能力較優(yōu)的狹葉落地梅產(chǎn)地、部位及其提取物與VC復(fù)配比例，為其后續(xù)研究和開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

11 批藥材由國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂（貴州）制藥有限公司于2020 年6 月提供，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為報(bào)春花科珍珠菜屬植物狹葉落地梅（Lysimachia paridiformisvar. stenophylla）。不同批次樣品自然陰干后，將不同部位（根、莖、葉和全草）分別粉碎過50目篩后備用，樣品信息詳見表5。

1.2 試劑與儀器

蘆丁，HPLC ≥ 98%，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸，HPLC ≥ 98%，購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司；亞硝酸鈉、無水碳酸鈉、過硫酸鉀、VC、DPPH 均購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；ABTS購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；福林酚（1 mol/L），購(gòu)于福州飛凈生物科技有限公司；硝酸鋁購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉購(gòu)于成都金山化學(xué)試劑有限公司；甲醇、無水乙醇均購(gòu)于天津市富宇精細(xì)化工有限公司；其中試劑和試藥均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為蒸餾水。

紫外可見分光光度計(jì)（UV-1800，日本島津）；電子天平（BSM-220.4，上海卓精電子科技有限公司）；電子分析天平（MS105UD，METTLER TOLEDO）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4，常州智博瑞儀器制造有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-250DB，昆山市超聲儀器有限公司）；多功能粉碎機(jī)（2500 A，永康市紅太陽機(jī)電有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（FN101-2，長(zhǎng)沙儀器儀表廠）。

1.3 工藝優(yōu)化

1.3.1 供試品溶液制備

精密稱取表5 中S1 批次的全草（SQ1，下同）0.5 g，于100 mL 圓底燒瓶中，精密加入10 mL 50%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，稱定重量，85℃回流提取1 次，每次1 h，放冷，補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取適量續(xù)濾液將其稀釋10倍，即得。

1.3.2 VCEAC的測(cè)定

參照文獻(xiàn)［15］的方法并稍加修改。精密吸取1 mg/mL 的VC對(duì)照品溶液各0、1.25、2.50、3.75、5.00 mL，置于5 mL 棕色容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。吸取不同濃度VC對(duì)照品溶液各10 μL于具塞試管中，依次精密加入ABTS+溶液3.00 mL［16］，搖勻，避光反應(yīng)6 min，在734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值。以VC濃度為橫坐標(biāo)，ABTS+溶液吸光度變化值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y= 0.581 9X+ 0.02（R2= 0.999 9）。

根據(jù)上述方法測(cè)定供試品溶液對(duì)應(yīng)的ABTS+溶液吸光度變化值后，帶入回歸方程計(jì)算其濃度，并按下式計(jì)算VCEAC值。

式中：Y為ABTS+溶液吸光度變化值；10 為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積；m為樣品質(zhì)量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

采用控制變量法，考察不同提取方法（85℃回流、40 KHz室溫超聲和浸漬）、提取溶劑（10%、30%、50%、70%、90%的甲醇、乙醇和水）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL）、提取溫度（65、75、85、95℃）、提取時(shí)間（60、120、180、240、300 min）和提取次數(shù)（1、2、3、4、5 次）對(duì)供試品中VCEAC 值的影響。其中在考察提取次數(shù)時(shí)，所得濾液需在50℃下?lián)]干后用50%乙醇定容至25 mL容量瓶中。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）為自變量，VCEAC 值為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-expert 8.0 軟件設(shè)計(jì)3 因素3 水平Box-Behnken 試驗(yàn)預(yù)測(cè)狹葉落地梅全草抗氧化活性成分最佳提取工藝，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Tab. 1 Test factor and level table of response surface

1.4 狹葉落地梅不同產(chǎn)地及部位的抗氧化性評(píng)價(jià)

1.4.1 VCEAC值測(cè)定

精密稱取表5 中不同樣品各1.0 g，以確定的最佳提取工藝進(jìn)行提取，按照“1.3.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，再按“1.3.2”項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定即可。

1.4.2 總黃酮、總酚含量測(cè)定

1.4.2.1 總黃酮含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)［17］的方法并稍加修改。精密吸取1.006 mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液各0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，置于10 mL 容量瓶中，加入10%NaNO20.6 mL，搖勻，放置6 min，加入7.5% Al（NO3）30.4 mL，搖勻，放置8 min，加入8% NaOH 4 mL，加水定容至刻度，搖勻，放置10 min，于502 nm下測(cè)定吸光度值（A）。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的A值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y= 9.374 8X+ 0.022 4（R2= 0.999 8）。

