結(jié)腸腺瘤性息肉病患者的家系調(diào)查及APC預(yù)測性基因檢測研究*

方瑞華，汪昭明，邱小倩，祝瑋曄，葛賽，王成龍,6，邱耕，高顯華，徐曉東，邢俊杰，王顥，張衛(wèi)，于恩達(dá)△，趙子夜△

1 上海長海醫(yī)院肛腸外科/遺傳性結(jié)直腸癌篩查防治中心 上海 200433

2 上海長海醫(yī)院消毒供應(yīng)科 上海 200433

3 上海長海醫(yī)院口腔科 上海 200433

4 上海長海醫(yī)院眼科 上海 200433

5 北京腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科暨北京市腫瘤防治研究所消化腫瘤內(nèi)科 北京 100142

6 解放軍第73集團(tuán)軍醫(yī)院消化內(nèi)科 福建廈門 361003

7 上海鑒研生物技術(shù)有限公司 上海 201400

結(jié)腸腺瘤性息肉病（colonic adenomatous polyposis，CAP）或稱家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis，F(xiàn)AP），是最常見的遺傳性息肉病型結(jié)直腸癌綜合征[1]，其臨床特征可歸納為數(shù)十枚至上千枚不等的結(jié)腸腺瘤性息肉伴或不伴有多種結(jié)腸外表現(xiàn)，以及顯著增加的結(jié)直腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)已明確，該臨床綜合征實(shí)際包含由多種致病基因?qū)е碌牟煌瑔位蜻z傳病[2]。檢索孟德爾遺傳病在線數(shù)據(jù)庫（OMIM）可發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AP 1～4型被分別定義為由APC、MutYH、NTHL1、MSH3基因變異導(dǎo)致的四種不同的遺傳綜合征，其中由APC基因變異導(dǎo)致的FAP 1型（OMIM175100）是臨床醫(yī)師最為熟悉的類型。

遺傳性疾病多有家族史，但受到認(rèn)識不足和條件限制的影響，家系調(diào)查的開展?fàn)顩r尚不理想。北歐諸國在FAP 患者群體中開展的大規(guī)模調(diào)查肯定了家系調(diào)查和早診早治的價(jià)值[3-4]，也增強(qiáng)了我們在國內(nèi)積極開展此項(xiàng)工作的信心。尤為值得注意的是，當(dāng)家系變異得以明確之后，尚未發(fā)病的家系風(fēng)險(xiǎn)成員即可通過基因檢測驗(yàn)證是否攜帶家系變異（即預(yù)測性基因檢測）從而明確其是否存在發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，為進(jìn)一步提早確定監(jiān)測對象提供了可能。鑒于上述工作尚未在國內(nèi)廣泛開展，筆者前期開展了關(guān)于CAP患者對基因檢測態(tài)度及其影響因素的橫斷面調(diào)查，在對比歐美同類研究的基礎(chǔ)上初步明確了我國CAP患病群體的特點(diǎn)[5-7]。在前述研究的基礎(chǔ)上，本研究意在通過報(bào)告筆者所在研究團(tuán)隊(duì)在預(yù)測性基因檢測方面的經(jīng)驗(yàn)，填補(bǔ)國內(nèi)此項(xiàng)實(shí)踐數(shù)據(jù)的空白。

1 病例與方法

1.1 研究支持

上海長海醫(yī)院遺傳性結(jié)直腸癌篩查防治中心（以下簡稱“本中心”）由肛腸外科、消化內(nèi)科、病理科、生殖醫(yī)學(xué)中心等專業(yè)科室共同組成，負(fù)責(zé)進(jìn)行遺傳性結(jié)直腸癌的家系調(diào)查等工作。以本中心為依托，系統(tǒng)性梳理、登記患者及其家系信息，并最終確定符合本研究要求的CAP 家系。本研究所涉及內(nèi)容均獲得上海長海醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 病例篩選

