星狀神經節(jié)阻滯對脊髓損傷后中樞性疼痛大鼠疼痛行為的影響及機制*

王聽雨,毛冬梅,黃媛馨,姚旌*

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 疼痛科,貴州 貴陽 550000)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種致殘甚至死亡的嚴重疾病,SCI引起的長期感覺運動、認知及精神變化通常會使患者遭受巨大的痛苦[1]。中樞性疼痛(central pain,CP)作為SCI的常見并發(fā)癥,是一種神經病理性疼痛,發(fā)病機制涉及神經炎癥反應、脊髓感覺神經元過度活化及膠質細胞活化等[2],但確切機制尚不清楚。多年來,臨床上主要采用止痛藥物治療CP,但目前可用的藥物對CP患者的緩解效果不佳,因此探索更有效的鎮(zhèn)痛方法具有重要意義。自噬是細胞的基本代謝過程,以溶酶體途徑將有缺陷的細胞器和錯誤折疊的蛋白質消除[3]。不同動物模型的研究表明,在神經損傷后,受損神經、脊髓甚至腦的自噬活性發(fā)生了變化[3]。近年來研究表明,SCI模型可以導致自噬流受阻[4]。粒細胞集落刺激因子、姜黃素等可以通過激活自噬來緩解 CP[5-6],表明調節(jié)自噬途徑是治療SCI的潛在治療靶點。星狀神經節(jié)阻滯(stellate ganglion block,SGB)屬于一種臨床治療方法[7]。本課題組前期研究表明,SGB 可通過調控白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α等炎性因子,抑制創(chuàng)傷后家兔全身炎癥反應綜合征的炎性反應,對減少痛敏效果明顯[8]。在巨自噬過程的開始,內質網的自噬效應蛋白1和巨自噬過程的上游蛋白對脅迫信號通路做出反應,并啟動吞噬細胞的形成;一些蛋白質,包括自噬相關蛋白微管相關蛋白輕鏈3(light chain 3,LC3)和家蠶隔離體蛋白1(sequestosome-1,p62),參與了自噬小體的形成[9]。自噬小體與溶酶體融合,導致自溶酶體的形成和進一步的降解,故推測SGB治療在CP調節(jié)中發(fā)揮重要作用,其中一條可能的機制是SGB治療可以在損傷早期激活脊髓組織自噬,在抗炎和中樞敏化中發(fā)揮重要作用。因此,本研究擬采用大鼠SCI模型觀察SCI術后脊髓組織自噬指標的變化,以及SGB治療后對其的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物來源 27只成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,體質量200～250 g。本研究已通過學校倫理委員會動物倫理批準(NO2201610),所有實驗操作均符合動物倫理要求,并按照實驗動物使用原則進行。

1.1.2主要試劑和儀器 30%聚丙烯酰胺(polyacrylamide,PAM)、三羥甲基氨基甲烷、過硫酸銨、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)及聚山梨醇酯-20(Tween-20,北京Solarbio),四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,TEMED;上海Alladin),蛋白marker(上海雅酶),蛋白酶抑制劑(美國sigma),聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(美國Millipore),增強型化學發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL;上海Tanon),水溶性復合物(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)抗小鼠抗體及HRP抗兔抗體(上海碧云天),脫脂奶粉(美國BD),甲醇和HCl(南京化學試劑),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(成都Zen-bio);電泳儀和濕法轉膜儀(美國Bio-Rad),TY-80R脫色搖床(金壇醫(yī)療儀器),5200化學發(fā)光檢測系統(tǒng)(上海Tanon),BCD-216型冰箱(青島海爾),DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信),YLS-6B智能熱板儀(北京眾實科技)。

1.2 研究方法

1.2.1動物分組 27只大鼠隨機均分為假手術組(Sham 組,僅切斷T9～T11椎板并顯露硬脊膜、但不損傷硬脊膜)、SCI 組(行SCI)及SGB組(行SCI后予SGB),分別于術后第1天、第3天及第7天取大鼠脊髓樣本。

1.2.2CP模型的建立 采用SCI手術制備大鼠CP模型。SD大鼠用 2% 戊巴比妥鈉 40 mg/kg 腹腔注射麻醉(通過對有害刺激缺乏撤退反射和缺乏角膜眨眼反射來監(jiān)測)后,確定 T10 部位,手術區(qū)域備皮,俯臥位固定,將T10 椎板及棘突用手術鉗摘除,顯露硬膜兩側緣。待手術區(qū)域止血完善后,用止血夾(標定力恒定)鉗夾脊髓,持續(xù)1 min,松開止血夾,硬脊膜被鉗夾處出現(xiàn)鮮紅血腫標志,常規(guī)止血、消毒、縫合傷口。手術全程嚴格遵循無菌原則。術后護理:按摩大鼠進行人工排尿,2次/d,直至膀胱功能恢復(膀胱功能不能恢復的大鼠在麻醉下斷頸處理剔除入組)。CP模型造模成功的標志:熱痛敏潛伏期縮短和術后疼痛行為學改變如疼痛程度的加重來判斷CP的造模成功。

