丹參酮ⅡA對細(xì)菌性腦膜炎大鼠海馬區(qū)損傷的作用及機(jī)制*

李玉美,余資江,羅時(shí)鵬,楊丹,肖朝倫,孫寶飛,黃濤,李琳,劉來兵

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖教研室,貴州 貴陽 550025; 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科,貴州 貴陽 550004)

細(xì)菌性腦膜炎(bacterial meningitis,BM)是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病,感染導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高進(jìn)而發(fā)生腦疝等危及患者生命[1]。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展BM患者病死和致殘率雖有所下降,但50%以上的感染患者因神經(jīng)元損傷而遺留智力、學(xué)習(xí)及記憶能力等認(rèn)知功能障礙的后遺癥[2]。廣泛耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii,A.baumannii)比其他不動(dòng)桿菌有更強(qiáng)的致病能力,且致死亡率高達(dá)35%[3-4],因此探索傳統(tǒng)中藥對A.baumannii感染引起的BM的診治具有研究價(jià)值。氧化還原失衡是BM造成腦損傷的重要原因,丹參酮ⅡA屬于丹參酮類,作為一種具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤和激素樣作用的傳統(tǒng)中藥,廣泛運(yùn)用于心血管、代謝、癌癥、神經(jīng)退行性等疾病的治療[5-8]。Zhou 等[9]證實(shí)丹參酮ⅡA可抑制高遷移率族蛋白1(high mobility group box protein 1,HMGB1)的表達(dá)而減輕敗血癥對機(jī)體的損傷。因此,探索丹參酮 Ⅱ A在BM治療中的作用具有一定的研究價(jià)值。本研究以BM發(fā)生后致海馬區(qū)損傷表現(xiàn)認(rèn)知功能障礙為切入點(diǎn),利用傳統(tǒng)中藥制劑副作用小的優(yōu)勢,探討丹參酮ⅡA具體的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性健康清潔SD大鼠40只,3～4月齡,250～300 g,由學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)SYXK(黔)2018-0001]。

1.1.2菌株與細(xì)胞株來源A.baumannii標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株(17978)、小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞(HT-22)均購于美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

1.1.3主要試劑 兔抗HMGB1、基質(zhì)金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase,MMP9) 多克隆抗體購自北京博奧森、NF-кB(p-p50,p-p65)多克隆抗體購自美國Abcam,白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10、腫瘤壞死因子β(tumor necrosis factor-β,TNF-β)ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特、吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidinedithiocarbamic acid,PDTC)由蘇州碧云天廠家提供,RT-PCR提取試劑盒購自日本寶生物,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根。

1.2 研究方法

1.2.1A.baumannii液的制備A.baumannii(17978)在平板培養(yǎng)過夜復(fù)蘇,再挑選單菌落在含心腦浸液的瓊脂平板培養(yǎng)過夜,最后輕移至肉湯37 ℃搖床搖16～18 h,調(diào)整細(xì)菌數(shù),使其OD為0.1,計(jì)數(shù)菌落后建模備用。

1.2.2動(dòng)物模型分組 健康、清潔級(jí)的SD雄性大鼠40只,分為正常組(normal control group,NC組)、A.baumannii感染組(bacterial meningitis group,BM組)、生理鹽水干預(yù)組(bacterial meningitis+ normal saline,BM+NS組)及丹參酮ⅡA干預(yù)組(bacterial meningitis + tanshinoneⅡA,BM+TS組),正常組不做任何處理,后3組先采用環(huán)磷酰胺(45 mg/kg)和地塞米松(90 mg/kg)腹腔聯(lián)合注射構(gòu)建免疫受損動(dòng)物模型后再開顱構(gòu)建BM模型,具體步驟如下:將大鼠固定在腦立體定位儀下,沿失狀縫切開皮膚,以前囟為坐標(biāo)零點(diǎn),向后0.5 mm、右側(cè)1.5 mm,用0.9 mm直徑顱骨鉆頭打開顱骨,微量注射器進(jìn)針3.5 mm后緩慢注入10 μL臺(tái)盼藍(lán)溶液以確定側(cè)腦室位置,以此方法將15 μL、濃度為1×1011個(gè)/L濃度的A.baumannii懸液注入后3組大鼠的側(cè)腦室構(gòu)建BM模型;后2組菌液注入完成后立即同部位注入丹參酮ⅡA或生理鹽水3 mg/kg體質(zhì)量(每只動(dòng)物注射劑量為0.75～0.80 mg)。術(shù)后無菌環(huán)境飼養(yǎng),通過行為學(xué)、病理學(xué)檢測等判定模型是否構(gòu)建成功。

