黃曲霉基因敲除體系的構建及其RNA依賴的RNA聚合酶1基因在生長發(fā)育中的作用*

劉翔,楊碧,田詢,周建鴻,禹文峰,齊曉嵐,江銀輝*

(貴州醫(yī)科大學 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室 &貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室,貴州 貴陽 550004)

黃曲霉(Aspergillusflavus,A.flavus)是一種重要的條件致病真菌,A.flavus的感染在免疫力缺陷的患者中易導致曲霉病,造成角膜、呼吸系統(tǒng)及循環(huán)系統(tǒng)等疾病[1-2]。針對曲霉病,臨床常用真菌藥物有兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑及卡泊芬金作為治療真菌感染的疾病[3-5]。但抗真菌藥物毒性大,副作用強,且A.flavus耐藥性的不斷增加,導致了疾病的治療困難和復雜化[6-8]。伴隨基因敲除在科學研究上的應用日益廣泛,選擇一種高效的基因敲除方式探討A.flavus功能基因非常重要?；蚯贸–lustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associate system 9(CRISPR/Cas9)、同源重組(homologous recombination,HR)、RNA干擾(RNA interference,RNAi)引起基因敲除等技術[9],其中研究某個基因在生長發(fā)育中的調控作用時,HR靶向基因敲除是一種有效的方式[10]。DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks,DSBs)的修復機制包括HR與非同源末端(non-homologous DNA end joining,NHEJ)連接通路,兩種機制獨立作用并有競爭關系[11]。在酵母中主要利用HR修復DSBs途徑,容易發(fā)生DNA同源整合,而在大多數(shù)絲狀真菌中優(yōu)先通過NHEJ修復DSBs,基因靶向效率往往受到限制[12-13]。因此HR和NHEJ的競爭性質使得滅活一種途徑的基因有利于另一種途徑,Ku70/Ku80是NHEJ修復途徑的重要蛋白,研究顯示在粗糙脈胞菌(Neurosporacrassa)Ku80、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)Ku70缺失后靶向效率顯著增加[12,14]。因此在NHEJ弱化基礎上的靶向系統(tǒng)不僅可以提高基因敲除效率,同時減少了必要的時間和工作量。RNAi可以調控真核生物中基因的表達,通路中存在Dicer、Argonaute和RNA-Dependent RNA Polymerases(RDRP)3個保守核心組件,內源性的雙鏈RNA會被具有核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)Ⅲ結構域的DicerLike(Dcl)酶識別剪切為小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),隨后結合以Argonaute為核心RNA誘導沉默復合體(RNA induced silencing complex,RISC)上,隨后RISC靶向互補信使RNA(messenger RNA,mRNA)使其降解,導致基因的表達受到抑制,一部分siRNA被RDRP識別后合成雙鏈,又經RISC復合物作用于mRNA,使RNAi效應得到放大,最終沉默基因表達[15-17]。有研究表明,腐爛病菌RDRP可以參與調控營養(yǎng)生長[18],但在A.flavus中RNA依賴的RNA聚合酶1(RNA-dependent RNA polymerase 1,RDRP1)基因功能未有闡述。因此,本研究敲除A.flavus中RDRP1基因驗證在其生長發(fā)育中的作用,并評估本研究基因敲除方法的效率。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1菌株及培養(yǎng)條件質粒A.flavus菌株Ku70缺失的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的突變體菌株CA14(ΔKu70ΔpyrG)受福建農林大學汪世華教授惠贈,A.flavusLD-F菌株實驗室分離獲得,大腸桿菌DH5α購買于北京全式金生物公司,Pyrithiamine-resistant Ⅰ(pPTRⅠ)質粒購自北京Takara生物技術有限公司。