1.2.3SGB方法 SGB組大鼠SCI術后行全頸部備皮,碘伏消毒,于右側頸總動脈分叉處背側面找到梭型的頸上神經節(jié),斜向外下方約3 mm 處可見一個淡黃色團塊,即為頸交感神經干(右星狀神經節(jié)),在近心端將其離斷,消毒、縫合傷口。造模成功的標志:大鼠清醒后出現(xiàn)典型的霍納綜合征,如右側眼瞼持續(xù)下垂、瞳孔縮小及眼裂變窄等。

1.2.4行為學特征觀察 分別于術后第1天、第3天及第7天觀察各組大鼠的精神情況、皮毛光澤程度、體重、飲食情況、膀胱功能恢復情況;SCI造模后大鼠傷口愈合情況;術前和術后大鼠走路協(xié)調情況,是否拖足,是否有對其后肢和身體尾部皮膚修飾、搔抓、舔咬及自發(fā)嘶叫等過度自殘行為。其中,采用后肢行為測試評分量表(Basso,Beattie and Bresnahan loconmotor rating scale,BBB)評估各組大鼠后肢運動功能,BBB評分范圍為0～21分,分值越高,表示后肢運動功能恢復越好,至21分時即與正常動物相當;采用Hargreavest法檢測各組大鼠熱痛敏潛伏期(paw withdrawl latery,PWL),從實驗開始到出現(xiàn)縮足反應的時間以評估痛閾,每只大鼠測定3次,間隔5 min/次,取3次的平均值。

1.2.5脊髓標本制取 分別取“1.2.4”項下術后第1天、第3天及第7天時SCI、SGB組大鼠3只,術后第3天Sham組大鼠3只,腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉,斷頭處死,分離脊柱旁肌肉組織及椎板,迅速取出L4、L5脊髓,液氮速凍放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.6Western blot檢測 取“1.2.5”項下各組大鼠等量脊髓標本,碾磨、離心,測定蛋白含量;采用SDS-PAGE電泳儀(Bio-Rad),蛋白轉至PVDF 膜;抗LC3A/B抗體、抗p62抗體、抗GAPDH 抗體,4 ℃搖床孵育過夜;TBST沖洗10 min、3次,稀釋二抗,室溫孵育2 h,TBST沖洗10 min、3次,ECL顯色曝光。

1.2.7透射電鏡檢測 取“1.2.5”項下術后第3天時各組大鼠脊髓標本,放入2.5%戊二醛溶液,4 ℃固定,改鋨酸固定,梯度酒精行脫水,包埋劑處理樣品獲得70～90 nm切片,染色15 min,透射電鏡下觀察自噬結構。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 一般情況和BBB評分

SCI后,各組大鼠蘇醒后雙下肢呈遲緩性癱瘓,皮毛顏色逐漸變黃且較前無光澤,體質量增長減慢或減輕,飲食減少,排尿出現(xiàn)障礙,傷口無裂開、化膿及感染等情況。BBB評分結果顯示(圖1),Sham組大鼠術BBB評分完全恢復;與Sham組相比,SCI組大鼠BBB評分隨時間延長逐漸改善,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001);與SCI組相比,SGB組大鼠在各時間點BBB評分改善均優(yōu)于SCI組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

注：(1)與Sham組比較,P<0.001;與SCI組比較,(2)P<0.01,(3)P<0.001。

2.2 PWL

SCI組大鼠PWL從術后第1天開始升高,術后第 7 天最高;與Sham組相比,SCI組大鼠PWL降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001);與SCI組相比,SGB組大鼠PWL升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖2。

注：(1)與Sham組比較,P<0.001;(2)與SCI組比較,P<0.001。

2.3 組織學特征

采用透射電鏡的方法觀察術后第3天大鼠脊髓自噬小體含量變化,結果顯示(圖3),相比Sham組,SCI組大鼠脊髓線粒體結構部分完整,見空泡化,髓鞘板層可見結構分離,自噬體可見;與SCI組相比,SGB組大鼠線粒體結構部分完整、空泡化明顯可見大量自噬體,髓鞘板層結構紊亂較多見。見圖3。

注：黑色箭頭為線粒體,紅色箭頭為髓鞘板層結構;紅色方框為自噬體,綠色方框為線粒體空泡化,黃色方框為髓鞘板層分離。

2.4 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62蛋白表達

與Sham組比較,SCI組大鼠脊髓組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達于術后第1天迅速升高、第3天達最高值,且與術后第1、3天比較,術后第7天LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001);與Sham組比較,SCI組大鼠脊髓組織中p62蛋白表達于術后第1、3及7天增加,第3天為最高峰(P<0.001);與SCI組相比,SGB組大鼠脊髓組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達于術后第1、3及7天明顯升高(P<0.001),SGB組p62蛋白表達于術后第1、3及7天明顯降低(P<0.05)。見圖4。

注：A、B為LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的Western blot 檢測結果和定量結果,C、D為p62蛋白的Western blot 檢測結果和定量結果;與Sham組比較,(1)P<0.005,(3)P<0.001;與SCI組比較,(2)P<0.001,(4)P<0.05。