1.2.3Morris 水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力 自建模第2天開始連續(xù)3 d采用定向航行和空間探索2種方式檢測大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力變化?？臻g探索:將大鼠頭向池壁放入水池,記錄每只大鼠到達(dá)逃逸平臺(tái)的時(shí)間即為逃逸潛伏期。若120 s大鼠未能找到平臺(tái),則引導(dǎo)大鼠到達(dá)平臺(tái),潛伏期記為 120 s;定向航行:連續(xù)3 d的定位航行實(shí)驗(yàn)后撤去逃逸平臺(tái),記錄大鼠在120 s 內(nèi)找到目標(biāo)象限所花時(shí)間及進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù),以此檢測海馬區(qū)功能受損對其學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1.2.4尼氏染色檢測腦組織海馬區(qū)域的病理改變 在感染第7天時(shí)處死動(dòng)物,開顱取出海馬,去除周圍的血管及結(jié)締組織等,部分組織于4%中性甲醛固定后包埋。腦組織切片常規(guī)脫蠟、梯度酒精入水,1%甲苯胺藍(lán)染色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)及排列變化。

1.2.5ELISA檢測血清中IL-6、IL-10、TNF-β含量 在感染第7天時(shí)處死動(dòng)物,收集2 mL股動(dòng)脈血液樣本,按照IL-6、IL-10、TNF-β酶聯(lián)免疫試劑盒說明測定其表達(dá)。具體方法:加血清于反應(yīng)孔中孵育,同時(shí)設(shè)有空白孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔,各反應(yīng)孔中加入終止液混勻后測OD值檢測各組炎癥因子的表達(dá)變化。

1.2.6檢測HMGB1、NF-кB(p-p65)含量 在感染第7天時(shí)處死動(dòng)物,按每100 mg新鮮腦組織加入 Trizol試劑1 mL于勻漿器中完全磨碎。根據(jù)文獻(xiàn)合成NF-кB/P65引物序列(上游為ACAACCCCTTCCAAGTTCCT,下游為TGGTCCCGTGAAATACACCT,擴(kuò)增溫度56 ℃)和HMGB1引物序列(上游為TATGGCAAAAGCGGACAAG,下游為CTTCGCAACATCAC CAATGGA,擴(kuò)增溫度53.1 ℃)。用Trizol一步法提取腦組織總RNA,取總RNA 5 μL,在20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA,以5 μL cDNA為模板加入靶基因上下游引物,在50 μL體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測HMGB1、NF-кB(p-p65)含量的變化。

1.2.7檢測HMGB1、MMP-9、NF-кB(p-p50,p-p65)含量 在感染第7天時(shí)處死動(dòng)物,大鼠腦組織100 mg左右,剪碎、放入勻漿器中,分別加入核蛋白裂解液提取蛋白。以BSA為標(biāo)準(zhǔn),用Bradford法對上清進(jìn)行蛋白定量后電泳、轉(zhuǎn)膜、曝光分析結(jié)果,檢測HMGB1、MMP-9、NF-кB(p-p50,p-p65)含量的變化。

