18種中藥提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用比較及其機理*

譚超容,張金娟,廖尚高,蔣先慧,李小飄,何迅*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽 550025; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽 550025)

酪氨酸酶是黑色素合成過程中的關(guān)鍵限速酶,為一種75 kD含銅酶,擁有獨特的雙重催化活性,即單酚酶活性和多酚酶活性[1-4]。單酚酶可催化L-酪氨酸羥基化轉(zhuǎn)變?yōu)長-多巴,多酚酶又可將L-多巴轉(zhuǎn)化為多巴醌[5],多巴醌經(jīng)過重排后則生成多巴色素,再通過一系列的反應(yīng)合成黑色素[6-7]。合成黑色素這一過程在位于表皮基底層的黑色素細(xì)胞中進(jìn)行,合成的黑色素經(jīng)黑色素細(xì)胞的樹突運輸?shù)礁浇慕琴|(zhì)形成細(xì)胞內(nèi),隨著角質(zhì)形成細(xì)胞的移動逐漸由基底層移行至角質(zhì)層并脫落,故黑色素的合成、分布影響著皮膚的顏色[8-9]。當(dāng)酪氨酸酶過量表達(dá),促進(jìn)黑色素生成的量過多,引起人體皮膚色素沉著性疾病[10-11],因此,抑制酪氨酸酶活性,可阻斷黑色素合成反應(yīng)鏈,減少黑色素合成,則達(dá)到美白肌膚的效果?；诖?酪氨酸酶抑制劑 (tyrosinase inhibitors,TI) 也被用于護(hù)膚美白及色素沉著性疾病的治療[12]。隨著人民生活水平的日益提高,對美白產(chǎn)品的需求成倍增加,尋找TI,開發(fā)安全有效的美白產(chǎn)品可滿足人民求美及市場的需要。在美白護(hù)膚方面,中藥具有多成分、作用溫和、副作用小的優(yōu)勢[13-14],且越來越多的TI從天然植物中分離而得。本研究從《苗藥卷》《中華本草》中篩選出具有抗氧化,美白、祛斑作用的18味中藥,考察18味中藥提取物對酪氨酸酶的抑制作用,擬篩選出抑制酪氨酸酶活性作用突出的中藥提取物,并對其機理進(jìn)行研究,為尋找TI,開發(fā)安全有效美白產(chǎn)品提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1藥材來源 黃水枝、苦參、牡丹、地榆、熊果葉、花椒、柿葉、槐米、啤酒花、余甘子、桑葉、山茶花、大黃、白頭翁、仙茅、紫蘇、巖白菜及洋甘菊均采購于貴州貴陽。黃水枝、紫蘇、巖白菜及白頭翁藥用部位為全株,牡丹、啤酒花、山茶花、槐米及洋甘菊藥用部位為花,熊果葉、柿葉及桑葉藥用部位為葉,花椒藥用部位為果皮,余甘子藥用部位為果實,大黃、地榆、苦參及仙茅藥用部位為根。

1.1.2主要試劑 L-酪氨酸(北京索萊寶科技有限公司),L-多巴、酪氨酸酶(美國Sigma公司),曲酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.1.3主要儀器 Varioskan LUK 型全波長掃描多功能讀數(shù)儀(北京昊諾斯科技有限公司);MS105DC型天平(瑞士梅特勒托利多公司),KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),LAB-WP-R型超純水機(上海礫鼎水處理設(shè)備有限公司),冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司),移液槍(德國Eppendorf公司)。

1.2 研究方法

1.2.1醇提取物的制備 參考文獻(xiàn)[15]方法干燥18味藥材藥用部位并粉碎成粗粉,稱取各藥材粗粉20 g,以料液比為1∶10加70%乙醇200 mL作為提取溶劑,浸泡30 min,加熱回流提取1 h后回收溶劑,加溶劑160 mL繼續(xù)回流1 h,合并提取液,冷卻過濾,濃縮至浸膏,真空冷凍干燥后,置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2水提取物的制備 將18種藥材的藥用部位干燥后分別粉碎成粗粉,稱取各藥材粗粉20 g,以料液比為1∶10加水200 mL,浸泡30 min,加熱提取1 h,再加水160 mL繼續(xù)提取1 h,合并提取液,冷卻過濾,濃縮至浸膏,真空冷凍干燥后,置于4 ℃冰箱備用。

1.2.3溶液的配制 于酪氨酸酶中加適量PBS(pH=6.8)溶液,制得5 U/L的酶溶液,分裝至1.5 mL EP管中,置于液氮中保存,臨用前以PBS稀釋,配制成0.5 U/L的酪氨酸酶溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用;精確稱取L-酪氨酸、L-多巴,加適量PBS溶液,室溫超聲30 min溶解,分別制得濃度為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5及5.0 mmol/L的底物溶液;曲酸(陽性對照)溶液精確稱取適量曲酸,DMSO溶解,加適量PBS溶液稀釋,配置成實驗所需濃度,最終DMSO含量為0.5%;稱取適量的中藥提取物,DMSO溶解,加適量PBS溶液稀釋,配置成實驗所需的濃度,最終DMSO含量為0.5%。