3 討論

SCI是一種廣泛使用且得到充分證明的CP模型,用于研究神經病理性疼痛的病理機制[10]。SCI后,脊髓神經膠質細胞被激活,導致背角神經元過度興奮,從而引起神經元-神經膠質回路敏化。適應不良的脊髓回路直接影響突觸興奮性,包括白細胞介素-1β、白細胞介素-6及腫瘤壞死因子-α在內的促炎細胞因子的積累,能夠激活小膠質細胞和星形膠質細胞,導致涉及自由基和血管活性胺的繼發(fā)性細胞毒性反應,最終導致神經元凋亡,促使自噬啟動,而自噬流受到抑制,則導致異常疼痛綜合征的發(fā)生[1]。自噬是一種常見的細胞保護過程,可被多種細胞應激刺激[3]。LC3是細胞自噬發(fā)生發(fā)展的關鍵分子,是細胞自噬發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。在發(fā)生自噬的時候,在自噬體膜上,可溶性LC3Ⅰ會與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺相結合,從而轉變成LC3Ⅱ。LC3Ⅱ在自噬體形成過程中逐漸被降解和消除,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與自噬體數(shù)量呈正相關,通常被認為是自噬體形成的標志,可用于檢測自噬過程[11]。選擇性自噬體膜受體蛋白,又稱p62蛋白,在所有組織中均有表達,廣泛分布于細胞質、細胞核、線粒體、自噬體及溶酶體,能識別錯誤折疊蛋白和受損器官,被p62識別后,通過招募LC3Ⅱ與p62一起運送到自噬和降解溶酶體中。因此,自噬溶酶體活動的強度和自噬通量可以由p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ判斷。最近研究顯示,SCI后會觸發(fā)自啟動而自噬流受阻[12]。Western blot結果顯示,在SCI后,與自噬相關的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的水平顯著增加[12]。許多使用不同動物模型的研究表明,在神經損傷后,受損的神經軸突、雪旺細胞和背根神經節(jié)中可以檢測到不同的自噬蛋白自噬活性的升高[13-15]。本研究中,SCI后脊髓組織內LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達上調,出現(xiàn)少量自噬小體。在基礎狀態(tài)下,脊髓組織中幾乎檢測不到LC3Ⅱ。這些數(shù)據表明,在生理條件下,自噬活性通常很低,但SCI可以上調自噬活性。盡管SCI輕度地誘導了自噬,但CP仍然會啟動和維持。故推測,低水平的自噬不足以逆轉SCI大鼠的疼痛。

CP是一種神經病理性疼痛,導致SCI后CP的原因很多,主要有神經炎癥反應,脊髓感覺神經元過度活躍,膠質細胞活化,突觸傳遞異常,及下游調控系統(tǒng)紊亂,但其確切的發(fā)病機理尚不清楚。目前已有研究表明,參與中樞敏化的脊髓背角是神經病理性疼痛形成的關鍵區(qū)域,周圍神經損傷后脊髓背角中激活的促炎細胞因子釋放多種炎癥因子,增加傷害感受器的敏化,促進神經病理性疼痛的形成[16-17]。由于誘導自噬通量可能有利于SCI后的功能恢復[18],因此,上調自噬可以抑制疼痛行為[19-23]。在本研究中,進一步探索了SGB是否調節(jié)大鼠SCI后的自噬途徑,結果顯示SGB可能通過激活自噬來緩解CP:選用透射電鏡、LC3、p62作為檢測自噬的主要指標,主要考慮到LC3、p62是自噬發(fā)生過程中的標志蛋白,而自噬檢測的金標準之一是透射電鏡[24]。本研究結果顯示,SCI組在SCI造模后第1、3及7天時脊髓LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62表達增加,表明自噬現(xiàn)象會由SCI造成的損傷刺激誘發(fā),但p62的增加提示損傷抑制了自噬的降解,影響自噬流。這與之前的許多研究結果相似,如坐骨神經慢性壓迫損傷模型能導致自噬流受阻[25];許多不同模型也會導致的神經病理性疼痛中發(fā)生自噬障礙[26-27]。經SGB治療后的SCI大鼠在第3天時脊髓LC3II/LC3I明顯增加并大于第1和7天,p62降低,提示脊髓自噬增加,自噬流過程通暢;自噬小體在脊髓組織的表達與蛋白印跡結果一致。以上研究結果表明,SGB可能通過激活脊髓組織自噬來緩解CP,其具體機制尚待進一步研究。本研究結果表明,SCI可以引發(fā)大鼠神經病理性疼痛的同時,也可誘發(fā)脊髓自噬激活,但自噬流受阻;SGB可以降低大鼠痛覺超敏,同時,也可促進自噬流,加強脊髓的保護性自噬。

綜上所述,SGB是潛在的治療CP的有效方法,且可能通過促進自噬發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。自噬在SCI造成的CP中發(fā)揮著重要作用,未來需要更深入探索SGB的作用機制。