1.2.8PDTC阻斷NF-кB通路的體外干預(yù)實(shí)驗(yàn) 將5×104個(gè)/孔小鼠海馬神經(jīng)元(HT-22)接種于6孔板中培養(yǎng)至70%～80%融合,隨機(jī)分為NC組、BM組、PDTC阻斷+丹參酮ⅡA干預(yù)組(bacterial meningitis+inhibitor+tanshinone ⅡA,BM+IH+TS組)及BM+TS組,NC組不做處理,BM組以細(xì)胞與菌液1∶1的數(shù)量持續(xù)感染3 h構(gòu)建BM模型。BM+IH+TS組與BM+TS組,前組首先以200 μmol/L的PDTC加入細(xì)胞的培養(yǎng)基內(nèi)干預(yù)24 h以抑制神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)NF-кB信號(hào)通路的激活,再加入20 μmol/L的丹參酮ⅡA液處理24 h后,滴入同數(shù)量的A.baumannii懸液構(gòu)建感染模型;TS組以20 μmol/L的丹參酮ⅡA液加入細(xì)胞的培養(yǎng)基內(nèi)預(yù)處理細(xì)胞24 h后,再以同樣的方法構(gòu)建感染模型,驗(yàn)證丹參酮ⅡA可能通過抑制NF-кB通路發(fā)揮BM引發(fā)海馬損傷保護(hù)作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠日常表現(xiàn)

BM模型建立后,觀察大鼠的日常表現(xiàn)為:NC組大鼠精神狀態(tài)與活動(dòng)能力良好,毛皮光滑,飲水、飲食及尿量正常;BM組、BM+TS組及丹參酮ⅡA干預(yù)各組的大鼠活動(dòng)能力和進(jìn)食均受到了一定程度的影響,毛發(fā)枯槁,精神不振或萎靡、飲食減少或厭食,反應(yīng)遲鈍及自主活動(dòng)減少等,但TS組大鼠的精神狀況和進(jìn)食均比BM組、BM+TS組組改善很多。

2.2 學(xué)習(xí)與記憶能力

定向航行:自建模第2天開始,BM、BM+TS組與丹參酮ⅡA干預(yù)三組老鼠到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間均較NC組延長,且以BM與BM+TS組兩組增長更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),經(jīng)過為期3 d的訓(xùn)練,各組大鼠的逃避潛伏期均不斷降低,說明各組大鼠對水迷宮的空間環(huán)境已形成一定的記憶能力,均能較順利完成水迷宮的空間學(xué)習(xí)任務(wù)?？臻g探索:與對照組比較,BM、BM+TS組與丹參酮ⅡA干預(yù)三組老鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)均減少,且BM與BM+TS組兩組變化更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),證實(shí)BM引發(fā)的炎性損傷發(fā)生在海馬區(qū)確實(shí)使動(dòng)物的學(xué)習(xí)、記憶能力降低,輔以適量的丹參酮ⅡA溶液治療對損傷的神經(jīng)有一定的修復(fù)作用。見表1。

表1 四組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)潛伏期的比較

2.3 海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞

Nissl染色結(jié)果顯示,NC組大鼠海馬區(qū)椎體層神經(jīng)元細(xì)胞分布均勻、整齊,尼氏小體數(shù)量多;BM組與BM+TS組兩組大鼠在感染A.baumannii后海馬區(qū)椎體層神經(jīng)元細(xì)胞分布稀疏、排列紊亂,尼氏小體數(shù)量減少;丹參酮ⅡA干預(yù)后的BM大鼠海馬區(qū)椎體層神經(jīng)元細(xì)胞分布更趨均勻、整齊,尼氏小體數(shù)量增多,這一現(xiàn)象隨著感染時(shí)間的延長而更為明顯,提示丹參酮ⅡA溶液干預(yù)可促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞增生。見圖1。

注：黑色箭頭表示海馬區(qū)椎體層神經(jīng)元細(xì)胞的排列。

2.4 IL-6、IL-10、TNF-β表達(dá)

ELISA檢測海馬組織上清液中IL-6、IL-10、TNF-β的表達(dá)在BM與BM+TS組兩組明顯較NC組升高,而TS組中的表達(dá)雖較NC組有所升高,但相對其余2組表達(dá)量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但BM與BM+TS組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示丹參酮ⅡA干預(yù)后炎癥因子表達(dá)明顯減輕。見圖2。