此項(xiàng)橫斷面調(diào)查數(shù)據(jù)篩選截止時(shí)間為2023 年7月31 日。研究者通過檢索本中心數(shù)據(jù)，確定具有明確APC基因致病變異的先證者作為調(diào)查對象。此類患者的遺傳學(xué)診斷稱為FAP 1 型或APC相關(guān)息肉?。ˋPC-associated polyposis，AAP）。

預(yù)測性基因檢測對象必須為AAP 患者的無癥狀親屬。研究者關(guān)注的相關(guān)癥狀包括慢性腹瀉、便血和結(jié)腸外表現(xiàn)（胃—十二指腸息肉、甲狀腺癌、骨瘤、硬纖維瘤、肝母細(xì)胞瘤等）。這些受檢者未接受過結(jié)腸鏡檢查，因此尚不清楚是否患有CAP。同時(shí)，結(jié)合預(yù)測性基因檢測的臨床指導(dǎo)意義，本研究進(jìn)一步限定預(yù)測性基因檢測對象為家系先證者的平輩或晚輩親屬。

1.3 研究流程

本研究部分工作基于本中心前期開展的CAP 患者遺傳咨詢及基因檢測意愿調(diào)查[7]。參與前期研究的CAP患者均通過微信手機(jī)應(yīng)用（weixin.qq.com，深圳騰訊科技有限公司）完成了電子問卷，有效完成問卷的部分受訪者接受了本中心提供的APC基因檢測，檢測標(biāo)本為外周血白細(xì)胞或口腔黏膜標(biāo)本，檢測方法為Sanger 測序，由上海邁浦生物技術(shù)公司完成。同時(shí)，既往在上海長海醫(yī)院接受治療并保存有生物標(biāo)本的部分患者也納入了此次檢測范圍，檢測標(biāo)本為手術(shù)標(biāo)本中的非腫瘤組織，檢測方法為高通量測序結(jié)合Sanger 測序，由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。此外，上述檢測中未發(fā)現(xiàn)APC基因致病變異的受檢者進(jìn)一步接受了多重連鎖探針擴(kuò)增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA） 分析，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；另有部分受檢者的家系變異于院外檢測發(fā)現(xiàn)。根據(jù)上述檢測過程，最終將在本中心登記信息的CAP 患者區(qū)分為三個(gè)亞群體，分別是AAP、非APC相關(guān)的已知息肉病綜合征（如，MutYH相關(guān)息肉病[8]、BMPR1A相關(guān)息肉病[9]等）和致病基因不明的未分類的CAP。

先證者無癥狀親屬的預(yù)測性基因檢測方法為Sanger 測序（如圖1），檢測標(biāo)本為外周血白細(xì)胞或口腔黏膜標(biāo)本，均由上海鑒研生物技術(shù)有限公司完成。實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)詳見既往報(bào)道[10]。

圖1 AAP家系預(yù)測性基因檢測的APC基因變異峰圖

1.4 指標(biāo)分析

本研究核心指標(biāo)為預(yù)測性基因檢測的變異檢出率，即接受預(yù)測性基因檢測的受檢者總體攜帶家系變異的比例。進(jìn)一步通過設(shè)定不同的受檢年齡上限分別計(jì)算得出變異檢出率，并以此分析檢出率的變化趨勢，重點(diǎn)關(guān)注7 歲、14 歲、18 歲這三個(gè)關(guān)鍵年齡節(jié)點(diǎn)的變異檢出率和僅針對晚輩受檢者的變異檢出率，以探討開展預(yù)測性基因檢測的恰當(dāng)時(shí)機(jī)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以M（QL，QU）表示，計(jì)數(shù)資料以（n）表示。

2 結(jié)果

2.1 一般資料及先證者臨床信息

整理統(tǒng)計(jì)本中心CAP 患者的登記信息，確認(rèn)CAP先證者共450名，其中于本院就診者289名、通過網(wǎng)絡(luò)咨詢者161名。上述先證者中，經(jīng)過本中心基因檢測或院外自主檢測發(fā)現(xiàn)APC基因致病變異從而明確為AAP 的先證者共232 名。研究者通過面對面訪談或網(wǎng)絡(luò)問卷調(diào)查向上述先證者介紹預(yù)測性基因檢測的含義并征求先證者本人意見，最終有65 名家系先證者及130名來自這些家系的平輩或晚輩血緣親屬同意進(jìn)行預(yù)測性基因檢測并簽署知情同意書（電子版）。本研究篩選受檢者的流程如圖2。

