丹參-川芎嗪配伍前后對急性心肌缺血大鼠體內(nèi)排泄及Ⅱ相代謝酶的影響*

孫佳,李容,2,勾健,2,潘文琪,3,陸苑,劉春花,黃勇,劉亭**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點實驗室,貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽 550004; 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽 550004; 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心 &省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室,貴州 貴陽 550004)

急性心肌缺血(acute myocardial infarction,AMI)是一種嚴重的缺血性心臟病,發(fā)病時會出現(xiàn)心臟代謝紊亂、心肌壞死、心律失常以及心肌梗塞[1-3]。參芎葡萄糖注射液(shenxiong glucose injection,SGI)為丹參水提液和鹽酸川芎嗪配制而成的復(fù)方制劑[4];臨床上常用于治療急性腦梗死、冠心病、心絞痛以及無癥狀心肌缺血等心腦血管疾病[5-7],其含有的水溶性丹酚酸類成分和鹽酸川芎嗪是其發(fā)揮抗心血管疾病的活性成分[8-9]。中藥復(fù)方是中藥臨床應(yīng)用的主要形式,配伍通過引起藥物代謝酶的改變從而導(dǎo)致藥物的吸收、分布、代謝以及排泄(ADME)過程發(fā)生變化[10]。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),與正常組相比,AMI模型大鼠體內(nèi)川芎嗪的清除率會顯著升高[11],可見模型狀態(tài)對藥物的清除有一定影響,因此在病理狀態(tài)下研究藥物配伍前后的體內(nèi)過程具有更重要的臨床意義。而排泄作為藥代動力學(xué)的最后一個步驟,是指藥物及其代謝產(chǎn)物從體內(nèi)清除的過程[12],對藥物療效、毒副作用以及藥物療效持續(xù)時間具有一定影響[13];同時通過研究藥物配伍前后的排泄情況,可進一步完善配伍前后的體內(nèi)過程研究,從藥物消除的角度闡明其配伍機制。人體內(nèi)參與Ⅱ相代謝的酶主要包括UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucurosyl-transferases,UGTs)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases,GSTs)、磺基轉(zhuǎn)硫酶、甲基化轉(zhuǎn)移酶和N-乙?；D(zhuǎn)移酶等[14-15]。藥物在Ⅰ相代謝中進行氧化、還原或水解反應(yīng),經(jīng)Ⅱ相UGT酶發(fā)生葡萄醛酸化結(jié)合反應(yīng)后生成的化合物親水性增強,進而更好地從尿液或膽汁排出體外[16]。實驗室前期考察了單次靜脈注射SGI、DGI、LGI后Ⅰ相代謝酶的表達及其對藥動行為的影響[17],但目前SGI配伍前后在病理狀態(tài)下的排泄及Ⅱ相代謝酶表達情況尚未見文獻報道,故本實驗以制劑中含量較高的丹參素和川芎嗪為檢測指標,采用超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra high performance liquid phase tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法測定丹參素和川芎嗪在AMI大鼠尿液和糞便中的含量,從UGT酶表達的角度分析配伍前后各成分在大鼠體內(nèi)的排泄差異機制,對SGI的臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 健康的SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體質(zhì)量為230～250 g,購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司,合格證號為SCXK(湘)2019-0014,實驗倫理審查編號1801210。按前期課題考察的造模和驗證方法進行AMI模型大鼠的制備和評價[18],按50 mg/kg劑量皮下注射鹽酸異丙腎上腺素溶液,1次/d,連續(xù)給藥2 d制備AMI模型大鼠,并隨機抽取6只大鼠進行模型驗證[觀察大鼠心電圖ST段,測定血清中血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸磷酸激酶同工酶(creatine phosphokinase isoenzyme,CK-MB)的含量]。

1.1.2儀器 ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S超高效液相串聯(lián)三重四極桿聯(lián)用儀(TQS,美國Waters)、ACQUITY UPLC-TQD 超高效液相串聯(lián)三重四極桿聯(lián)用儀(TQD,美國Waters),MTN-2800D氮吹濃縮儀(天津奧特賽恩斯),Allegra 64R低溫高速離心機(美國Beckman Coulter),代謝籠(意大利 Tecniplast ),WP-UP-WF-20微量分析型超純水機(四川沃特爾),GBOXChemiXL1.4 凝膠成像儀(英國Syngene),Variouskan LUX多功能酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific ),PowerPac Basic 電泳儀(美國 Bio-Rad),Trans-Blot Turbo 蛋白快速轉(zhuǎn)印儀(美國Bio-Rad),微量移液槍(德國Eppendorf)。