注：(1) 與NC組比較,P<0.05;(2)與BM+TS組比較,P<0.05。

2.5 HMGBl、NF-кB(p-p65)的mRNA表達(dá)

TS組HMGBl、NF-кB(p-p65)mRNA的表達(dá)增強(qiáng),其在BM與BM+TS組兩組中mRNA的表達(dá)增強(qiáng)更為明顯,3組的HMGBl、NF-кB(p-p65) mRNA表達(dá)量均高于NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但BM與BM+TS組兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示丹參酮ⅡA干預(yù)后炎性反應(yīng)明顯減輕。見圖3。

注：(1) 與NC組比較,P<0.05;(2)與BM+TS組比較,P<0.05。

2.6 HMGB1、MMP-9、NF-кB(p-p50,p-p65)蛋白表達(dá)

Western Blot結(jié)果顯示:與BM與BM+TS組兩組比較,TS組HMGB1、MMP-9、NF-кB(p-p50,p-p65)蛋白的表達(dá)強(qiáng)度降低,3組中蛋白表達(dá)的強(qiáng)度均高于NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但BM與BM+TS組兩組間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示丹參酮ⅡA干預(yù)后炎性反應(yīng)明顯減輕。見圖4。

注：(1) 與NC組比較,P<0.05;(2)與BM+TS組比較,P<0.05。

2.7 蛋白HMGB1、MMP-9的表達(dá)

體外PDTC阻斷NF-кB通路后 Western Blot結(jié)果顯示:與BM組比較,發(fā)生BM時(shí)加入丹參酮ⅡA干預(yù)(即BM+TS組)后HMGB1、MMP-9蛋白的表達(dá)強(qiáng)度明顯降低;發(fā)生BM時(shí)加入PDTC抑制NF-кB通路激活后再加入丹參酮ⅡA干預(yù)(即BM+IH+TS組)組內(nèi)HMGB1、MMP-9蛋白的表達(dá)明顯升高;3組中蛋白的表達(dá)強(qiáng)度均高于NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示BM+IH+TS組雖然加入了丹參酮ⅡA干預(yù),但可能因?yàn)镹F-кB通路的抑制致使其保護(hù)作用并不明顯,故BM與BM+IH+TS干預(yù)兩組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),從而推測丹參酮ⅡA可能通過NF-кB通路發(fā)揮保護(hù)作用。見圖5。

注：(1) 與NC組比較,P<0.05;(2)與BM+TS組比較,P<0.05。

3 討論

BM是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染,細(xì)菌感染患者腦組織時(shí),一方面通過氧化還原失衡產(chǎn)生氧自由基,另一方面通過釋放促炎因子放大炎性反應(yīng)加劇患者腦損傷,因而探索適當(dāng)?shù)目寡趸瘎M的靶向治療具有重大的意義[10]。A.baumannii廣泛分布于自然界,是醫(yī)院內(nèi)一種重要的條件致病菌,其影響機(jī)體可能的機(jī)制有:其毒力因子脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可進(jìn)入機(jī)體與血液中的LPS結(jié)合蛋白(LPB)結(jié)合成LPS-LPB復(fù)合物,繼而與單核-巨噬細(xì)胞表面的CD14分子作用進(jìn)一步形成LPS-LPB-CD14復(fù)合物,通過MD-2蛋白激活TLR4進(jìn)一步影響脂質(zhì)A的合成,進(jìn)而通過細(xì)胞內(nèi)腫瘤壞死因子相關(guān)受體(transmissive right angle film,TRAF)、白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶(interleukin receptor-associated kinase,IRAK)等下游分子向下傳導(dǎo),最終活化NF-кB和MAPKs通路釋放大量促炎因子而加劇炎性反應(yīng)[11];A.baumannii可產(chǎn)生?-內(nèi)酰胺酶從而改變外膜的通透性躲避宿主細(xì)胞的免疫攻擊[12-13];A.baumannii還可侵入上皮細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞核內(nèi)部啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[14-16]加劇機(jī)體損傷。近來多重耐藥、泛耐藥甚至全耐藥A.baumannii不斷增多,使得A.baumannii感染成為治療方面的棘手問題[9],盡管A.baumannii引起的腦膜炎相對少見,但它與BM在重癥監(jiān)護(hù)病房特別是顱腦術(shù)后的患者引起的高死亡率(70%)相關(guān)[3],因此探索A.baumannii感染造成的BM有相應(yīng)的研究價(jià)值。HMGBl是一種高度保守的非組蛋白,具有誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的能力,是BM發(fā)病機(jī)制中的一種主要的炎性介質(zhì),有效地抑制BM病理過程中炎癥因子的產(chǎn)生和釋放,是BM治療的基礎(chǔ)和前提。同時(shí),HMGB1是內(nèi)毒素血癥和膿毒癥的晚期介質(zhì),也是臨床預(yù)測嚴(yán)重膿毒癥患者預(yù)后的重要因子[17]。其在進(jìn)化中高度保守,釋放出來的HMGB1與細(xì)胞膜上的晚期糖基化終產(chǎn)物受體或Toll樣受體(toll like receptor 2,TLR2)、TLR4受體結(jié)合激活MAPK、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)及NF-кB信號(hào)進(jìn)一步促進(jìn)炎性反應(yīng)加劇機(jī)體的損傷[18]。Zhu等[19]研究證實(shí)敗血癥小鼠血漿中HMGB1表達(dá)明顯增加,但丹參酮ⅡA處理后大大降低了血漿中 HMGB1水平而表現(xiàn)出明顯的抗炎效果。丹參酮ⅡA是從丹參中分離出的最豐富的二萜醌,本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)、體外兩個(gè)層次探索發(fā)現(xiàn):發(fā)生BM后加入丹參酮ⅡA干預(yù),炎性介質(zhì)HMGB1無論從蛋白或是基因水平表達(dá)均明顯降低,證實(shí)丹參酮ⅡA因降低了 HMGB1表達(dá)水平而表現(xiàn)出明顯的抗炎效果,有效的發(fā)揮了保護(hù)作用。

