HIF-1α蛋白在燒傷后增生性瘢痕組織中的表達及臨床意義

周榮華 薛強東 吳麗芳

[摘要]目的：探討燒傷后瘢痕增生患者組織中HIF-1α蛋白的表達水平及其臨床意義。方法：選取82例燒傷后瘢痕增生患者的增生性瘢痕組織作為實驗組，同時取其自身正常皮膚組織為對照組。采用熒光定量PCR檢測HIF-1α的mRNA表達水平;采用免疫組化檢測HIF-1α的蛋白表達水平;采用Western blot檢測HIF-1α相關細胞因子，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的蛋白表達水平。結(jié)果：與正常組織（0.29±0.03）相比，增生性瘢痕組織中HIF-1α的mRNA相對表達水平（1.45±0.16）顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;免疫組化顯示，與正常組織中HIF-1α的陽性表達率（8.54%）相比，增生性瘢痕組織中HIF-1α的陽性表達率（70.7%）顯著升高（P<0.05）;Western blot顯示，與正常組織相比，增生性瘢痕組織中HIF-1α、TGF-β及VEGF蛋白表達水平顯著增加，E-cadherin蛋白表達水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：HIF-1α在增生性瘢痕組織中高表達，并通過調(diào)控下游細胞因子TGF-β、VEGF及E-cadherin的表達參與增生性瘢痕的發(fā)生、發(fā)展。

[關鍵詞]增生性瘢痕;HIF-1α;TGF-β;VEGF;E-cadherin;蛋白表達

[中圖分類號]R619+.6 ? ?[文獻標志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2019）05-0073-03

Expression and Clinical Significance of HIF-1α Protein in the Tissues with Hypertrophic Scar after Burn

ZHOU Rong-hua，XUE Qiang-dong，WU Li-fang，WANG Qi-cao，ZHANG Ya-jie，LI Qing

（Department of Dermatology，Longhua Branch of Shenzhen People's Hospital，Shenzhen 518109，Guangdong，China）

Abstract： Objective ?To investigate the expression and clinical significance of HIF-1 α protein in burn scar hyperplasia. Methods ?The hyperplastic scar tissue of 82 patients with scar hyperplasia after burn was selected as experimental group， and its normal skin tissue was taken as control group. The HIF-1α mRNA expression level was detection by real-time PCR. The protein expression of HIF-1α was analyzed by immunohistochemistry. The expression of HIF-1α-related cytokines TGF-β， E-cadherin and VEGF were detected by Western blot. Results ?Compared with normal tissues（0.29±0.03）， the mRNA relative expression of HIF-1α in hypertrophic scar tissue（1.45±0.16）was significantly increased （P<0.05）. Immunohistochemistry showed that the positive expression of HIF-1α in hypertrophic scar tissue （70.7%） ?was significantly higher than that in normal tissues （8.54%，P<0.05）. Western blot showed that compared with normal tissues， the expression of HIF-1α， TGF-β and VEGF in hypertrophic scar tissue were significantly increased， whereas the expression level of E-cadherin was significantly decreased （P<0.05）. Conclusion ?HIF-1α was highly expressed in hypertrophic scar tissue and participates in the development of hypertrophic scar by regulating the expression of downstream cytokines TGF-β， VEGF and E-cadherin.

Key words： hyperplastic scar; HIF-1α; TGF-β; VEGF; E-cadherin; protein expression

增生性瘢痕是創(chuàng)傷愈合的異常結(jié)局，是皮膚損傷后成纖維細胞增殖，膠原蛋白、纖連蛋白，氨基多聚糖等細胞外基質(zhì)的過度沉積所致。燒傷是臨床上引起瘢痕的常見原因之一，病理性瘢痕包括增生性瘢痕（Hypertrophic Scar，HS）及瘢痕疙瘩（Keloid，K）[1]。增生性瘢痕突起于皮膚表面，形狀不規(guī)則，潮紅、充血，并伴隨疼痛、瘙癢等癥狀，可持續(xù)數(shù)月或數(shù)年，影響患處外觀及功能障礙，增加患者心理壓力和生活負擔。增殖性瘢痕的發(fā)病機制目前尚未完全清楚，有研究認為其與成纖維細胞的增殖、凋亡失衡，細胞外基質(zhì)大量累積，瘢痕局部缺氧以及過度的炎性反應相關[2-3]。缺氧誘導因子（Hypoxia Inducible Factor，HIFs）是細胞感知氧氣水平變化的中樞調(diào)控因子，調(diào)控下游眾多靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，參與機體的血管生成、能量代謝、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等多種生物學過程[4-5]。本研究旨在探討燒傷后瘢痕增生患者組織中HIF-1α蛋白表達水平及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 ?資料和方法