分別精密稱取表5 中不同樣品各1.0 g，以確定的最佳提取工藝進(jìn)行提取，過濾，取續(xù)濾液50 μL 于10 mL 容量瓶中，按照上述的方法測(cè)定A 值后，即可計(jì)算其總黃酮含量。

式中：Y為吸光度值；200 為稀釋倍數(shù)；V1為提取液體積；m為樣品質(zhì)量。

1.4.2.2 總酚含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)［18］的方法并稍加修改。精密稱取0.104 mg/mL 沒食子酸對(duì)照品溶液各0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL，置于10 mL 棕色容量瓶中，加入0.2 mol/L福林酚1 mL，搖勻，室溫避光反應(yīng)8 min，加入10% Na2CO32 mL，加水定容至刻度，搖勻，室溫避光反應(yīng)1 h，于761 nm 下測(cè)定吸光度值（A）。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的A 值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y= 78.966X+ 0.095 8（R2= 0.999 8）。

分別精密稱取表5 中不同樣品各1.0 g，以確定的最佳提取工藝進(jìn)行提取，過濾，取稀釋10 倍的續(xù)濾液150 μL 于10 mL 棕色容量瓶中，按照上述的方法測(cè)定A值后，即可計(jì)算其總酚含量。

式中：Y為吸光度值；667 為稀釋倍數(shù)；V1為提取液體積；m為樣品質(zhì)量。

1.4.2.3 總黃酮、總酚含量測(cè)定方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密稱定的SQ1 樣品和精密吸取的0.4 mL 蘆丁對(duì)照品溶液，分別按照“1.4.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理后于400～800 nm 波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1（a）所示，供試品在496 nm 處有最大吸收值，對(duì)照品在508 nm 處有最大吸收值，在兩者最大吸收波長(zhǎng)附近均無其他影響吸收，且相應(yīng)的試劑空白和試樣空白對(duì)波長(zhǎng)吸收均無影響，說明此法可作為本研究的顯色方法，固選擇兩者最大吸收波長(zhǎng)的均值（502 nm）為狹葉落地梅總黃酮含量測(cè)定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。同理，將精密稱定的SQ1 樣品與精密吸取的0.45 mL 沒食子酸對(duì)照品溶液，分別按照“1.4.2.2”項(xiàng)下方法處理后再于400 ~ 800 nm 波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行掃描，根據(jù)圖1（b）所示，狹葉落地梅總酚含量測(cè)定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為761 nm。

圖1 狹葉落地梅樣品的總黃酮（a）、總酚（b）紫外光譜圖Fig.1 UV spectra of total flavonoids （a） and total phenols （b）of L. paridiformis var. stenophylla

線性考察：根據(jù)回歸方程可知，當(dāng)蘆丁和沒食子酸的濃度范圍分別在2.012 × 10-2~ 8.048 × 10-2mg/mL、1.56 × 10-3~ 7.80 × 10-3mg/mL 之間時(shí)，線性關(guān)系良好，可對(duì)狹葉落地梅總黃酮和總酚含量進(jìn)行較好擬和。

精密度試驗(yàn)：精密吸取蘆丁、沒食子酸對(duì)照品溶液各0.6 mL，分別按“1.4.2.1”和“1.4.2.2”項(xiàng)方法連續(xù)測(cè)定6 次，計(jì)算其RSD 分別為0.02%、0.03%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密稱定SQ1樣品兩份，分別按照“1.4.2.1”和“1.4.2.2”項(xiàng)下處理后，每隔0.5 h 測(cè)定一次，通過試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試品溶液經(jīng)總黃酮、總酚顯色條件處理后分別于2 h和10.5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，其RSD值均 ≤ 3.00%。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取SQ1 樣品12 份，均勻分成兩組，每組分別按照“1.4.2.1”和“1.4.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，經(jīng)計(jì)算得總黃酮和總酚的平均含量分別為131.84、52.59 mg/g，RSD 值分別為1.49%、0.82%，表明上述方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取SQ1 樣品12 份，均勻分成兩組，每組按1∶1 的比例分別精密加入蘆丁和沒食子酸對(duì)照品，再分別按照“1.4.2.1”和“1.4.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值，通過計(jì)算得知，總黃酮和總酚的回收率平均值分別為100.86%、99.88%，RSD 值分別為2.61%、1.61%，表明上述方法準(zhǔn)確性較高。

