非結(jié)核分枝桿菌肺病患者血清HMGB1和HMGN2的表達及診斷價值*

易丹,高孟秋,李琨,王瑞松,歐維正,阮樹松,徐勇

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 結(jié)核二科,北京 101149; 2.貴陽市公共衛(wèi)生救治中心 急診科,貴州 貴陽 550001; 3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 病理科,北京 101149; 4.貴陽市公共衛(wèi)生救治中心 檢驗科,貴州 貴陽 550001; 5.貴陽市公共衛(wèi)生救治中心 結(jié)核四科,貴州 貴陽 550001)

非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacterium,NTM)是除結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌以外的190多種分枝桿菌的統(tǒng)稱,這些生物在環(huán)境中無處不在,已從空氣、土壤、灰塵、植物、自然和飲用水來源中分離出來[1-2]。NTM可導(dǎo)致嚴重的肺部疾病,即NTM肺病(non-tuberculous mycobacterial pulmonary disease,NTM-PD)[3]。NTM-PD通常發(fā)生于中老年人,其發(fā)病率和患病率在世界許多地區(qū)呈上升趨勢,在全球造成了嚴重的醫(yī)療保健和社會經(jīng)濟負擔(dān)[4-6]。因此,尋找有效血清指標對NTM-PD進行早期診斷具有重要意義。HMG家族蛋白包括HMGB、HMGN和HMGA亞家族,它們是高度進化保守的核蛋白,高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein 1,HMGB1)是所有HMG家族成員中含量最高的蛋白質(zhì),也是細胞核中含量第二高的蛋白質(zhì),在哺乳動物細胞和組織中廣泛表達[7]。研究發(fā)現(xiàn),在感染和組織損傷的反應(yīng)中,HMGB1可以主動分泌并被動釋放到細胞外介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)[8-9]。高遷移率族蛋白N2(high mobility group protein N2,HMGN2)是HMGN家族中最保守的一員,其功能與DNA的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄、胚胎發(fā)育、器官發(fā)生有關(guān)外[10],近些年來的研究報道HMGN2具有抗菌和抗病毒作用[11]。但目前HMGB1和HMGN2在NTM-PD疾病中的表達尚不明確。本研究通過比較HMGB1和HMGN2在NTM-PD患者血清中的表達水平,采用(receiver operating characteristic,ROC)曲線評估血清中HMGB1和HMGN2水平對NTM-PD的診斷價值;采用logistic回歸分析影響NTM-PD發(fā)生的危險因素。為臨床診斷和治療NTM-PD提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2021年1月—2022年6月就診的NTM-PD的患者96例作為NTM組,106例肺結(jié)核病患者為結(jié)核組。同時選取100例體檢健康者作為對照組。納入標準:(1)NTM-PD患者診斷參考《非結(jié)核分枝桿菌肺病臨床實踐指南》[12],包括臨床肺部或全身癥狀表征、影像學(xué)檢查、細菌學(xué)檢查;(2)肺結(jié)核患者符合其診斷標準[13];(3)對照組無肺部疾病史,無任何因分枝桿菌感染引起的臨床癥狀或疾病跡象。排除標準:(1)合并肺部其他細菌或真菌嚴重感染等;(2)同時患NTM-PD及活動性肺結(jié)核的患者;(3)合并有惡性腫瘤、自身免疫性疾病;(4)合并心、腎、肺、肝等重要器官功能嚴重受損者;(5)哺乳期或孕婦。本研究征得患者及家屬知情同意,獲得醫(yī)院倫理委員會批準(20221011)。

1.2 研究方法

1.2.1一般資料收集 收集3組受試者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史及飲酒史,收集NTM組和結(jié)核組的肺內(nèi)空洞、咳嗽、咯血、慢性阻塞性肺疾病及支氣管擴張情況。

1.2.2NTM菌型鑒定 參照中國防癆協(xié)會制定的結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程要求,嚴格按照BACTECMGIT960快速分枝桿菌檢測系統(tǒng)培養(yǎng)分枝桿菌屬,并采用全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行對結(jié)核組患者的感染菌的菌型鑒定[14]。