1.1 一般資料：選取2015年11月-2017年11月筆者科室收治的燒傷后早期瘢痕增生患者82例。其中男51例，女31例;年齡11～52歲，平均年齡（37.3±6.8）歲;火焰灼傷33例，熱液燙傷39例，電弧燒傷10例。增生性瘢痕部位：面頸部12例，軀干19例，上肢29例，下肢22例。另取瘢痕增生患者自身正常皮膚組織作為對照組。納入標準：①燒傷創(chuàng)面愈合時間16個月以內(nèi);②臨床表現(xiàn)：燒傷受損部位瘢痕高出體表，充血明顯，色澤潮紅，伴疼痛、瘙癢等不適;③此前未接受其他治療手段防治瘢痕增生者;④無嚴重感染、器官性疾病、自身免疫性疾病等;⑤患者知情同意并經(jīng)筆者醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 試劑和儀器：總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;RIPA裂解液購自碧云天生物技術研究所;HIF-1α鼠單克隆抗體、TGF-β鼠單克隆抗體、VEGF鼠單克隆抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;E-cadherin兔單克隆抗體購自英國Abcam公司;GAPDH鼠單克隆抗體、HRP標記羊抗鼠、羊抗兔二抗均購自金斯瑞生物科技有限公司;蘇木精染色液、DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物科技有限公司;ABI 7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司;普通光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 HIF-1αmRNA水平檢測：根據(jù)總RNA提取試劑盒操作說明提取燒傷后瘢痕增生患者正常組織和瘢痕增生組織的總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取質(zhì)量。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為熒光定量PCR的反應模板。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中HIF-1α的核苷酸序列設計熒光定量引物為：HIF-1α-F： 5-GGTTCTCACAGATGATGGTG-3;HIF-1α-R： 5-CTCGGCTAGTTAGGGTACAC-3。同時以GAPDH為內(nèi)參：GAPDH-F： 5-CATCACCATCTTCCAGGAG-3;GAPDH-R： 5-GCTGATGATCTTGAGGCTG-3。根據(jù)熒光定量PCR試劑盒配置反應體系，并加入96孔熒光定量PCR板中，設置如下反應程序：95℃預變性，5min;95℃變性30s;58退火30s;72℃延伸30s，40個循環(huán)，72℃延伸5min，繪制溶解曲線。反應結(jié)束后采用ABI 7500 fast system熒光定量PCR分析軟件分析HIF-1α的mRNA相對表達水平。

1.4 HIF-1α蛋白免疫組化檢測：組織標本經(jīng)常規(guī)脫水，透明，包埋，切片后，將組織切片在二甲苯中浸泡2次，每次5min。然后依次在無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇梯度酒精中處理3min，蒸餾水沖洗5min。然后將切片置于檸檬酸鹽緩沖液中加熱煮沸10min，蒸餾水沖洗3次，每次3min。在切片上滴加3%過氧化氫溶液并孵育10min。蒸餾水沖洗3次，每次3min。滴加按說明書比例進行稀釋的HIF-1α抗體，4℃孵育過夜。第二日PBS洗3次，每次6min。滴加二抗，室溫孵育1h，PBS洗3次，每次6min。DAB顯色液顯色約2～8min，自來水沖洗。蘇木精染色液染色1～2min，自來水沖洗10min。1%鹽酸酒精分化3s，自來水洗3min。在75%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇梯度酒精中脫水，每次3min，二甲苯中浸泡2次，每次3min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察HIF-1α染色結(jié)果。

結(jié)果判定：每張切片隨機選擇3個視野，根據(jù)細胞染色強度和陽性細胞率綜合評分。染色強度評分標準：0分為不著色，1分為淡黃色，2分為黃色，3分棕黃色或褐色。陽性細胞率評分標準：0分表示陽性細胞率<5%，1分表示陽性細胞率5%～25%，2分表示陽性細胞率25%～50%，3分表示陽性細胞率50%～75%，4分表示陽性細胞率>75%。兩者相加，0～2分為陰性表達，3～7分為陽性表達。

1.5 HIF-1α相關細胞因子Western blot檢測：取適當大小組織樣品按說明書比例加入RIPA裂解液，使用勻漿器將組織充分裂解，12 000g離心5min，取上清，加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴10min，SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入用5%脫脂奶粉進行稀釋的HIF-1α、TGF-β、E-cadherin、VEGF及GAPDH抗體，4℃孵育過夜。次日PBST洗3次，每次8min。然后加入用5%脫脂奶粉進行稀釋的HRP標記的二抗，室溫孵育1h，PBST洗3次，每次8min，ECL化學發(fā)光顯色法檢測上述蛋白的表達情況。

1.6 統(tǒng)計學方法：采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x?±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 ?結(jié)果