1.4.3 抗氧化活性測(cè)定

1.4.3.1 溶液制備與配制

精密稱取表5中不同樣品1.0 g，以確定的最佳提取工藝進(jìn)行提取，濾過，濾液于50℃烘箱中揮干至恒重，得總浸膏。精密稱取適量浸膏和VC對(duì)照品，用50%乙醇溶解并配制成梯度濃度（0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mg/mL）的樣品溶液和VC對(duì)照品溶液。

1.4.3.2 DPPH自由基清除試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)［19］的方法并稍加修改。DPPH 溶液的配制：精密稱取DPPH 25 mg，用無水乙醇溶解并定容至50 mL 棕色容量瓶中。臨用時(shí)，取適量該液加無水乙醇稀釋，使其在517 nm 波長(zhǎng)處吸光度值為0.80 ± 0.02，現(xiàn)用現(xiàn)配。取100 μL 不同濃度的樣品或Vc 對(duì)照品溶液于試管中，分別加入2.9 mL DPPH溶液混勻，避光靜置15 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光值，記為A1；取100 μL 不同濃度的樣品或Vc 對(duì)照品溶液于試管中，分別加入2.9 mL 50%乙醇溶液混勻，避光靜置15 min，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光值，記為A2；取100 μL 50%乙醇溶液加入2.9 mL DPPH溶液混勻，避光靜置15 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光值，記為A0，按照下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.4.3.3 ABTS+自由基清除試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)［20］的方法并稍加修改。取50 μL 不同濃度的樣品或VC對(duì)照品溶液于試管中，分別加入3.0 mL ABTS+溶液混勻，避光靜置6 min，于波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定吸光值，記為A1；取50 μL 不同濃度的樣品或VC對(duì)照品溶液于試管中，分別加入3.0 mL 50%乙醇溶液混勻，避光靜置6 min，于波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光值，記為A2；取50 μL 50%乙醇溶液加入3.0 mL ABTS+溶液混勻，避光靜置6 min，于波長(zhǎng)734 nm 處測(cè)定吸光值，記為A0，按照下式計(jì)算ABTS+自由基清除率。

1.5 抗氧化聯(lián)合作用指數(shù)測(cè)定

研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化活性物質(zhì)之間的相互作用與氧化還原反應(yīng)中氧化劑的比例有關(guān)。同時(shí)，復(fù)配聯(lián)合產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)能夠增效減毒和延緩耐藥性發(fā)展［21］。為更加全面研究狹葉落地梅與VC復(fù)配的協(xié)同作用，本實(shí)驗(yàn)精密稱取11批全草中抗氧化能力較低（SQ8）、較高（SQ3）和較適中（SQ1）的3 批樣品的適量浸膏與VC分別按質(zhì)量比1∶5、1∶3、1∶1、3∶1 和5∶1 進(jìn)行復(fù)配［下文簡(jiǎn)稱復(fù)配物（1∶5）、（1∶3）、（1∶1）、（3∶1）和（5∶1）］。復(fù)配物先按照“1.4.3”項(xiàng)下進(jìn)行DPPH 和ABTS+自由基清除試驗(yàn)后，再參考文獻(xiàn)［22］計(jì)算并評(píng)價(jià)復(fù)配后的抗氧化效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 工藝優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從圖2（a）中可以看出，回流提取效率高于室溫浸漬和超聲，故后續(xù)試驗(yàn)中的提取方法均采用回流提取法。從圖2（b）中可以看出，除體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，甲醇提取率高于乙醇，其余溶劑呈現(xiàn)出的結(jié)果均為乙醇提取率高于甲醇，且當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，提取率達(dá)到峰值，對(duì)應(yīng)的VCEAC值為61.51 mg/g，此結(jié)果顯著高于水提液。這可能是因?yàn)轶w積分?jǐn)?shù)過高時(shí)大量醇溶性雜質(zhì)開始溶出，溶劑與抗氧化活性成分間極性差距明顯，兩者親和力下降，導(dǎo)致抗氧化作用降低［23］。魏金鳳的研究表明，狹葉落地梅抗氧化活性成分主要集中于極性較大的乙酸乙酯和正丁醇部分［24］。從圖2（c）中可以看出，當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，提取率最佳，對(duì)應(yīng)的VCEAC值為63.79 mg/g，說明料液比較低或較高均不助于提取此類成分。從圖2（d）中可以看出，當(dāng)提取溫度在65~95℃這個(gè)范圍內(nèi)波動(dòng)時(shí)，其提取率變化幅度較小，但當(dāng)溫度達(dá)到85℃時(shí)，其提取率最優(yōu)，對(duì)應(yīng)的VCEAC值為62.73 mg/g。故后續(xù)的試驗(yàn)中將提取溫度固定為85℃。從圖2（e）中可以看出，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到180 min 時(shí)，提取率最優(yōu)，對(duì)應(yīng)的VCEAC 值為88.54 mg/g。提取時(shí)間在60~300 min 這個(gè)范圍內(nèi)變化時(shí)，其提取率的變化較大，整體呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，但提取時(shí)間超過240 min 時(shí)，提取率顯著降低，這可能與長(zhǎng)時(shí)間加熱導(dǎo)致此類成分失活有關(guān)［25］。從圖2（f）中可以看出，當(dāng)提取次數(shù)為2 次時(shí)，VCEAC 值（67.88 mg/g）較高，但當(dāng)提取次數(shù)為1 次時(shí)，VCEAC 值（61.86 mg/g）已達(dá)到最高提取率的91.13%，考慮到提取效益和成本等因素，后續(xù)的試驗(yàn)中將提取次數(shù)固定為1次。