1.1.2培養(yǎng)基 Yeast extract Glucose Trace(YGT)+尿嘧啶尿苷(uracil uridine,UU)培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%葡萄糖,吸取1 mL微量元素、0.5 g/L尿嘧啶、0.5 g/L尿苷;察氏培養(yǎng)基(czapek-dox agar,CD)+UU培養(yǎng)基(蔗糖30 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵 0.01 g、磷酸氫二甲 1 g、硫酸鎂 0.5 g、硝酸鈉 3 g、尿苷0.5 g、尿嘧啶0.5 g及瓊脂粉13 g);馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)+UU(馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基46 g、尿苷0.5 g及尿嘧啶0.5 g);Wickerham Medium(WKM)+UU培養(yǎng)基(0.2%酵母提取物、3% 蛋白胨、0.5%玉米漿固體、0.2%葡萄糖、3%蔗糖、0.2% NaNO3、0.1%K2HPO4·3H2O、0.05% MgSO4·7H2O及0.01% FeSO4·7H2O)。

1.1.3主要試劑及儀器 十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB;北京博奧拓達科技有限公司),嘧啶磺胺A0098-100g (pyrithiamine,PT;美國GLPBIO公司),Q5 High-Fidelity DNA Polymerase(美國NEB公司),尿苷U8070和尿嘧啶U8070(北京Solarbio科技有限公司),溶壁酶L1412(日本Sigma公司),IG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ(瑞士Roche公司)。

1.2 研究方法

1.2.1A.flavusRDRP1基因的生物信息學分析 通過National Center for Biotechnology Information(NCBI)中https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/網(wǎng)址查找黃曲RDRP1基因,利用比對工具BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)獲取A.flavusRDRP1有一定同源性的曲霉屬氨基酸序列,使用MEGA7.0軟件和NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹,其中Bootstrap重復設置為1 000,同時通過軟件預測RDRP1基因的結構域,用軟件IBS(Version 1.0)將結構域進行可視化。

1.2.2RDRP1同源基因敲除片段構建 接種A.flavusCA14菌株于含玻璃紙的YGT+UU培養(yǎng)基,30 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d,收集菌絲。根據(jù)基因信息,設計RDRP1基因上下游序列,嘧啶磺胺抗性基因(pyrimidine resistance gene,ptrA)抗性基因引物如表所1示,使用CTAB法提取基因組DNA,用overlap重疊延伸聚合酶鏈式反應(overlap polymerase chain reaction,overlap PCR)方法將RDRP1的側翼序列與ptrA抗性基因融合在一起,模式圖見圖1。(1)使用表1引物RDRP1-1F1/RDRP1-1R、RDRP1-2F/RDRP1-2R2、Ptr-F/Ptr-R利用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增RDRP1基因的上下游同源序列及ptrA抗性基因;PCR反應體系為總體積30 μL、5×Q5 Reaction Buffer 6 μL、10 mmol/L dNTPs 0.3 μL、上下游引物各1 μL(10 μmol/L)、模板DNA 1 μL、Q5 Polymerase 0.3 μL及ddH2O 20.4 μL;反應條件為95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s(30個循環(huán)),72 ℃ 5 min;PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(2)產物通過凝膠回收試劑盒回收,利用核酸定量儀定量后按0.2×片段長度(bp)ng加模板序列讓其自身發(fā)生融合;PCR反應體系為總體積15 μL、5×Q5 Reaction Buffer 3 μL、10 mmol/L dNTPs 0.15 μL、模板DNA上游序列20 ng、ptrA 59 ng、下游序列20 ng、Q5 Polymerase 0.15 μL及ddH2O 15 μL;反應條件為95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s、61 ℃ 30 s、72 ℃ 160 s、15個循環(huán),72 ℃ 5 min。(3)以(2)融合產物為模板進行PCR擴增,PCR反應體系為總體積30 μL、5×Q5 Reaction Buffer 6 μL、10 mmol/L dNTPs 0.3 μL、上下游引物RDRP1-1F1/RDRP1-2R2各1 μL(10 μmol/L)、模板DNA 1.5 μL、Q5 Polymerase 0.3 μL及ddH2O 19.9 μL;PCR條件為95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s、61 ℃ 30 s、72 ℃ 160 s、30個循環(huán),72 ℃ 5 min;PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。(4)回收同源打靶片段,利用Taq酶給序列加腺嘌呤堿基處理,與PMD18-T載體連接轉入感受態(tài)E.coliDH5α中,篩選陽性克隆增菌后由上海生工生物有限公司測序。