1.1.3材料 鹽酸異丙腎上腺素(純度≥99%,批號G2028261)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司,丹參浸膏(批號07200801)購于貴州景峰注射劑有限公司,木犀草苷對照品(純度≥98%,批號AF20072618)購于成都埃法生物科技有限公司,鹽酸川芎嗪、丹參素、葛根素對照品(純度≥98%,批號分別為X08O9C71471、H09N10S102463、S02M9B54875)均購于上海源葉生物科技公司,辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(批號ab205718)、鼠二抗(ab205719)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogen,GAPDH)單克隆抗體(批號ab8245)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UDP-glucurosyl-transferases 1A1,UGT1A1)一抗(批號ab194697)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A6(UDP-glucurosyl-transferases 1A6,UGT1A6)一抗(批號ab97646)均購于美國 Abcam 公司,特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號P0018AS)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司,乙腈、甲醇為色譜純購于德國Merck公司,其余試劑均為分析純。

1.2 研究方法

1.2.1SGI、丹參注射液、川芎嗪注射液、空白注射液的配制 按照 SGI 國家藥品標準“處方”、“制法”項下進行注射液的配制,分別精密稱取丹參浸膏、川芎嗪后按標準加入甘油、葡萄糖、注射用水,用鹽酸調(diào)pH至5.5～6.5,配制成SGI、丹參注射液(danshen injection,DGI,不含川芎嗪)、川芎嗪注射液(ligustrazine injection,LGI,不含丹參浸膏)、空白注射液(不含丹參浸膏、川芎嗪),并進行過濾,滅菌(115 ℃,30 min)。

1.2.2對照品溶液的配制 精密稱取丹參素、鹽酸川芎嗪、木犀草苷(TQD內(nèi)標)、葛根素(TQS內(nèi)標)對照品適量,甲醇定容,配制得丹參素(1 030 mg/L)、川芎嗪(9 986 mg/L)、木犀草苷(1 052 mg/L)、葛根素(1 023 mg/L)的儲備液,于-20 ℃保存?zhèn)溆?。分別精密量取適量丹參素、川芎嗪對照品儲備液,50%甲醇稀釋得65.920 mg/L、14.979 mg/L的混合對照品母液,再用50%甲醇2倍逐級稀釋得到不同濃度梯度的混合對照品工作液。

1.2.3鹽酸異丙腎上腺素溶液的配制 精密稱取鹽酸異丙腎上腺素0.1g于10 mL量瓶中,用生理鹽水充分溶解并定容至刻度,即得質(zhì)量濃度為10 g/L的鹽酸異丙腎上腺素溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.4色譜條件 各成分均采用實驗室前期建立的色譜條件和質(zhì)譜條件[17]。Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),Waters Van Guard BEH C18保護柱,流動相為0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B),梯度洗脫:0～1.0 min,92% A;1.0～1.5 min,92%至70% A;1.5～2.0 min,70%至60% A;2.0～2.5 min,60%至10% A;2.5～3.0 min,10% A;3.0～4.0 min,10%至92% A;柱溫40 ℃,進樣體積為1 μL,流速0.35 mL/min。

1.2.5質(zhì)譜條件 由于 SGI 中丹參素與川芎嗪在儀器中響應(yīng)差別較大,故本實驗中川芎嗪采用 TQD 檢測,丹參素采用 TQS 檢測。采用電噴霧電離源(ESI)正、負離子同步監(jiān)測,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,離子源溫度120 ℃,毛細管電離電壓 3 kV,去溶劑氣溫度 350 ℃,去溶劑氣流速 650 L/h,噴霧氣與反吹氣為N2,反吹氣流速50 L/h,碰撞氣為氬氣,碰撞氣流速0.16 mL/min,丹參素、川芎嗪及內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 待測成分及內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)