綜上，本實(shí)驗(yàn)選擇其中對(duì)結(jié)果影響較大的3 個(gè)因素（提取溶劑、料液比和提取時(shí)間）進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。通過Designexpert 8.0軟件對(duì)表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得回歸方程：Y= -165.73 + 3.43A+ 2.43B+1.49C- 3.431 × 10-3AB+ 1.436 × 10-4AC- 2.931 ×10-3BC- 0.034A2- 0.036B2- 3.755 × 10-3C2。方差分析結(jié)果顯示（見表3），A、B、C和A2、B2、C2項(xiàng)對(duì)VCEAC 值影響極顯著，BC項(xiàng)對(duì)VCEAC 值影響顯著，其他項(xiàng)對(duì)VCEAC值的影響均不顯著。各因素對(duì)VCEAC 的影響順序?yàn)镃>A>B，此結(jié)果與單因素考察結(jié)果一致。由表3 可知該模型極顯著，失擬項(xiàng)相對(duì)誤差不顯著。VCEAC 值模型方程R2= 0.993 2，表明方程擬合情況較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，能夠較為精準(zhǔn)地預(yù)測(cè)實(shí)際情況。校正決定系數(shù)R2= 0.984 5，表示98.45%的情況均能用該模型解釋，說明可以使用該模型對(duì)樣品進(jìn)行VCEAC 值的預(yù)測(cè)。由圖3 可知，AB、AC和BC交互作用的響應(yīng)曲面開口均朝下，且各凸起面上均具有最大響應(yīng)值，在各因素的考察范圍內(nèi)，VCEAC 值的變化均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)；AB和BC的等高線圖呈橢圓形，曲面彎曲度較大，且朝向C的等高線密度大于朝向A的，而AC的等高線圖呈圓形，曲面彎曲度較小。結(jié)合響應(yīng)面與等高線圖可知BC交互作用對(duì)VCEAC值的影響較AB交互作用和AC交互作用大，此結(jié)果與表中方差分析結(jié)果一致。

圖3 交互作用響應(yīng)面和等高線圖Fig.3 Response surface and contour map of interaction

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab. 2 Experimental design and results of response surface

表3 響應(yīng)面方差分析Tab. 3 Analysis of variance in response surface experiment

2.1.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面模型和結(jié)果分析，得到狹葉落地梅全草抗氧化活性成分的最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)49.58%、料液比1∶23.68（g/mL）、提取時(shí)間190.52 min，此條件下SQ1 樣品中的VCEAC 預(yù)測(cè)值為90.44 mg/g。結(jié)合實(shí)際操作的可行性和工業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，最終將試驗(yàn)條件調(diào)整為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶24（g/mL）、提取時(shí)間191 min。為驗(yàn)證模型的可靠性，精密稱取SQ1樣品，按照“1.4.1”項(xiàng)下方法平行進(jìn)行6 次試驗(yàn)，計(jì)算測(cè)定結(jié)果平均值的偏差率。由表4 可知，實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%，說明該模型穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較好，可用于擬和分析。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab. 4 Verification test results