1.2.4各提取物對酪氨酸酶活力的抑制率測定 參考文獻(xiàn)[16]的方法檢測各提取物對酪氨酸酶活性的抑制率。具體操作如下:依次分別吸取樣品40 μL、PBS10 μL及酶溶液10 μL混合,37 ℃預(yù)孵育10 min,加底物溶液50 μL,孵育25 min,于多功能酶標(biāo)儀波長475 nm處檢測吸光度值。實驗平行重復(fù)3次;根據(jù)吸光度值計算抑制率。

1.2.5黃水枝提取物對酪氨酸單酚酶的半數(shù)抑制濃度(median inhibition concentration,IC50)值測定 以2.5 mmol/L L-酪氨酸為底物,將黃水枝醇提物、黃水枝水提物、曲酸(陽性對照)分別配成濃度為2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5及0.031 25 g/L的溶液,按照“1.2.4”項下步驟操作,于多功能酶標(biāo)儀檢測吸光度,并采用Graphpad prism8.0軟件分別計算黃水枝醇提物、黃水枝水提物對酪氨酸單酚酶活力的IC50值。

1.2.6黃水枝提取物對酪氨酸多酚酶的IC50值測定 以3.5 mmol/L L-多巴為底物,將黃水枝醇提物、黃水枝水提物、曲酸分別配成濃度為2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5及0.031 25 g/L的溶液,按照“1.2.4”項下方法進(jìn)行檢測,采用Graphpad prism8.0軟件計算黃水枝醇提物、黃水枝水提物分別對酪氨酸多酚酶活力的IC50值。

1.2.7黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶活性抑制的動力學(xué)分析 (1)可逆性分析:在固定底物L(fēng)-多巴濃度為3.5 mmol/L,按照“1.2.4”項下方法檢測不同濃度黃水枝醇提物(濃度為0.700、0.500、0.250、0.125及0.000 g/L)對酪氨酸酶濃度分別為0.6、0.5、0.4、0.3及0.2 U/L時酶活力的影響。以酶反應(yīng)速率對不同濃度的酪氨酸酶溶液作圖,若所有直線都過原點,即為可逆,直線都平行,即為不可逆,以此可判斷黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶的抑制作用是否可逆[17-18]。(2)競爭性判斷:固定酪氨酸酶濃度為0.5 U/L,按照“1.2.4”項下方法進(jìn)行檢測不同濃度黃水枝醇提物(0.700、0.500、0.250、0.125及0.000 g/L),對不同濃度底物L(fēng)-多巴5.0、3.5、2.5、2.0及1.5 mmol/L酶活力的影響。通過以底物濃度的倒數(shù)[1/C]為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)[1/V]為縱坐標(biāo)作圖,得到Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,以曲線相交來判斷黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶的競爭類型。若相交于橫軸,為非競爭性抑制;若相交于第二象限,為競爭-非競爭性抑制;若相交于第三象限,為非競爭-反競爭性抑制[19];運用Dixon作圖法,選取底物L(fēng)-多巴的濃度分別為2.5和5.0 mmol/L進(jìn)行測定,以提取物濃度為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖,計算其抑制動力學(xué)常數(shù)(Ki)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 對酪氨酸酶活力的抑制率

本研究檢測18味中藥共36種提取物對酪氨酸酶活力的抑制率見表1,結(jié)果顯示,各提取物酪氨酸酶抑制率隨提取物濃度增大而增大;當(dāng)提取物濃度為2.0 g/L時,苦參、牡丹、花椒、柿葉、余甘子、啤酒花、黃水枝7味中藥的醇提物及黃水枝和地榆2味中藥的水提物對酪氨酸酶活力的抑制率均超過75%;當(dāng)提取物濃度為0.5 g/L時,地榆和黃水枝2味中藥的醇提物及花椒和黃水枝2味中藥的水提物對酪氨酸酶活力的抑制率超過50%。綜合判斷,黃水枝醇提物為醇提物中抑制酪氨酸酶活力最佳的樣品,黃水枝水提物則為水提物中抑制酪氨酸酶活力最佳的樣品。

表1 18味中藥提取物對酪氨酸酶活力的抑制率

2.2 黃水枝提取物對酪氨酸單酚酶活力的IC50值

測定不同濃度黃水枝醇提物、黃水枝水提物及曲酸對酪氨酸單酚酶活力的抑制率,計算IC50值,結(jié)果如圖1所示,黃水枝醇提物、黃水枝水提物及曲酸對酪氨酸單酚酶的抑制率隨著提取物濃度增大而增大,黃水枝醇提物、水提物及曲酸對酪氨酸單酚酶活力的IC50分別為0.283 g/L、0.637 g/L及0.053 g/L。以上結(jié)果提示,黃水枝醇提物對酪氨酸單酚酶有明顯的抑制作用,當(dāng)濃度為1.000 g/L時,抑制率與曲酸相接近。