注：紅色表示替換基因的序列,藍色表示載體元件。

表1 突變菌株構建所用引物

1.2.3原生質體制備及真菌轉化與鑒定 參考文獻[19]利用同源重組的方式缺失基因RDRP1,方案有做調整,模式圖如圖2所示。具體方法如下:收集YGT+UU培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的A.flavusCA14和A.flavusLD-F菌株孢子105CFU/L于0.1 L的YGT+UU液體培養(yǎng)基中,30 ℃充分振蕩培養(yǎng)12 h,100 μmol/L過濾器收集菌絲,無菌酶解液(0.8 mol/L NaCl、10 mmol/L Na3PO4、pH6.0、1.5%溶壁酶、1.5%纖維素酶、1.5%蝸牛酶及1%溶菌酶)20 mL于30 ℃,60 r/min消化2 h,40 μmol/L過濾器收集原生質體,4 000 r/min離心10 min,0.8 mol/L NaCl洗滌2次,加溶液Ⅰ[0.6 mmol/L KCl,50 mmol/L CaCl2,10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)]1 mL。利用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG) 4000介導的方式將融合PCR產物轉化進入A.flavusCA14和LD-F原生質體中,取原生質體160 μL與溶液Ⅱ[40% (W/V) PEG4000、0.6 mmol/L KCl、50 mmol/L CaC12及10 mmol/L Tris-HC1 (pH8.0)]40 μL,加構建的DNA片段5 μg輕緩混勻,冰浴30 min,加溶液Ⅱ1 mL輕緩混勻,靜置20 min。加含有0.2 mg/L PT CD+UU半固體培養(yǎng)基10 mL混勻,加預先倒好含有0.2 mg/L PT CD+UU的底層固體培養(yǎng)基中,置于30 ℃靜置培養(yǎng)2 d,挑取轉化子,連續(xù)培養(yǎng)5代得到穩(wěn)定的轉化子。

1.2.4轉化子鑒定引物 利用CTAB提取A.flavusCA14、A.flavusLD-F突變菌株及正常菌株基因組DNA以檢測引物det-RDRP1-F/det-RDRP1-R確定目的基因是否缺失,Ptr-F/Ptr-R確認片段是否插入成功,全長引物RDRP1-1F1/RDRP1-2R2片段大小差異確認陽性轉化子,PCR反應體系:總體積20 μL,2×Green Taq Mix 10 μL,上下游引物10 μmol/L各1 μL,模板DNA 1 μL,無菌雙蒸水7 μL。反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,30個循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用適當?shù)拿赶疉.flavusCA14突變菌株和CA14正常菌株基因組DNA,如圖1B所示。用試劑盒IG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ和sourthern blot鑒定突變菌株。

1.2.5生長速率、產孢量及菌核分析 接種突變菌株ΔRDRP1于PDA+UU培養(yǎng)基上,30 ℃黑暗培養(yǎng)7 d,pH 7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)6 mL洗脫表面的孢子,4層擦鏡紙過濾,8 000 r/min離心10 min、重復2次,PBS 1 mL重懸,血細胞計數(shù)板計數(shù)并調整合適濃度進行后續(xù)試驗。吸取ΔRDRP1菌株孢子懸液5 μL 按103CFU/L接種于PDA+UU固體培養(yǎng)基,30 ℃黑暗條件下培養(yǎng),用十字交叉法連續(xù)測定5 d生長速率,待培養(yǎng)7 d,取PBS 6 mL洗脫分生孢子,4層擦鏡紙過濾,8 000 r/min離心10 min、重復2次,PBS 10-3L 懸浮,采用血細胞計數(shù)板統(tǒng)計分析。吸取103CFU/L孢子懸液5 μL于WKM+UU培養(yǎng)基中央,30 ℃黑暗條件下培養(yǎng)14 d,75%乙醇噴灑菌絲表面,鑒定菌核差異。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 RDRP1基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構建與功能域預測