1.2.6AMI模型大鼠尿液及糞便樣品的收集 取AMI模型大鼠18只,分為3組(n=6),分別飼養(yǎng)于代謝籠中,收集空白尿液及糞便。根據(jù)SGI臨床用藥劑量換算成大鼠給藥劑量,按10 mL/kg劑量分別給大鼠尾靜脈注射SGI、DGI、LGI(相當于丹參素3.78 mg/kg、川芎嗪13.68 mg/kg)。收集給藥后0～4 h、4～6 h、6～8 h、8～12 h、12～24 h、24～36 h、36～48 h時間段尿液及糞便,并記錄尿液體積以及烘干后糞便的重量。于-20 ℃保存,備用。

1.2.7尿液樣品處理方法 取200 μL尿液于2 mL 離心管,再加入20 μL內(nèi)標(葛根素1.02 mg/L,木犀草苷157.80 mg/L)、60 μL鹽酸(1 mol/L)、1 mL乙腈,渦旋超聲,4 ℃下14 000 r/min離心10 min,得上清液a;沉淀中加入1 mL乙腈,渦旋超聲,4 ℃下14 000 r/min離心10 min,得上清液b;合并a、b液后氮氣吹干,殘渣加入50%甲醇200 μL渦旋溶解,4 ℃下15 000 r/min離心10 min,上清液進樣分析。

1.2.8糞便樣品處理方法 取烘干后糞便樣品0.2 g,加生理鹽水800 μL,制成25%的勻漿液,渦旋超聲,4 ℃下14 000 r/min離心10 min,取上清液200 μL置于2 mL離心管,其余同尿液處理方法“1.2.7”項下操作。

1.2.9Western blotting 測定大鼠肝臟中UGT1A1、UGT1A6蛋白的表達量 另取24只AMI模型大鼠,分為SGI組、DGI組、LGI組、空白溶劑組(n=6),每組大鼠給藥3 h后斷頸處死,按照前期考察的樣品處理方法進行肝微粒體的制備[17]。取等量總蛋白上樣,用SDS-PAGE 電泳分離總蛋白后轉(zhuǎn)膜,5%BSA室溫封閉3 h,加入UGT1A1一抗(1∶1 000)、UGT1A6一抗(1∶5 000)、GAPDH抗體(1∶5 000),4 ℃下過夜。TBST洗滌5次,每次5 min,加入二抗,室溫下孵育2 h;TBST洗滌5次,每次5 min,加入發(fā)光液,凝膠成像儀曝光,拍照保存。使用 Quantity one 凝膠圖像分析系統(tǒng)進行灰度值分析,計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白(GADPH)的灰度值比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1專屬性 分別制備尿液、糞便空白樣品,空白加對照品及給藥后的含藥樣品,按“1.2.7”“1.2.8”項下操作,進樣分析獲得相應(yīng)色譜圖,結(jié)果表明,木犀草苷、川芎嗪、葛根素、丹參素的保留時間分別為1.57、1.09、1.15、0.74 min,各成分分離度和峰形良好,被測物和內(nèi)標物的測定不受生物樣品中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

2.1.2標準曲線和定量下線 取空白尿液、糞便樣品各200 μL,分別加入“1.2.2”項下不同濃度梯度的混合對照品工作液20 μL,再按“1.2.7”“1.2.8”項下方法操作,以待測成分峰面積與內(nèi)標峰面積的比值(A/Ai)為縱坐標(Y),各成分的濃度(C)為橫坐標(X),并以1/X2為權(quán)重系數(shù),求得回歸方程。所得標準曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)>0.999 0。2個成分的標準曲線方程、線性范圍及定量下限見表2。

表2 2個成分在大鼠尿液、糞便中的標準曲線

2.1.3準確度和精密度 取空白尿液、糞便樣品各200 μL,加入高、中、低3個濃度的混合對照品溶液,再按“1.2.7”“1.2.8”項下方法操作,每個濃度5個樣本,連續(xù)進樣3 d,計算準確度和精密度。2個成分在各排泄樣品中的日內(nèi)、日間精密度RSD值均<15%,準確度范圍為88.64%～99.48%,提示該方法準確度、精密度良好,結(jié)果見表3。