2.2 狹葉落地梅不同產(chǎn)地及部位的抗氧化活性結(jié)果與分析

2.2.1 VCEAC值測(cè)定結(jié)果與分析

測(cè)定不同產(chǎn)地狹葉落地梅中各部位的VCEAC值，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地、不同藥用部位的抗氧化作用（表5）。結(jié)果表明，11 批狹葉落地梅根、莖、葉、全草的VCEAC 值范圍分別介于133.16 ~ 210.46、93.94 ~165.14、82.63 ~ 153.37、85.48 ~ 151.45 mg/g 之間，均值分別為188.48、127.92、114.07、111.95 mg/g，且分別以編號(hào)為SG6、SJ11、SY10、SQ4 的樣品的抗氧化能力最強(qiáng)。對(duì)不同部位VCEAC值進(jìn)行t檢驗(yàn)可知根的抗氧化作用最強(qiáng)。

表5 樣品來源及相關(guān)測(cè)定結(jié)果Tab. 5 Sample source and relevant determination results

2.2.2 總黃酮、總酚含量測(cè)定結(jié)果與分析

由表5 可知，11 批狹葉落地梅根、莖、葉、全草的總黃酮含量分別在201.28 ~ 361.79、153.89 ~251.53、126.38 ~ 230.75、126.43 ~ 223.11 mg/g 之間，均值分別為310.10、201.93、171.13、166.89 mg/g；總酚含量分別介于74.70 ~ 112.19、55.59 ~ 87.60、43.60 ~ 85.03、49.92 ~ 83.83 mg/g 之間，均值分別為100.11、71.84、65.73、63.12 mg/g，且分別以編號(hào)為SG6、SJ11、SY10、SQ4 的樣品的含量最高。對(duì)不同部位的總黃酮、總酚含量進(jìn)行t 檢驗(yàn)可知，總黃酮含量：根>莖>葉或全草；總酚含量：根>莖、葉和全草。

2.2.3 抗氧化活性測(cè)定結(jié)果與分析

對(duì)表5中不同樣品以及VC（陽性對(duì)照）分別進(jìn)行DPPH 和ABTS+自由基清除試驗(yàn)。結(jié)果如圖4 ~ 5 所示，隨著濃度的增加，不同樣品對(duì)DPPH 和ABTS+自由基的清除率整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其中根的增長(zhǎng)趨勢(shì)最為明顯。計(jì)算不同樣品以及VC對(duì)DPPH自由基和ABTS+自由基的半數(shù)抑制濃度（Half inhibitory concentration， IC50），結(jié)果如表5 所示。VC對(duì)DPPH和ABTS+自由基的IC50均為0.12 mg/mL。11 批狹葉落地梅根、莖、葉、全草對(duì)DPPH自由基的IC50分別介于0.12～0.15、0.17～0.36、0.18～0.45、0.16～0.30 mg/mL 之間，均值分別為0.13、0.23、0.28、0.23 mg/mL；對(duì)ABTS+自由基的IC50分別在0.11~0.17、0.14~0.30、0.14~0.36、0.17~0.35 mg/mL 之間，均值分別為0.13、0.20、0.21、0.29 mg/mL。由于IC50值的大小與抗氧化能力成反比，因此由表5中數(shù)據(jù)可知，編號(hào)分別為SG4、SJ3、SY6、SQ3 的樣品具有較強(qiáng)清除DPPH 自由基的能力；編號(hào)分別為SG3、SJ3、SY6、SQ3 的樣品具有較強(qiáng)清除ABTS+自由基的能力；且其中根、莖、葉對(duì)ABTS+自由基的清除能力略強(qiáng)，全草與之相反。對(duì)不同樣品DPPH、ABTS+自由基IC50值進(jìn)行t 檢驗(yàn)可知，清除DPPH 自由基的能力：根>莖>葉；清除ABTS+自由基的能力：根>莖或葉>全草。

2.3 聯(lián)合作用指數(shù)測(cè)定結(jié)果與分析

由圖4 和圖5 可知，不同樣品和VC均具有清除DPPH 和ABTS+自由基的能力，且在試驗(yàn)濃度下，全草樣品的清除作用較弱于VC。由表6 可知，樣品與VC復(fù)配的相互作用對(duì)DPPH 自由基清除效果表現(xiàn)為除SQ3復(fù)配液（3∶1）、（5∶1）和SQ8復(fù)配液（3∶1）具有疊加作用外，其余復(fù)配液均為協(xié)同作用。對(duì)ABTS+自由基清除能力表現(xiàn)為除SQ1 復(fù)配液（1∶5）、（1∶3）、（3∶1）、SQ3復(fù)配液（1∶5）、（1∶3）、（1∶1）和SQ8復(fù)配液（1∶5）具有疊加作用外，其余復(fù)配液均為拮抗作用。說明復(fù)配液中配比高質(zhì)量VC，有助于增強(qiáng)清除DPPH和ABTS+自由基的能力，其中以復(fù)配比1∶5 最優(yōu)。

