異藤黃酚對急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制*

劉琴,楊坤,牛振鵬,韋學(xué)耐,宋晶睿,饒青,黃裕兵,苑春茂,李艷梅***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽 550004; 2.貴州省天然產(chǎn)物研究中心,貴州 貴陽 550014; 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550014; 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽 550004)

急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種侵襲性血液系統(tǒng)惡性疾病,是最常見的兒科惡性腫瘤,也是導(dǎo)致兒童死亡的主要病因[1-2]。目前,臨床上用于治療ALL的藥物主要有長春新堿、類固醇激素及蒽環(huán)類藥物等[3]。在過去,ALL是一種難治性的血液系統(tǒng)惡性疾病,近年來隨著個(gè)體化治療的普及,其治愈率有所提高,但復(fù)發(fā)和化療耐藥仍然是臨床治療ALL的主要難題[4]。因此,研發(fā)新型抗ALL的藥物對臨床治療意義重大。來源于藤黃科植物的化合物具有結(jié)構(gòu)新穎及生物活性廣泛的特點(diǎn),近年來成為植物化學(xué)及藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[5]。木竹子(GarciniamultifloraChamp.ex Benth.)又稱多花山竹子,屬于藤黃科藤黃屬植物,是一種傳統(tǒng)中藥材,在中醫(yī)治療中,常以果實(shí)入藥,味甘、性涼,具有清熱、生津功效[6]。異藤黃酚(isogarcinol,ISO)是從木竹子中提取分離得到的天然小分子化合物,有研究報(bào)道ISO具有抗菌、抗炎及抗腫瘤活性[7-10],但對ALL Jurkat細(xì)胞的影響未見相關(guān)報(bào)道。因此,本研究主要探討ISO對Jurkat細(xì)胞增殖及凋亡的影響,并進(jìn)一步探究其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株 人ALL Jurkat細(xì)胞和人正常肝細(xì)胞HL-7702購買于美國細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC),由貴州省天然產(chǎn)物研究中心保存。

1.1.2主要試劑 二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、噻唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide,DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司,三聯(lián)夜(十二烷基硫酸鈉50 g溶解于適量雙蒸水,加異丁醇25 mL和濃鹽酸 0.5 mL,再加雙蒸水至500 mL配置而成),洛斯維·帕克紀(jì)念研究所(Roswell Park Memorial Institute,RPMI)1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司),胎牛血清(美國BI公司),線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)檢測試劑盒和Hoechst 33258染色試劑盒(江蘇碧云天生物公司),β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartate protease 3,Caspase3)、剪切的Caspase3(Cleaved Caspase3,Cleaved-caspase3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cysteine aspartate protease 9,Caspase9)、剪切的Caspase9(Cleaved Caspase9,Cleaved-caspase9)、凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)、細(xì)胞色素C(cytochrome c,Cytc)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、磷酸化PI3K(phosphorylated PI3K,p-PI3K)、重組人BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白(recombinant human BH3 domain apoptosis-inducing protein,Bid)、截?cái)嗟腂id(truncated Bid,t-Bid)、磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3(phosphorylated signal Transducer and Activator of Transcription 3,p-STAT3)、Janus激酶2(janus kinase 2,JAK2)、磷酸化JAK2(phosphorylated JAK2,p-JAK2)、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(polyadenosine diphosphate ribose polymerase,PARP)、剪切的PARP(cleaved PARP,Cleaved-PARP)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,p38)一抗及異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的二抗(美國CST公司),磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)一抗(美國SAB公司),細(xì)胞骨髓瘤病毒癌基因(cellular myelocytomatosis viral oncogene,c-Myc;英國Abcam公司),信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3;杭州華安生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3主要儀器 Synergy2 酶標(biāo)儀(美國Biotek公司),流式細(xì)胞儀(杭州艾森生物有限公司),倒置熒光顯微鏡(德國ZEISS公司),凝膠電泳儀(美國BIO-RAD公司),Odyssey CLX 紅外成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) ALL Jurkat細(xì)胞使用含5%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,人正常肝細(xì)胞HL-7702使用含5%血清的DMEM培養(yǎng)基,于37 ℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞活力 采用MTT法檢測ISO對Jurkat細(xì)胞活力的影響,以人正常肝細(xì)胞HL-7702作為毒性對照。取“1.2.1”項(xiàng)下對數(shù)生長期的Jurkat細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板,取“1.2.1”項(xiàng)下對數(shù)生長期的HL-7702細(xì)胞以8 000個(gè)/孔接種于96孔板,以DMSO為空白對照,用設(shè)定濃度的ISO(10、15、20及25 μmol/L)處理Jurkat細(xì)胞和HL-7702細(xì)胞24、48及72 h,加MTT(10 μL/孔)于37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育4 h,再加三聯(lián)夜(100 μL/孔)置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育過夜,酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定各孔的光密度(optical density,OD)值,計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取“1.2.1”項(xiàng)下對數(shù)生長期的Jurkat細(xì)胞,按5×105個(gè)/孔接種于6孔板,以DMSO為空白對照,用設(shè)定濃度的ISO(10、15及20 μmol/L)處理Jurkat細(xì)胞24、48 h,1 500 r/min離心3 min,收集細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌,加1×Binding Buffer 50 μL重懸細(xì)胞,分別加Annexin V-FITC 和碘化丙啶(propidium iodide,PI )2.5 μL,室溫避光染色15 min,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡。