2.1 HIF-1αmRNA的表達水平比較：采用常規(guī)PCR及瓊脂糖凝膠電泳對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量、HIF-1α和GAPDH熒光定量PCR引物進行特異性檢測。結(jié)果顯示，以逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，HIF-1α和GAPDH的引物擴增條帶單一，擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與NCBI序列相符，可用于熒光定量PCR實驗。熒光定量統(tǒng)計結(jié)果顯示，與正常組織中HIF-1αmRNA相對表達水平（0.29±0.03）相比，增生性瘢痕組織中HIF-1α的mRNA相對表達水平（1.45±0.16）顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1。

2.2 HIF-1α蛋白表達水平比較：免疫組化染色結(jié)果顯示，HIF-1α蛋白主要定位于細胞核與胞漿中。正常組織中HIF-1α的陽性表達率為8.54%（7/82），而增生性瘢痕組織中HIF-1α的陽性表達率為70.7%（58/82），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2。

2.3 HIF-1α相關細胞因子蛋白表達水平比較：Western blot結(jié)果顯示，與正常組織相比，增生性瘢痕組織中HIF-1α、TGF-β、VEGF蛋白表達水平顯著增加，而E-cadherin蛋白表達水平則顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖3。

3 ?討論

增生性瘢痕的發(fā)展涉及眾多細胞因子對成纖維細胞增殖、凋亡及細胞外基質(zhì)的合成、降解的精準調(diào)控。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是目前公認的與創(chuàng)傷愈合密切相關的重要細胞因子。受外界創(chuàng)傷刺激，TGF-β與其受體結(jié)合，激活TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導通路并介導炎性反應，參與成纖維細胞的增生、細胞外基質(zhì)的沉積以及膠原的分泌等過程[6-7]。瘢痕組織的血管生成是增生性瘢痕發(fā)展中的一種病理失衡，而血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是微血管再生的中心調(diào)控因子，可通過促進瘢痕組織血管生成而促進成纖維細胞的增殖及膠原合成，并加速瘢痕增生[8]。Ⅱ型上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）可使上皮/表皮細胞的極性發(fā)生改變，表皮細胞標記蛋白如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達下調(diào)，波形蛋白（Vimentin）、成纖維細胞特異性蛋白（FSP-1）等間質(zhì)細胞標志蛋白表達上調(diào)，部分上皮細胞離開上皮層分化為成纖維細胞，在細胞外基質(zhì)的重建以及傷口收縮中發(fā)揮重要作用[9-10]。結(jié)締組織生長因子（CTGF）是TGF-β的下游效應物，具有誘導成纖維細胞增殖、細胞外基質(zhì)沉積以及血管形成的生物學效應，在多種纖維化或增生性疾病中表達上調(diào)。

HIFs是由α和β亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，包括HIF-1，HIF-2，HIF-3這3種亞型，它們含有相同的HIF-β亞基，HIF-1α，HIF-2α，HIF-3α則是具有生物活性的功能亞基[11]。HIF-1和HIF-2是細胞缺氧應答中的重要調(diào)控因子，在各組織中的表達及信號通路的調(diào)控上存在著一定的差異[12]。HIF-1在HIF-1α的濃度可直觀顯示細胞氧含量變化，正常狀態(tài)下通過泛素化-蛋白酶體通路降解，很難檢測到它的存在;低氧狀態(tài)下HIF-1α的降解受到抑制并累積，與HIF-1β形成有活性的HIF-1蛋白，調(diào)控VEGF、TGF-β、表皮生長因子受體（EGFR）、TNF-α、促紅細胞生成素（EPO）、SNAIL、E-cadherin、間質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）等60多個基因的轉(zhuǎn)錄及表達[13-14]。研究顯示HIF-1α的表達與大多數(shù)實體腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及不良預后密切相關[15-16]。

筆者研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，燒傷患者增生性瘢痕組織中HIF-1αmRNA及蛋白表達水平均顯著增加，表明增生性瘢痕組織確實處于缺氧狀態(tài)。同時，與正常組織相比，增生性瘢痕組織的VEGF及TGF-β的蛋白表達水平顯著上升，而E-cadherin的蛋白表達則顯著下降。這說明HIF-1α在缺氧反應的基因表達調(diào)控中起著重要作用，通過啟動或抑制下游基因的表達和轉(zhuǎn)錄，參與早期病理性瘢痕的發(fā)生發(fā)展。其可能的機制是瘢痕組織的增生使患處耗氧量增加，過度增生的膠原纖維結(jié)節(jié)反而阻礙了組織的氧氣交換，同時瘢痕組織受強烈的炎性反應造成氧化應激失衡并分泌大量生長因子，啟動機體創(chuàng)傷修復。炎性細胞的耗氧量劇增使瘢痕組織更易形成缺氧環(huán)境，HIF-1α大量表達。HIF-1α的上調(diào)激活TGF-β/Smad、Wnt、PI3K/Akt等多條信號通路，導致VEGF、EGFR、Vimentin、CTGF等靶基因的大量轉(zhuǎn)錄表達，并下調(diào)E-cadherin的表達，促進瘢痕組織的上皮間質(zhì)化、血管生成、成纖維細胞的增殖及膠原的合成等，而膠原纖維的增加又反過來加重組織的缺氧，如此循環(huán)加速了增生性瘢痕的早期發(fā)展。有學者也證明了HIF-1α在瘢痕疙瘩中表達存在上調(diào)現(xiàn)象[17]。