表3 2個成分在大鼠尿液、糞便中的準確度、精密度

2.1.4提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取空白尿液、糞便樣品各200 μL,加入高、中、低3個濃度的混合對照品溶液,再按“1.2.7”“1.2.8”項下方法操作,測得峰面積A;將尿液、糞便樣品各200 μL按“1.2.7”“1.2.8”項下方法操作得到的上清液加入高、中、低3個濃度的混合對照品溶液及內(nèi)標溶液,吹干后加入200 μL流動相復(fù)溶,離心取上清液進樣分析測得峰面積B;以流動相代替空白尿液、糞便,加入高、中、低3個濃度的混合對照品溶液,進樣分析測得峰面積C。提取回收率=A/B×100%,基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%。2個成分的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)分別在96.91%～101.68%、94.36%～102.89%,RSD均<15%,結(jié)果見表4。

表4 2個成分在大鼠尿液、糞便中的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

2.1.5樣品穩(wěn)定性 配制高、中、低3個濃度的混合對照品溶液,考察在自動進樣器放置24 h,-20 ℃凍存30 d,經(jīng)3次凍融(-20 ℃至室溫)循環(huán)后的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示在這3種條件下樣品均比較穩(wěn)定,符合生物樣品測試要求,結(jié)果見表5。

表5 2個成分在大鼠尿液、糞便中的穩(wěn)定性

2.2 排泄實驗結(jié)果

AMI模型大鼠靜脈注射SGI、DGI、LGI后,SGI組中丹參素經(jīng)尿液、糞便的累積排泄量分別為(304.586±7.430)μg、(60.530±11.931)μg,累積排泄率分別為(31.354±2.096)%、(6.077±0.955)%;川芎嗪經(jīng)尿液、糞便的累積排泄量分別為(23.948±0.734)μg、(1.423±0.043)μg,累積排泄率分別為(0.517±0.034)%、(0.032±0.001)%。DGI組中丹參素經(jīng)尿液、糞便的累積排泄量分別為(313.504±6.205)μg、(47.835±7.658)μg,累積排泄率分別為(33.270±1.297)%、(4.525±0.765)%;LGI組中川芎嗪經(jīng)尿液、糞便的累積排泄量分別為(44.148±1.001)μg、(2.978±0.066)μg,累積排泄率分別為(0.995±0.066)%、(0.077±0.006)%。見表6。

表6 丹參素、川芎嗪在尿液、糞便中的累積排泄百分率

2.3 不同給藥組對UGT1A1、UGT1A6蛋白表達的影響

SGI組中UGT1A1、UGT1A6蛋白的表達量分別為0.228±0.042、1.051±0.092,DGI組中UGT1A1、UGT1A6蛋白的表達量分別為0.155±0.002、0.727±0.019,LGI組中UGT1A1、UGT1A6蛋白的表達量分別為0.177±0.008、0.582±0.019。與DGI組相比,SGI組UGT1A1、UGT1A6蛋白的表達量均升高(P<0.05,P<0.01);與LGI組相比,SGI組中UGT1A6蛋白的表達量明顯增加(P<0.001),UGT1A1蛋白的表達量有增高趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

注：A為Western blot電泳條帶,B為Western blot統(tǒng)計結(jié)果;與DGI組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01;(3)與LGI組比較,P<0.001。

3 討論

本課題基于AMI 模型大鼠靜脈注射SGI、DGI、LGI后,分別收集給藥后不同時間段的尿液、糞便樣品,樣品前處理后經(jīng) UPLC-MS/MS 分析,結(jié)果顯示,丹參素經(jīng)尿液的累積排泄率為31%～33%,是其排泄的主要途徑;川芎嗪經(jīng)尿液、糞便的排泄量很少,累積排泄率均不足1%。2個成分在給藥后0～4 h或12～24 h達到排泄高峰;在給藥后24～36 h或36～48 h時,各成分在尿液和糞便中基本排泄完全,不存在較長時間的蓄積現(xiàn)象。從配伍前后的累積排泄量結(jié)果可知,丹參素在配伍后經(jīng)尿液的排泄量降低,經(jīng)糞便的排泄量增加,整體改變無顯著性差異;川芎嗪在配伍后整體排泄量均顯著降低,在尿液和糞便中的排泄達峰時間前移。這與丹參素的藥動學(xué)過程改變無顯著性差異,配伍后川芎嗪的藥時曲線下面積(area under the curve,AUC)顯著降低,體內(nèi)分布變廣、消除加快[17]的藥動結(jié)果一致。