1.2.4Hoechst 33258染色驗(yàn)證ISO對Jurkat細(xì)胞凋亡的影響 取“1.2.1”項(xiàng)下對數(shù)生長期的Jurkat細(xì)胞(5×105個(gè)/孔)接種于6孔板,分組及處理同“1.2.3”,24 h后收集細(xì)胞,PBS洗滌,加0.5 mL試劑盒中的固定液固定細(xì)胞10 min,1 500 r/min離心3 min,去固定液,PBS洗滌,加 Hoechst 33258染色液0.5 mL,避光染色5 min,置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5MMP檢測試劑盒(mitochondrial membrane potential assay kit,JC-1)檢測ISO對Jurkat細(xì)胞MMP的影響 取“1.2.1”項(xiàng)下對數(shù)生長期的Jurkat細(xì)胞(5×105個(gè)/孔)接種于6孔板,分組及處理同“1.2.3”,24 h后收集細(xì)胞,PBS洗滌,加培養(yǎng)液和JC-1染色工作液0.5 mL,混勻,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min,1 500 r/min離心3 min,用1×JC-1染色緩沖液洗滌細(xì)胞3次,加適量1×JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞,于熒光顯微鏡下觀察產(chǎn)生綠色熒光或紅色熒光的細(xì)胞占比。

1.2.6RNA高通量測序(RNAsequencing,RNA-seq)實(shí)驗(yàn) 取“1.2.1”項(xiàng)下對數(shù)生長期的Jurkat細(xì)胞,按1.5×106個(gè)/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿,分別用DMSO、ISO處理Jurkat細(xì)胞24 h,1 500 r/min離心5 min,收集細(xì)胞,加Trizol 裂解后送樣至武漢華大基因測序公司進(jìn)行測序分析。

1.2.7Western blot 檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 取“1.2.1”項(xiàng)下對數(shù)生長期的Jurkat細(xì)胞(1.5×106個(gè)/皿)接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿,分組及處理同“1.2.3”,24 h后收集細(xì)胞,加適量的細(xì)胞裂解液于冰上裂解45 min,4 ℃下12 000 r/min離心15 min,取上清液(蛋白溶液),BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,將蛋白溶液與5×Loading Buffer以體積4∶1比例混勻,100 ℃金屬浴變性5 min,置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離蛋白50 μg,用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,室溫3%牛血清白蛋白溶液封閉1 h,4 ℃下與Caspase3、Cleaved-caspase3、Caspase9、Cleaved-caspase9、PARP、Cleaved-PARP、Apaf-1、Cytc、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、p38、p-p38、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2及c-Myc相應(yīng)一抗孵育過夜,1倍三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(tris buffered saline,TBS)洗滌,室溫下與帶熒光的兔二抗孵育2 h,用紅外成像儀對膜進(jìn)行掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖

MTT檢測結(jié)果顯示(圖1A和1B),ISO能以時(shí)間-濃度依賴方式使Jurkat細(xì)胞活力下降(P<0.05),但對HL-7702細(xì)胞活力的影響較小;與DMSO組相比,10、15、20及25 μmol/L ISO組Jurkat細(xì)胞活力下降(P<0.05),且具有時(shí)間依賴性;與DMSO組相比,10、15、20及25 μmol/L ISO組HL-7702細(xì)胞活力無變化(P>0.05)。光學(xué)顯微鏡下觀察到ISO處理48 h后,能使Jurkat細(xì)胞數(shù)量明顯減少,且細(xì)胞趨于碎片化,但對HL-7702細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的影響較小(圖1C),提示ISO可能對Jurkat細(xì)胞具有選擇性。