1.2.3血清HMGB1和HMGN2水平檢測 NTM組和結(jié)核組患者在入院后24 h、對照組組于體檢當日內(nèi)采集血液樣本5 mL,3 500 r/min離心10 min分離血清,采過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清HMGB1和HMGN2的表達水平。

1.3 觀察指標

分別比較NTM組、結(jié)核組、對照組和不同菌種分型結(jié)核組患者的一般質(zhì)料,NTM組、結(jié)核組、對照組和不同菌種分型結(jié)核組患者血清HMGB1和HMGN2表達水平;對有差異的指標采用logistic回歸分析影響NTM-PD發(fā)生的危險因素。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料

2.1.1NTM組、結(jié)核組及對照組 3組受試者性別、年齡、BMI、吸煙史及飲酒史比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NTM組患者肺內(nèi)空洞、咳嗽、咯血、慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張比均高于結(jié)核組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 NTM組、結(jié)核組及對照組一般資料比較

2.1.2不同菌種分型結(jié)核組患者 根據(jù)菌種分型將結(jié)核組患者分為膿腫分枝桿菌(n=26),堪薩斯分枝桿菌(n=24),鳥分枝桿菌(n=6),胞內(nèi)分枝桿菌(n=40);結(jié)果顯示,不同菌種分型患者一般資料比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同菌種分型結(jié)核組患者一般資料比較

2.2 血清HMGB1和HMGN2表達

2.2.1NTM組、結(jié)核組及對照組 與對照組比較,NTM組和結(jié)核組患者血清HMGB1、HMGN2表達均升高,且NTM組表達水平高于結(jié)核組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 NTM組、結(jié)核組及對照組受試者血清HMGB1和HMGN2水平比較

2.2.2不同菌種分型患者血清HMGB1和HMGN2水平 106例NTM菌株共分離出4種,其中胞內(nèi)分枝桿菌占比最高,其次為膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌及鳥分枝桿菌。各菌種分型患者血清HMGB1、HMGN2比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同菌種分型結(jié)核組患者血清HMGB1和HMGN2水平

2.3 血清HMGB1和HMGN2水平對NTM-PD的診斷價值

ROC曲線顯示,血清HMGB1和HMGN2水平診斷NTM-PD的AUC分別為0.902(95%CI為0.852～0.939)、0.872(95%CI為0.818～0.915),截斷值為7.95 μg/L和 5.67 μg/L,對應(yīng)的敏感度分別為80.21%和90.62%,特異度分別為89.62%和83.02%;血清HMGB1和HMGN2水平聯(lián)合診斷的AUC為0.896(95%CI為0.893～0.966),敏感度為80.21%,特異度為91.51%(Z=2.021,P=0.043;Z=2.598,P=0.009)。見圖1。

圖1 血清HMGB1和HMGN2水平診斷NTM-PD的ROC曲線

2.4 NTM-PD發(fā)生的影響因素分析

將HMGB1和HMGN2、肺內(nèi)空洞(有=1,無=0)、咳嗽(有=1,無=0)、咯血(有=1,無=0)、慢性阻塞性肺疾病(有=1,無=0)、支氣管擴張(有=1,無=0)為自變量,logistic回歸分析結(jié)果顯示,HMGB1和HMGN2、慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張是影響NTM-PD發(fā)生的危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 多因素logistic回歸分析影響NTM-PD發(fā)生的危險因素

3 討論

NTM是一種需氧微生物,在6%～12%的氧氣中生長,具有富含脂質(zhì)的細胞壁和代謝特征。這些微生物可以承受廣泛的環(huán)境溫度,不易在標準細菌培養(yǎng)基中生長,并且具有抗生素和消毒劑抗性[14]。鑒于這些特點,NTM在世界范圍內(nèi)都有發(fā)現(xiàn),與肺部、胸膜、皮膚、眼睛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、軟組織、泌尿生殖系統(tǒng)和淋巴結(jié)等播散性和局部感染均有關(guān)[15]。NTM主要侵襲肺部器官,引發(fā)NTM-PD,其與肺結(jié)核類似。在臨床中,二者引發(fā)的肺病癥狀類似,檢測結(jié)果易重合,故二者鑒別診斷較為困難[16]。能準確、及時地診斷NTM-PD不僅是治療成功的基礎(chǔ),而且是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。因此尋找有效血清學(xué)指標可為NTM-PD患者的診斷提供參考依據(jù),具有重要價值。