表6 復(fù)配物清除DPPH和ABTS+自由基的相互作用Tab. 6 Interaction of DPPH and ABTS+ free radicals scavenged by combination

2.4 相關(guān)性分析結(jié)果

由表7 可知，總黃酮和總酚與抗氧化活性之間均具有顯著相關(guān)性，說明總黃酮和總酚可能是其發(fā)揮抗氧化活性的主要活性成分。但通過對(duì)表5中數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，就以編號(hào)SG6、SJ11 而言，其VCEAC值、總黃酮和總酚含量均為11 批中莖和葉的最高，但其對(duì)DPPH 和ABTS+自由基的清除能力較弱于SG3 和SJ4；以編號(hào)SY6、SQ3 而言，其對(duì)DPPH 和ABTS+自由基的清除能力均較強(qiáng)，但相應(yīng)的VCEAC值、總黃酮和總酚含量卻較低于SY10、SQ4。由此說明狹葉落地梅發(fā)揮抗氧化作用不僅僅只依靠總黃酮和總酚，還有可能與其他成分有關(guān)。

表7 相關(guān)性分析Tab. 7 Correlation analysis

2.5 聚類分析結(jié)果

以11批狹葉落地梅不同部位的VCEAC值、總黃酮含量、總酚含量、DPPH IC50和ABTS+IC50為變量，錄入SPSS 26.0軟件，設(shè)置歐氏距離的平方為度量標(biāo)準(zhǔn)，采用組間聯(lián)接法，進(jìn)行Q 型聚類。結(jié)果如圖6 所示，當(dāng)歐氏距離為15時(shí)，11批不同產(chǎn)地的樣品被分為四類，其中S1、S5～S8 為一類，S2、S9 為一類，S3、S4 為一類，S10、S11 為一類。結(jié)合上述數(shù)據(jù)可知，S3、S4質(zhì)量最佳。

圖6 11批狹葉落地梅聚類分析譜系圖Fig.6 Cluster analysis of 11 batches of L. paridiformis var.stenophylla samples

3 討論與結(jié)論

本研究以VCEAC為指標(biāo)，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化得到最佳狹葉落地梅全草抗氧化活性成分提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶24（g/mL）、提取時(shí)間191 min。此條件下SQ1 樣品的VCEAC 實(shí)測(cè)值為88.77 mg/g，與預(yù)測(cè)值90.44 mg/g 的偏差< 3%，說明此法準(zhǔn)確、可靠。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)建立的總黃酮和總酚含量測(cè)定方法具有穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，可作為黔產(chǎn)狹葉落地梅中有效成分群含量測(cè)定的方法。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)研究的黔產(chǎn)狹葉落地梅樣品中，來源于貴州省余慶縣關(guān)興鎮(zhèn)（S3）和鳳岡縣琊川鎮(zhèn)（S4）的樣品的抗氧化能力較突出，且除部分批次外，大多批次中的有效組分群含量和抗氧化能力主要表現(xiàn)為：根>莖>全草>葉。

目前對(duì)狹葉落地梅質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)主要以總黃酮含量為主，綜合評(píng)價(jià)的水平較低。對(duì)比前人研究［26-27］，本文運(yùn)用活性指導(dǎo)提取的手段進(jìn)行工藝優(yōu)化，較大提升了總黃酮等抗氧化活性物質(zhì)的提取效率，為其生產(chǎn)與研發(fā)提供了新方法。采用多指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，客觀分析狹葉落地梅藥材的質(zhì)量，通過分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，狹葉落地梅不同產(chǎn)地、部位間樣品在抗氧化能力上存在一定差異，這可能與地域、生長(zhǎng)環(huán)境、物質(zhì)基礎(chǔ)等因素有關(guān)。進(jìn)一步探究其不同藥用部位間成分差異、分析其具體活性貢獻(xiàn)成分、明確其抗氧化活性作用機(jī)制，不僅有助于提升該藥材的科技內(nèi)涵，同時(shí)可為其資源的合理應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

近年來，天然綠色抗氧化提取物的開發(fā)與應(yīng)用備受學(xué)者關(guān)注。本研究結(jié)果表明：狹葉落地梅抗氧化活性成分具有含量高、作用強(qiáng)、用量少等優(yōu)點(diǎn)，這不僅為該藥材的二次開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為綠色安全的天然抗氧化食品、保健品、藥品的研發(fā)提供了更多可能性。