中藥配伍使用一方面可以誘導(dǎo)藥物代謝酶和外排轉(zhuǎn)運蛋白的表達,加速藥物代謝和排泄,減少有毒藥物在某一器官的分布、積累和暴露,從而減弱有毒藥物對機體的影響[19]。如Kim等[20]研究發(fā)現(xiàn),甘草中的黃酮類苷元甘草素可顯著誘導(dǎo)肝細胞外排轉(zhuǎn)運蛋白和主要的Ⅱ相代謝酶UGTs和GSTs的表達,促進有毒物質(zhì)的膽汁排泄而起到保肝作用。另一方面,也可通過對代謝酶的抑制調(diào)控作用,從而顯著改變主要藥效成分的體內(nèi)藥動學(xué)特征,進而影響整體藥效。Shi等[21]研究表明,與單體給藥相比,靜脈注射燈盞細辛注射液能增加顯著燈盞乙素的血漿暴露量以及膽汁和尿液的排泄量,且能提高其在腦組織的分布,其機制可能是注射液中芹菜素-7-O葡萄糖醛酸苷和咖啡?？鼘幩狨ヒ种屏甩?葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶和有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽2B1的活性,降低了燈盞乙素的水解和轉(zhuǎn)運,從而引起藥動行為改變而達到神經(jīng)保護作用。可見,中藥的合理配伍使用可通過影響代謝酶和轉(zhuǎn)運體的活性及表達從而改變相關(guān)藥動行為,進而起到更好的治療效果。

有研究表明川芎嗪以原型形式排出體外的量極少[22],推測其存在廣泛的代謝途徑。川芎嗪在體內(nèi)有多種代謝產(chǎn)物[23],而作為參與川芎嗪Ⅰ相氧化代謝的主要細胞色素P450(cytochrome P450,CYP)同工酶中的主要亞型CYP3A4、CYP2C9 和 CYP1A2,介導(dǎo)了川芎嗪的活性代謝產(chǎn)物2-羥甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(HTMP)的生成[24],UGT是人體Ⅱ相反應(yīng)中最重要的酶之一[25],其中的UGT1A1和UGT1A6作為UGT的亞型,進一步介導(dǎo)了HTMP葡萄醛酸結(jié)合反應(yīng)[26],通過形成葡萄糖醛酸苷進而促進藥物的排泄。據(jù)報道,發(fā)現(xiàn)丹參與川芎嗪配伍后,參與川芎嗪Ⅰ相代謝的同工酶CYP1A2、CYP2C11以及CYP3A2的表達相對單方顯著增加[17],可見川芎嗪-丹參配伍后加快了川芎嗪代謝產(chǎn)物的生成,包括其中的活性代謝產(chǎn)物HTMP;通過對藥物代謝酶介導(dǎo)的排泄機制研究發(fā)現(xiàn),參與HTMPⅡ相反應(yīng)的UGT1A1和UGT1A6 在SGI組中的表達均顯著增加,提示丹參與川芎嗪合用后會加快HTMP的葡萄醛酸化進程,促進HTMP排出體外,推測這是配伍后川芎嗪原型排泄量降低的原因之一。

藥物的排泄與藥效強度及毒副作用等密切相關(guān),且藥物的排泄過程直接影響藥物在體內(nèi)的血藥濃度和藥效持續(xù)時間。當藥物排泄量增大時,血中藥量減少,會導(dǎo)致藥效降低,卻忽視了藥物的靶器官分布、及活性代謝產(chǎn)物等影響因素。前期研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪和丹參聯(lián)用后,單次給藥的情況下,川芎嗪在血中含量降低,代謝加快[17],推測原型成分并非其發(fā)揮藥效的主要原因;而Ⅰ相、Ⅱ相代謝酶的高表達,從代謝平衡的角度增加了活性代謝產(chǎn)物的生成,推測在川芎嗪和丹參的配伍中活性代謝產(chǎn)物HTMP是其發(fā)揮藥效的主要因素之一。