用軟件MEGA7對A.flavus的RDRP1(XP_041151040.1)蛋白與Aspergillusparasiticus(KAB8207520.1)、Aspergillustransmontanensis(KAE8313996.1)、Aspergillussergii(KAE8330556.1)、Aspergillusarachidicola(PIG85749.1)、Aspergillusnovoparasiticus(KAB8216270.1)、Aspergillusminisclerotigenes(KAB8271278.1)、Aspergillusoryzae(XP_001826725.3)、Aspergilluspseudocaelatus(KAE8420364.1)8種真菌同源蛋白進行比對構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果顯示A.flavus、Aspergillusoryzae相似性最高并歸為一個族(圖3A)。對蛋白質結構域預測,發(fā)現(xiàn)所有這9個真菌物種中都有相應的RDRP結構域(圖3B),蛋白大小相似都在1 187個氨基酸左右,說明RDRP1基因的蛋白在結構上也是保守的,提示具有相似的功能。

注：A為A. flavus RDRP1基因系統(tǒng)發(fā)育樹;B為A. flavus RDRP1蛋白結構域預測,灰色表示RDRP結構域。

2.2 同源打靶片段構建

PCR擴增結果顯示,RDRP1基因上下游序列與嘧啶磺胺抗性基因分別為897 bp、793 bp及2 926 bp利用overlap PCR融合在一起獲得4 616 bp大小的同源打靶片段,如圖4A圖所示;將同源打靶片段利用taq酶于72 ℃下處理30 min,清潔回收同PMD18-T連接,轉入DH5α感受態(tài)中,使用引物RV-M/M13-47篩選陽性克隆,擴增片段大小為4 725 bp,圖4B所示成功將同源打靶片段與載體連接。

注：A為RDRP1同源敲除片段構建,B為RDRP1敲除載體構建;M表示Super DNA Marker,(1)表示RDRP1載體構建檢測。

2.3 PEG介導的A. flavus RDRP1基因敲除

提取A.flavusCA14、A.flavusLD-F陽性轉化子基因組檢測,引物det-RDRP1-F/det-RDRP1-R檢測A.flavusLD-F 11個轉化子均為假陽性,突變株0個,敲除效率為0%。但引物Ptr-F/Ptr-R 檢測ptrA抗性基因有4個菌株含有2 926 bp片段(圖5A);鑒定A.flavusCA14 13個轉化子,獲得4個突變株,引物det-RDRP1-F/det-RDRP1-R未檢測到RDRP1基因內部序列,檢測到ptrA抗性基因(圖5B),同源片段成功取代RDRP1基因組,敲除效率30.8%。

注：A為A. flavus LD-F轉化子ptrA基因檢測,B為A. flavus CA14轉化子鑒定;M表示Super DNA Marker,1～11表示轉化子菌株ptrA抗性基因檢測,J表示目的基因檢測,P表示ptrA基因檢測。

2.4 Sourthern blot鑒定突變菌株

根據(jù)PCR的鑒定結果得到的陽性轉化子提取基因組DNA通過引物det-RDRP1-F/det-RDRP1-R檢測不能擴增大小1 200 bp片段,抗性基因引物Ptr-F/Ptr-R檢測有2 926 bp條帶外,并通過全長引物RDRP1-1F1/RDRP1-2R2鑒定片段長度差異,對照全長4 185 bp,缺失突變菌株全長4 616 bp;根據(jù)圖2模式圖用SacⅡ酶消化基因組DNA 10 μg,利用IG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ進行DNA雜交鑒定A.flavusCA14ΔRDRP1突變菌株。用引物RDRP1-prob-F/RDRP1-prob-R制備的探針雜交顯影,對照組條帶大小為2 994 bp,ΔRDRP1突變菌株為2 109 bp。提示成功敲除A.flavusCA14 RDRP1基因。見圖6。

注：A為ΔRDRP1 PCR鑒定,B為ΔRDRP1 Sourthern blot雜交鑒定;M表示1 kb DNA Marker,Q表示全長片段檢測,J表示目的基因檢測,P表示ptrA基因檢測。