綜上所述，HIF-1α及其缺氧通路調(diào)控機制在增生性瘢痕組織的發(fā)生機制中發(fā)揮重要作用，可為臨床增生性瘢痕的防治提供重要的參考價值。

[參考文獻]

[1]Singer AJ，Thode HC Jr，McClain SA.Development of a histomorphologic scale to quantify cutaneous scars after burns[J].Acad Emerg Med，2000，7（10）：1083-1088.

[2]Del Toro D，Dedhia R，Tollefson TT.Advances in scar management：prevention and management of hypertrophic scars and keloids[J].Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg，2016，24（4）：322-329.

[3]Ogawa R，Akaishi S，Kuribayashi S，et al.Keloids and hypertrophic scars can now be cured completely：recent progress in our understanding of the pathogenesis of keloids and hypertrophic scars and the most promising current therapeutic strategy[J].J Nippon Med Sch，2016，83（2）：46-53.

[4]Halligan DN，Murphy SJ，Taylor CT.The hypoxia-inducible factor（HIF）couples immunity with metabolism[J].Semin Immunol，2016，28（5）：469-477.

[5]Kumar V，Gabrilovich DI.Hypoxia-inducible factors in regulation of immune responses in tumour microenvironment[J].Immunology，2014，143（4）：512-519.

[6]Makboul M，Makboul R，Abdelhafez AH，et al.Evaluation of the effect of fractional CO2 laser on histopathological picture and TGF-β1 expression in hypertrophic scar[J].J Cosmet Dermatol，2014，13（3）：169-179.

[7]Wang X，Gao Z，Wu X，et al.Inhibitory effect of TGF-β peptide antagonist on the fibrotic phenotype of human hypertrophic scarfibroblasts[J].Pharm Biol，2016，54（7）：1189-1197.

[8]Kwak DH，Bae TH，Kim WS，et al.Anti-vascular endothelial growth factor（bevacizumab） therapy reduces hypertrophic scarformation in a rabbit ear wounding model[J].Arch Plast Surg，2016，43（6）：491-497.

[9]Lamouille S，Xu J，Derynck R.Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2014，15（3）：178-196.

[10]Lee WJ，Park JH，Shin JU，et al.Endothelial-to-mesenchymal transition induced by Wnt 3a in keloid pathogenesis[J].Wound Repair Regen，2015，23（3）：435-442.

[11]Nath B，Szabo G.Hypoxia and hypoxia inducible factors：diverse roles in liver diseases[J].Hepatology，2012，55（2）：622-633.

[12]Cavadas MAS，Cheong A，Taylor CT.The regulation of transcriptional repression in hypoxia[J].Exp Cell Res，2017，356（2）：173-181.

[13]Dengler VL，Galbraith M，Espinosa JM.Transcriptional regulation by Hypoxia inducible factors[J].Crit Rev Biochem Mol Biol，2014，49（1）：1-15.

[14]Taylor CT，Colgan SP.Regulation of immunity and inflammation by Hypoxia in immunological niches[J].Nat Rev Immunol，2017，17（12）：774-785.

[15]Hatfield SM，Kjaergaard J，Lukashev D，et al.Systemic oxygenation weakens the hypoxia and hypoxia inducible factor 1α-dependent and extracellular adenosine-mediated tumor protection[J].J Mol Med （Berl），2014，92（12）：1283-1292.

[16]Barsoum IB，Smallwood CA，Siemens DR，et al.A mechanism of hypoxia-mediated escape from adaptive immunity in cancer cells[J].Cancer Res，2014，74（3）：665-674.

[17]Wulandari E，Jusman SW，Moenadjat Y，et al.Expressions of collagen I and III in hypoxic keloid tissue[J].Kobe J Med Sci，2016，62（3）：e58-e69.

[收稿日期]2018-12-13

本文引用格式：周榮華，薛強東，吳麗芳，等.HIF-1α蛋白在燒傷后增生性瘢痕組織中的表達及臨床意義[J].中國美容醫(yī)學，2019，28（5）：73-76.