圖2 篩選受檢者流程圖

先證者中位年齡為39（32，47）歲，其中男性26 名（40%）；36 名（55.4%）有家族史。先證者中3 名未婚育、1 名已婚未育，其余61 名均已婚育。CAP 表型方面，除7 名無法提供完整的結(jié)腸鏡檢查資料以供評估外，經(jīng)典型和衰減型分別為47名和11 名；共有18 名發(fā)生癌變；在結(jié)腸外腫瘤方面，5 名罹患十二指腸腺瘤（其中1 名為腺癌），2名罹患甲狀腺腫瘤（其中1 名為腺癌）；7 名罹患腹腔或腹膜后硬纖維瘤；另有部分患者被檢查出先天性視網(wǎng)膜色素上皮肥大、骨瘤或異位骨化、小腸腺瘤、胃腺瘤等AAP 相關(guān)結(jié)腸外表現(xiàn)（如圖3、圖4）。

圖3 AAP患者眼底照相檢查所見

圖4 AAP患者口腔錐形束投照CT檢查所見

2.2 預(yù)測性基因檢測的相關(guān)信息及變異檢出率

65名先證者共攜帶49種APC基因胚系變異，其中5種變異重復(fù)出現(xiàn)在16名不相關(guān)的先證者中（c.637C＞T，c.694C＞T，c.3183_3187delACAAA，c.3202_3205del-TCAA，c.3927_3931delAAAGA）（表1）。上述變異中有13種未見于既往報(bào)道，為新發(fā)現(xiàn)的變異，包括1種錯(cuò)義變異（c.6338G＞A），1種剪接位點(diǎn)變異（c.532-1G＞C），3種無義變異（c.784insT、2861T＞G、c.3817A＞T），3 種插入—移碼變異（c.1394insG、c.2670insT、c.3485insT）和5 種缺失—移碼變異（c.1201delA、c.1929_1930delCA、c.2666_2667delAA、c3512delG、c.3998_3999delAA）。APC編碼區(qū)域的無義變異、移碼變異是致病變異的極強(qiáng)證據(jù)（PVS1），根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）標(biāo)準(zhǔn)[11]可判定為致病變異。錯(cuò)義變異和剪接位點(diǎn)變異在綜合人群（不可用）、計(jì)算機(jī)預(yù)測（相同氨基酸改變已被證實(shí)為致病變異/PS1）、功能學(xué)（不可用）、分離（與MAP表型共分離/PP1）、新發(fā)變異（不可用）、其他信息（患者表型高度特異/PP4）等數(shù)據(jù)分析后判定為可能致病變異（1PS+2PP）。

表1 先證者所攜帶的APC基因胚系變異

接受預(yù)測性基因檢測的130名親屬的中位年齡為12（6，24）歲，其中男性61 名，占46.9%。預(yù)測性基因檢測結(jié)果顯示攜帶家系致病變異者為52 名，占40%。限定受檢者年齡上限進(jìn)行分析，以50 歲為整體的年齡上限，每5歲作為一檔，變異檢出率分別為53.8%、48.2%、52.1%、50.6%、47.6%、44.2%、43.0%、41.6%、40.9%、40.3%，隨著受檢者年齡上限的降低，變異檢出率逐漸趨近50%（如圖5）。7歲、14 歲、18 歲這三個(gè)重要年齡節(jié)點(diǎn)的變異檢出率分別為52.6%、52.1%、48.8%。將受檢者限定為先證者的晚輩，則變異檢出率為44.1%（52/118）。