2.5 突變菌株生長表型

103CFU/L ΔRDRP1突變菌株和CA14菌株孢子懸液接種于PDA培養(yǎng)基于30 ℃ 培養(yǎng)7 d,結果顯示(圖7),2種培養(yǎng)中菌落形態(tài)上無差異。

CA14 ΔRDRP1

2.6 生長速率、產孢量及菌核鑒定

結果表明(圖8),ΔRDRP1突變菌株的生長速率、產孢量及菌核的生產與CA14比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

注：A為生長速率測定,B為產孢量統(tǒng)計,C為菌核差異表型,D為菌核數(shù)量統(tǒng)計。

3 討論

A.flavus是僅次于煙曲霉的第2大條件致病菌[20],其產生的次級代謝產物—A.flavusAFs會嚴重威脅人類的健康,針對曲霉感染的治療藥物有限[21-22],因此探索A.flavus的治病因子從而尋找新的治療靶點具有一定的必要性。此外,一個高效的基因敲除方式可為曲霉病的治療奠定基礎?；蚯贸翘剿髂硞€基因功能最直接的方法,目前基因敲除的方式中CRISPR/Cas9、RNA干擾、隨機插入突變的方式較為復雜,周期長。HR是最經典的基因敲除方式,在絲狀真菌中已廣泛使用,操作方便[10-11,19],并且是需要同源序列為模板促進DSBs的重組修復,是基因敲除的關鍵[23]。HR和NHEJ兩種修復途徑是競爭狀態(tài),所以NHEJ則是影響靶基因敲除效率的重要因素,敲除NHEJ關鍵基因可提高同源重組效率[24-26]。

本研究利用同源重組技術對A.flavusCA14(ΔKu70)和A.flavusLD-F 菌株的RDRP1基因進行敲除,獲得A.flavusCA14(ΔKu70)缺失RDRP1基因的突變菌株且敲除效率為30.8%,相反野生型A.flavusLD-F突變株0個,敲除效率為0%,與之前的報道一致[10,14,19]。更有意思的是A.flavusLD-F未獲得突變菌株,但卻有打靶片段隨機插入的菌株,在絲狀真菌中當宿主DSBs修復時主要使用NHEJ途徑修復,該途徑不需要多的同源DNA匹配,會促進外源DNA在基因組DSBs處的隨機整合[12,27]。此外,當NHEJ途徑中的Ku70或Ku80缺失會導致該途徑的修復略有下調,則同源重組概率相對提高,因此實驗中A.flavusCA14(ΔKu70)菌株缺失RDRP1的突變菌株的概率較高。絲狀真菌的轉化過程有許多的方法:基因槍介導法、限制性酶介導整合法、電擊轉化法及根癌農桿菌介導法等,這些方法操作技術要求較高,消耗時間,相比之下,PEG介導法較為簡單,成本較低,可在短時間內完成操作[28],因此適合作為A.flavus功能基因研究的方法之一。

RDRP是一種RNA聚合酶,可將單鏈異常的RNA(abnormal RNA,aRNA)轉化為(double strain RNA,dsRNA),經Dicer酶剪切后作用于RISC,引導沉默靶基因,由此可見RDRP在基因調控方面有著重要的作用[29];有研究顯示,在卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)中將RDRP1誘導沉默后發(fā)現(xiàn)可以影響菌株的表型變化[29],酷綠木霉(Trichodermaatroviride)RDRP3缺失可導致產孢量的下降[30];在黑腐皮殼屬真菌Valsamali中RDRP1基因的缺失可影響產生繁殖體的數(shù)量均顯著下降[18]。但本研究中結果顯示,與其他真菌RDRP1基因作用相反,RDRP1在A.flavus的表型、生長速率、產孢量及菌核發(fā)育中未展現(xiàn)出調控作用。

此外,本研究選取PEG介導原生質體融合的方式結合A.flavusCA14(ΔKu70)菌株適當調整方案敲除RDRP1基因,可在短時間內獲得基因缺失菌株,為A.flavus的功能基因的探究奠定了基礎,同時對治療A.flavus等引起的曲霉病的研究具有一定的意義。