HMGB1是一種高度保守的核蛋白,存在于所有細胞類型中,參與核小體結(jié)構(gòu)的維持和DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)的調(diào)控。1999年,Wang等[17]報道HMGB1從脂多糖刺激的巨噬細胞中釋放,并作為膿毒癥的促炎細胞因子。這一結(jié)果為后來研究HMGB1在炎癥過程和其他慢性炎癥疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。隨后大量報道表明在疾病感染期間,HMGB1可在單核細胞、樹突狀細胞、血小板和內(nèi)皮細胞等不同細胞中主動分泌,并從受損/壞死細胞的細胞核中被動釋放。細胞外HMGB1可導(dǎo)致多種病理,包括敗血癥、缺血再灌注、動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)退行性變、腦膜炎和癌癥等。張榮芝等[18]研究表明肺結(jié)核伴其它肺部疾病患者血清中HMGB1呈異常高表達,隨著感染程度的加重,其表達水平逐漸升高。本研究中NTM-PD患者血清HMGB1表達水平高于肺結(jié)核患者及健康人群,HMGB1是晚期炎癥因子,參與免疫調(diào)節(jié),能與多種受體結(jié)合引起細胞因子和趨化因子釋放,因此其水平的升高說明肺部處于炎癥狀態(tài)中。提示HMGB1可能通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與NTM-PD的發(fā)生、發(fā)展過程,有望成為鑒別NTM-PD疾病的潛在血清學(xué)指標。進一步通過ROC曲線證實,血清HMGB1水平診斷NTM-PD的AUC為0.902,高于0.7,表明通過檢測NTM-PD患者血清HMGB1水平可在一定程度鑒別NTM-PD發(fā)生。

HMGN2也是HMG家族的一員,位于1號染色體上(1p36.1),它在所有脊椎動物細胞中普遍表達。據(jù)報道,HMGN2在胚胎發(fā)育、神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)障礙中發(fā)揮作用。此外,HMGN2表達的增加與癌癥和自身免疫性疾病的發(fā)展有關(guān)[19]。Wang等[20]研究指出,恥垢分枝桿菌和膿腫分枝桿菌可誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化,在向M1型極化過程中,HMGN2可被自發(fā)誘導(dǎo),而HMGN2的缺乏在巨噬細胞抗非結(jié)核分枝桿菌的免疫方面發(fā)揮具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)HMGN2在NTM-PD患者血清中水平顯著升高,NTM菌株共分離出4種,其中胞內(nèi)分枝桿菌占比最高,其次為膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌及鳥分枝桿菌。進一步比較不同菌種分型患者血清HMGB1、HMGN2表達水平,發(fā)現(xiàn)二者在各組患者間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,二者是否對不同菌種分型患者具有鑒別作用,尚需進一步研究證明。進一步通過ROC曲線證實血清HMGN2水平診斷NTM-PD的AUC為0.872,敏感度為90.62%,特異度為83.02%,與HMGB1水平聯(lián)合診斷的AUC為0.896,敏感度為80.21%,特異度為91.51%,表明聯(lián)合檢測二者在NTM-PD患者血清中的表達可用于診斷NTM-PD發(fā)生,且聯(lián)合診斷效能高于單一指標檢測,可為NTM-PD疾病的預(yù)防和治療提供參考依據(jù)。此外,本研究通過logistic回歸分析表明HMGB1和HMGN2均是影響NTM-PD發(fā)生的危險因素,進一步表明HMGB1和HMGN2表達升高均與NTM-PD的發(fā)生關(guān)系密切。

綜上所述,HMGB1和HMGN2在NTM-PD患者血清中表達均升高,二者均影響NTM-PD發(fā)生的危險因素,對NTM-PD疾病具有一定診斷價值,具有重要的臨床意義。本研究尚存在不足之處,未探究二者發(fā)揮作用的確切機制,后期將完善實驗方案進行更深入的探討。