圖5 預(yù)測性基因檢測的變異檢出率隨受檢者年齡改變的變化

3 討論

FAP 1型/AAP（OMIM175100）是一種常染色體顯性腫瘤綜合征，由抑癌基因APC的胚系雜合致病性變異引起[1]。既往報(bào)道的FAP多由各種致病基因不同但臨床表型類似的息肉病綜合征混合組成，總的人群患病率預(yù)計(jì)為（2～3）/10萬[12-14]。Cuthbert Dukes醫(yī)生于1924年在英國圣馬克醫(yī)院（St Mark’s Hospital）建立了世界上最早的息肉病注冊中心，開啟了將家系調(diào)查方法應(yīng)用于CAP防控的先河。目前，歐美發(fā)達(dá)國家已經(jīng)普遍建立了息肉病注冊中心以開展有效的疾病防控。隨著關(guān)于CAP發(fā)病的分子機(jī)制不斷被闡明，諸如APC基因變異檢測的遺傳學(xué)檢測方法開始服務(wù)于CAP的診斷和治療[15]。雖然我國在該領(lǐng)域的臨床實(shí)踐開展較晚且不具備普遍性，但是得益于近十年來的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和技術(shù)進(jìn)步，家系調(diào)查開展情況和基因檢測可及性均已大為改觀。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)近年在CAP的臨床診療、基因檢測[16]及輔助生殖技術(shù)[17]等方面均進(jìn)行了積極的探索。

本中心是在上海長海醫(yī)院近四十年的CAP 診療經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上整合成立的[18-20]，意在建立跨區(qū)域的綜合性服務(wù)體系從而為遺傳性結(jié)直腸癌患者及其家系提供全方位的醫(yī)療服務(wù)。與此同時(shí)，針對CAP 患者的系統(tǒng)性調(diào)查得以基于本中心資源開展。前期開展的CAP患者基因檢測意愿調(diào)查發(fā)現(xiàn)，80.9%的CAP患者已經(jīng)接受或計(jì)劃接受基因檢測，且有61.3%的育有子女的CAP 患者已經(jīng)讓子女或計(jì)劃讓子女接受基因檢測，因?qū)Y(jié)果恐懼而不愿讓子女接受預(yù)測性基因檢測則是阻礙檢測的最主要原因（33.3%）[7]。由此可見，CAP 患者接受預(yù)測性基因檢測的意愿較高，但仍會(huì)因?yàn)閷z測意義和影響的認(rèn)識不足而不能決定是否進(jìn)行檢測。筆者強(qiáng)調(diào)，把人文關(guān)懷滲透到家系調(diào)查和預(yù)測性基因檢測的過程中非常重要，臨床醫(yī)師和遺傳咨詢師需要結(jié)合患者的實(shí)際情況（種族、宗教信仰、職業(yè)、風(fēng)俗習(xí)慣、經(jīng)濟(jì)狀況、家庭關(guān)系等因素）為其提供必要的解釋。

如何確定進(jìn)行預(yù)測性基因檢測的年齡是一個(gè)重要的問題，臨床醫(yī)師和遺傳咨詢師需要結(jié)合患者的實(shí)際情況和變異檢出率的客觀數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合考慮。Levine 等[21]的研究調(diào)查了作為父母的28 名患者對預(yù)測性基因檢測的態(tài)度，總體上來說與我們的研究結(jié)果類似，但該研究的參與者的子女年齡均在10 歲以上，調(diào)查結(jié)果中并未體現(xiàn)出參與者對檢測結(jié)果的擔(dān)憂，而這恰恰是我們的研究反映的主要問題。Kattentidt-Mouravieva 等[22]對13 名年齡低于10 歲的兒童進(jìn)行了FAP相關(guān)的基因檢測，并對相應(yīng)的8位母親或父親進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)預(yù)測性基因檢測對受檢者父母造成心理上或身體上的不利影響。來自St Mark’s Hospital的調(diào)查研究結(jié)果顯示93.5%（58/62）的受訪者選擇在子女出生時(shí)即進(jìn)行預(yù)測性基因檢測，而在告知子女檢測結(jié)果的時(shí)間方面，67.3%（35/52） 的受訪者選擇在子女10～12 歲時(shí)告知，26.9%（14/52）的受訪者選擇在子女13 歲或更年長時(shí)告知[23]。在為數(shù)不多的預(yù)測性基因檢測實(shí)踐結(jié)果中，Johns Hopkins 大學(xué)的檢測研究包含4 個(gè)家系的17 名風(fēng)險(xiǎn)親屬，平均年齡為18.6 歲，變異檢出占比為6/17[24]。相較于既往研究，本研究得益于較大的樣本量，檢測結(jié)果具有較好的穩(wěn)定性，由此認(rèn)為參考價(jià)值相對較大；此外，25 歲及以下受檢群體的變異檢出率已接近50%，表明無癥狀風(fēng)險(xiǎn)親屬在這一年齡范圍內(nèi)接受預(yù)測性基因檢測的結(jié)果預(yù)期是穩(wěn)定的，這極大地糾正了樣本量不足時(shí)信息偏倚而形成的錯(cuò)誤觀念。上述信息可為確定預(yù)測性基因檢測的時(shí)機(jī)提供具有較高價(jià)值的參考依據(jù)。