注：A為Jurkat細(xì)胞存活率,B為HL-7702細(xì)胞存活率,C為ISO處理Jurkat細(xì)胞和HL-7702細(xì)胞48 h后,明視野下的細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)(20×);(1)與DMSO組比較,P<0.05。

2.2 細(xì)胞凋亡

為了探究ISO能否誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果如圖2 A和2B所示,ISO處理Jurkat細(xì)胞24 h和48 h后,與DMSO組相比,10、15 及20 μmol/L ISO組Jurkat細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),且具有時(shí)間依賴性;Hoechst 33258染色進(jìn)一步驗(yàn)證ISO對Jurkat 細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示(圖2 C),與DMSO組相比,ISO處理Jurkat細(xì)胞24 h,熒光顯微鏡下觀察到呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)逐漸增多,進(jìn)一步表明ISO可誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞發(fā)生凋亡。

注：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測Jurkat細(xì)胞的凋亡率(顏色越紅表示細(xì)胞密度越大),B為凋亡率統(tǒng)計(jì)分析,C為Hoechst 33258 染色結(jié)果(20×,亮藍(lán)色熒光越多表示凋亡細(xì)胞越多);(1)與DMSO組比較,P<0.05。

2.3 MMP及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

MMP檢測試劑盒JC-1分析ISO對Jurkat細(xì)胞MMP的影響,結(jié)果顯示,ISO處理 Jurkat細(xì)胞24 h后,熒光顯微鏡下觀察到產(chǎn)生紅色熒光的細(xì)胞數(shù)逐漸減少,而產(chǎn)生綠色熒光的細(xì)胞數(shù)逐漸增多,提示MMP下降;Western blot結(jié)果顯示,ISO 處理 Jurkat 細(xì)胞24 h后,與DMSO組相比,10、15及20 μmol/L ISO組Jurkat細(xì)胞Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Cleaved-PARP、t-Bid、Apaf-1及Cytc的表達(dá)增加(P<0.05),Caspase-3、Caspase-9、Bid及PARP的表達(dá)無變化(P>0.05),提示ISO通過激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡。見圖3。

注：A為JC-1染色結(jié)果(20×,紅色熒光表示細(xì)胞MMP正常,綠色熒光表示細(xì)胞MMP下降),B為Western blot檢測結(jié)果(綠色熒光表示蛋白顯影條帶,綠色熒光越強(qiáng),蛋白表達(dá)量越高),C、D分別為Caspase3、Cleaved-caspase3、Caspase9、Cleaved-caspase9、PARP、Cleaved-PARP及Bid、t-Bid、Cytc、Apaf-1蛋白的相對表達(dá)量;(1)與DMSO組比較,P<0.05。

2.4 ISO對JAK2/STAT3/c-Myc信號(hào)通路的影響

Western blot檢測ISO對JAK2/STAT3/c-Myc途徑相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響,結(jié)果如圖4 所示,與DMSO組相比,10、15及20 μmol/L ISO組Jurkat 細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3及c-Myc的表達(dá)下降(P<0.05),提示ISO以濃度依賴方式下調(diào)了p-JAK2、p-STAT3及c-Myc的水平,但JAK2和STAT3的表達(dá)無變化(P>0.05),則提示ISO可能通過抑制JAK2/STAT3/c-Myc途徑誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制其增殖。

注：A為Western blot檢測各蛋白的表達(dá)結(jié)果(綠色熒光表示蛋白顯影條帶,綠色熒光越強(qiáng),蛋白表達(dá)量越高),B為各蛋白表達(dá)的定量結(jié)果;(1)與DMSO組比較,P<0.05。

2.5 ISO對PI3K/Akt、p38 MAPK信號(hào)通路的影響

RNAseq分析結(jié)果如圖5A所示,與DMSO組相比,ISO處理Jurkat細(xì)胞24 h后,使299個(gè)基因上調(diào),57個(gè)基因下調(diào);通過Kegg-Pathway富集分析發(fā)現(xiàn),ISO主要影響了Jurkat細(xì)胞中MAPK及PI3K/Akt等信號(hào)途徑(圖5B);基于上述結(jié)果,采用Western blot 檢測ISO對Jurkat細(xì)胞PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果如圖5 C和5D所示,與DMSO組相比,10、15及20 μmol/L ISO組Jurkat細(xì)胞中p-p38的表達(dá)上調(diào)(P<0.05),p-PI3K、p-Akt的表達(dá)下調(diào)(P<0.05),提示ISO可能通過抑制PI3K/Akt通路,激活p38 MAPK通路,促進(jìn)Jurkat細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制其增殖。