發(fā)生BM時(shí),MMP9溶解細(xì)胞外基質(zhì)、參與破壞血腦屏障等是造成組織損傷的重要機(jī)制。Kim等[20]研究證實(shí)BM模型腦脊液中MMP9的水平明顯升高,其表達(dá)量的高低與腦損傷呈正相關(guān),且MMP9的產(chǎn)生與氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),發(fā)生BM時(shí)加入丹參酮ⅡA干預(yù)后MMP9的表達(dá)明顯降低、ELISA檢測促炎因子的表達(dá)降低,這均提示丹參酮ⅡA發(fā)揮了腦保護(hù)作用。NF-кB作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的樞紐,在許多生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示,BM發(fā)生后加入丹參酮ⅡA干預(yù),除了HMGB1與MMP9蛋白與基因的表達(dá)降低外,NF-кB通路p50與p65兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)蛋白的表達(dá)也明顯降低;抑制NF-кB通路后加入丹參酮ⅡA干預(yù)上述蛋白的表達(dá)變化并不明顯,提示丹參酮ⅡA可能通過抑制NF-кB通路發(fā)揮BM誘導(dǎo)的海馬損傷的保護(hù)作用。

綜上所述,A.baumannii誘發(fā)的BM在加入丹參酮ⅡA干預(yù)后,可能因?yàn)檠踝杂苫?、炎性因子等的釋放減少而至損傷減輕,但在抑制了NF-кB通路后丹參酮ⅡA的腦保護(hù)作用不明顯,提示丹參酮ⅡA可能通過抑制NF-кB通路發(fā)揮BM誘導(dǎo)的海馬損傷的保護(hù)作用。BM患者在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加入丹參酮ⅡA輔助治療,可能減輕患者的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng),減輕神經(jīng)損傷程度從而發(fā)揮積極的腦保護(hù)作用,具體作用機(jī)制與炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)及丹參所致腦血流變化等均密切相關(guān),丹參酮ⅡA值得在日后臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。但BM引發(fā)的是全腦損傷,本實(shí)驗(yàn)僅限海馬區(qū)損傷的探討,探討范圍有限且僅檢測了NF-кB通路的p65和p50兩位點(diǎn)磷酸化蛋白表達(dá)的變化,檢測方式較單一,課題組將會(huì)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中上升到基因水平干預(yù),從而得出更精確的結(jié)論,為臨床進(jìn)一步探討B(tài)M提供確切依據(jù)。