既往有觀點(diǎn)認(rèn)為可以通過檢查CAP 結(jié)腸外表現(xiàn)以早期確定疾病的存在，比如進(jìn)行眼底檢查或口腔影像學(xué)檢查，檢查方法無創(chuàng)且簡便，但實(shí)踐中存在至少兩方面的限制性：（1）結(jié)腸外表現(xiàn)的外顯率并非100%，難以通過檢查結(jié)腸外表現(xiàn)的存在與否排除受檢者罹患CAP 的可能性；（2）結(jié)腸外表現(xiàn)的識別具有專業(yè)性要求，設(shè)備的檢測性能、使用方法及檢查醫(yī)師識別表型的經(jīng)驗(yàn)均會(huì)影響檢查結(jié)果的判斷。綜合來看，筆者建議此類方法僅用于家系變異未明且不適合進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查的受檢者。

本研究的主要不足之處有以下兩點(diǎn)：（1）家系先證者臨床表型信息存在缺失現(xiàn)象，目前僅能部分確定其CAP 表型，至于上消化道表型及結(jié)腸外表型信息均存在明顯的缺失，這阻礙了對其進(jìn)行表型與基因型、環(huán)境因素的相關(guān)性分析；（2）預(yù)測性基因檢測對象的臨床隨訪信息存在缺失現(xiàn)象，目前僅有6名先證者親屬在預(yù)測性基因檢測后進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查明確發(fā)病，其中3名加入了本中心“CAP內(nèi)鏡強(qiáng)化治療計(jì)劃”并接受密切的結(jié)腸鏡治療和隨訪，其他檢測結(jié)果顯示攜帶家系變異的受檢者尚未接受結(jié)腸鏡檢查或在本中心進(jìn)行后續(xù)信息補(bǔ)充。這一問題也是筆者所在研究團(tuán)隊(duì)關(guān)注的重點(diǎn)問題，隨著隨訪信息的進(jìn)一步收集與完善，我們期待獲得類似北歐同行的研究實(shí)踐結(jié)果，從而進(jìn)一步肯定早診早治對CAP家系的重要意義，并探索“內(nèi)鏡強(qiáng)化治療”是否能夠?qū)崿F(xiàn)CAP 患者的去手術(shù)治療和延遲手術(shù)的安全時(shí)間界限。

結(jié)合本研究結(jié)果認(rèn)為，對于致病變異明確的CAP 家系來說，預(yù)測性基因檢測能夠?qū)崿F(xiàn)致病變異攜帶者的早期確認(rèn)從而實(shí)現(xiàn)早診早治。預(yù)測性基因檢測的變異檢出率整體上呈現(xiàn)出隨著受檢者年齡降低而增加的趨勢，受檢者年齡在25 歲及以下時(shí)的變異檢出率已接近50%，這些數(shù)據(jù)結(jié)果有助于臨床醫(yī)師和受檢者親屬客觀、理性地看待和理解預(yù)測性基因檢測的臨床價(jià)值，從而確定是否需要進(jìn)行預(yù)測性基因檢測及受檢年齡。

利益沖突聲明全體作者均聲明不存在與本文相關(guān)的利益沖突。