圖1 黃水枝提取物對酪氨酸單酚酶的抑制率曲線

2.3 黃水枝醇提物、黃水枝水提物對酪氨酸多酚酶活力的IC50值

測定不同濃度黃水枝醇提物、黃水枝水提物及曲酸分別對酪氨酸多酚酶活力的影響,計算IC50值,結(jié)果如圖2所示,黃水枝醇提物、黃水枝水提物及曲酸對酪氨酸多酚酶的抑制率隨著提取物濃度增大而升高,黃水枝醇提物、黃水枝水提物及曲酸對酪氨酸多酚酶的IC50分別為0.248 g/L、0.587 g/L及0.168 g/L。以上結(jié)果提示,黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶有明顯的抑制作用,且當(dāng)濃度為0.000～2.000 g/L時,黃水枝醇提物與曲酸對酪氨酸多酚酶活力的抑制率接近。

圖2 黃水枝提取物對酪氨酸多酚酶的抑制率曲線

2.4 黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶活性抑制的動力學(xué)分析

黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶抑制作用的實驗結(jié)果顯示(圖3A),在底物與酪氨酸酶濃度不變的條件下,隨著黃水枝醇提物濃度的不斷增加,酶反應(yīng)速率隨之減小,由此可得黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶的抑制是減緩催化效率,表明黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶的抑制作用是可逆性抑制;以不同底物濃度的倒數(shù)[1/C]為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)[1/V]為縱坐標(biāo)作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖(圖3B),結(jié)果顯示,黃水枝醇提物各濃度相交于第二象限,屬于混合型抑制類型中的競爭-非競爭抑制;采用Dixon法作圖計算Ki值,結(jié)果顯示(圖4),2條直線相交點橫坐標(biāo)的絕對值即為黃水枝醇提物的Ki=0.158 g/L。

注：A為黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶活性的抑制作用,B為黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶抑制類型的影響。

圖4 黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶Ki的影響

3 討論

TI可通過抑制酪氨酸酶活性進(jìn)而調(diào)節(jié)黑色素的過度生成,從而達(dá)到美白的效果[20]。從中藥材中篩選TI并進(jìn)行研究成為較好的選擇[21]。本研究從《苗藥卷》《中華本草》中選取了18味具有抗氧化、美白作用的中藥材為研究對象,擬從中篩選出抑制酪氨酸酶活性最好的樣品。體外酪氨酸酶法是將待測樣本與底物在酶催化作用下,通過酶標(biāo)儀測定吸光度的變化來評定待測樣本對酪氨酸酶的抑制作用,該方法操作簡便、快速,已被廣泛應(yīng)用于TI的篩選[12]。曲酸可明顯抑制酪氨酸酶活性,是代表性的TI[22]。本研究采用體外酪氨酸酶法,分別考察了18味中藥的醇提物和水提物對酪氨酸酶的抑制作用,為保證本反應(yīng)體系與方法的可行性,研究中選擇了曲酸作為陽性對照樣品。

經(jīng)過體外酪氨酸酶法的篩選,結(jié)果顯示黃水枝醇提物在受試樣品醇提物中抑制酪氨酸酶活力作用最強,而黃水枝水提物則在受試樣品水提物中抑制酪氨酸酶活力作用最強。進(jìn)一步測定結(jié)果顯示黃水枝醇提物、黃水枝水提物對酪氨酸單酚酶的IC50值分別為0.283 g/L、0.637 g/L,對酪氨酸多酚酶的IC50值分別為0.248 g/L、0.587 g/L。該結(jié)果提示,黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶抑制作用較對酪氨酸單酚酶抑制作用更強。

酶動力學(xué)有利于闡明藥物對酶的功能及作用機理[23],本研究采用此法探討了黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶的抑制作用機理。研究顯示,黃水枝醇提物對酪氨酸多酚酶抑制作用表現(xiàn)為可逆性抑制即在抑制的過程中沒有不可逆的副作用,抑制類型為競爭-非競爭抑制,抑制常數(shù)Ki為0.158 g/L。提示黃水枝醇提物中的活性成分可通過與底物L(fēng)-多巴競爭酶的活性中心來抑制酶活性,這也提示黃水枝醇提物中可能含有競爭-非競爭抑制作用的單體抑制劑,也可能是由于黃水枝醇提物中含有黃酮類化學(xué)成分[24],黃酮類化合物具有抑制酪氨酸酶活性[25-26],也可能有其他抑制類型。

綜上所述,黃水枝醇、水提物分別為18味中藥醇、提物中抑制酪氨酸酶活性最強的樣品,且黃水枝醇提物作用強于水提物;黃水枝醇提取物抑制酪氨酸多酚酶的作用類型為可逆性競爭-非競爭性抑制,抑制常數(shù)Ki為0.158 g/L。此研究結(jié)果提示,黃水枝醇提物具有明確的抑制酪氨酸酶活性作用,為將其進(jìn)一步開發(fā)為美白產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。