注：A為差異表達(dá)基因,B為Kegg-Pathway富集分析結(jié)果(顏色越紅代表富集相關(guān)性越大,顏色越藍(lán)代表富集相關(guān)性越小,圈的大小代表基因數(shù)的多少,圈越大,基因數(shù)越多),C為Western blot檢測各蛋白表達(dá)的結(jié)果(綠色熒光表示蛋白顯影條帶,綠色熒光越強(qiáng),蛋白表達(dá)量越高),D為各蛋白相對表達(dá)量的定量結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析;(1)與DMSO組比較,P<0.05。

3 討論

ALL是由淋巴祖細(xì)胞在骨髓內(nèi)異常增生和聚集導(dǎo)致的一種惡性腫瘤[11],盡管目前治療已取得重大進(jìn)展,但仍有部分患者面臨復(fù)發(fā)和預(yù)后不良[12]。因此,尋找新型抗ALL藥物對臨床ALL的治療意義重大。天然產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)新穎、多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn),是抗腫瘤藥物研發(fā)的寶庫[13]。本研究結(jié)果表明,源于木竹子的天然小分子化合物ISO能明顯抑制Jurkat細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡,但對人正常肝細(xì)胞HL-7702的影響較小,提示ISO可能是一個(gè)低毒高效的天然小分子化合物,具有開發(fā)為抗ALL藥物的潛力。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)細(xì)胞程序性死亡的過程,對維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)具有重要作用,凋亡機(jī)制缺陷會(huì)促進(jìn)癌癥的發(fā)生[14]。細(xì)胞凋亡主要有3條途徑:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑、線粒體途徑及死亡受體途徑[15-16]。最經(jīng)典的凋亡途徑是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,MMP的下降直接導(dǎo)致線粒體膜的通透性增大,使Cytc釋放到胞質(zhì)并與Apaf-1結(jié)合形成凋亡復(fù)合體,啟動(dòng)Caspase級聯(lián)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。Caspase家族成員在細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用,Caspase9被凋亡復(fù)合體激活后,將信號(hào)傳遞給Caspase3,其活化后切割PARP進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示,ISO能上調(diào)Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Cleaved-PARP、t-Bid、Apaf-1及Cytc的表達(dá),激活線粒體凋亡途徑,誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡。

JAK2/STAT3信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物過程[19],該通路的過度激活參與了白血病、肝癌、乳腺癌及胰腺癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[20]。c-Myc是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子,其在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[21],c-Myc的抑制能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[22]。越來越多的研究報(bào)道,JAK2/STAT3/c-Myc信號(hào)通路的異常激活在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤中被認(rèn)為是支持腫瘤細(xì)胞存活、增殖及代謝的關(guān)鍵因素,抑制JAK2/STAT3/c-Myc途徑可以抑制T細(xì)胞ALL(T-ALL)細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[23]。本研究結(jié)果表明,天然小分子化合物ISO可抑制Jurkat細(xì)胞中JAK2/STAT3/c-Myc信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-STAT3、p-JAK2及c-Myc的表達(dá)。

p38 MAPK途徑在細(xì)胞凋亡及炎癥的調(diào)節(jié)中具有重要作用,激活該通路可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究表明,激活p38 MAPK可以誘導(dǎo)人ALL細(xì)胞系Jurkat和Nalm-6的凋亡并抑制其增殖,也可以誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2發(fā)生凋亡[24]。PI3K/Akt信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞的增殖和存活中起著重要作用,許多研究表明,PI3K/Akt信號(hào)通路的過度激活與癌癥的發(fā)生密切相關(guān),且是T-ALL的特征之一[25]。本研究通過RNAseq分析及Western blot檢測后結(jié)果表明,ISO影響Jurkat細(xì)胞中p38 MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-p38、p-PI3K和p-Akt的表達(dá)。

綜上所述,本研究表明天然小分子化合物ISO能抑制Jurkat細(xì)胞增殖,并通過激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)其凋亡,其機(jī)制可能與PI3K/Akt及JAK2/STAT3/c-Myc途徑的抑制及p38 MAPK通路的激活有關(guān)。但本研究僅對ISO的體外抗白血病活性進(jìn)行了初步探討,后續(xù)研究將利用基因敲除及過表達(dá)技術(shù),尋找ISO抗ALL的潛在靶點(diǎn),并建立ALL動(dòng)物模型,進(jìn)一步驗(yàn)證該化合物的體內(nèi)活性,明確其抗ALL的效果及作用機(jī)制,為ISO開發(fā)為抗ALL藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和科學(xué)理論基礎(chǔ)。