乳腺癌細胞及其外泌體的拉曼表型快速鑒定與關系研究

路文靜, 方亞平, 林太鳳, 王惠琴, 鄭大威, 張 萍

北京工業(yè)大學環(huán)境與生命學部, 北京 100124

引 言

外泌體(exosome)是由細胞主動釋放的小膜泡, 直徑大小為30～150 nm, 包含大量由母細胞分泌的功能性蛋白質、 核酸、 脂類等多種生物活性物質[1-2]。 不同細胞來源的外泌體其內容物不一樣, 行使不同的功能。 有研究表明, 腫瘤細胞來源的外泌體含有腫瘤特異性的分子, 成為一種新興的生物標志物, 可以作為癌癥檢測的一個重要指標, 對于診斷和預后有著重要應用價值[2]。 外泌體是母細胞的縮影。 與常規(guī)的單標志物檢測腫瘤相比, 外泌體檢測是綜合性信息的體現(xiàn), 能有效反映母細胞的生理、 病理特征。 因此, 外泌體在液體活檢領域具有重要的應用潛力, 有望成為癌癥快速檢測的手段之一。

表面增強拉曼光譜(surface enhanced Raman spectroscopy, SERS)是分子振動光譜, 可從分子水平上探測物質的精細結構和信息變化, 具有“指紋圖譜”的特征[3]。 作為一種非侵入式的檢測方法, 拉曼檢測對樣品損傷小, 能快速、 靈敏地獲取分子的豐富指紋信息, 同時測量不受水的影響, 在生命科學研究領域具有廣闊的應用前景。 最近有研究報道, 采用SERS技術對胞外囊泡和外泌體進行快速檢測, 從而達到鑒別癌癥的目的[4-8]。 SERS檢測主要有標記檢測和非標記檢測。 Fan等通過將拉曼報告分子與賴氨酸偶聯(lián)實現(xiàn)了外泌體拉曼信號的精確控制, 提高了檢測的靈敏度, 該生物傳感器能夠成功監(jiān)測小鼠模型中的術后腫瘤復發(fā), 并將癌癥患者與健康受試者區(qū)分開[4]。 Li等構建的高靈敏度SERS 探針檢測系統(tǒng), 可以直接定量分析真實樣品中的特定外泌體, 對于胰腺癌的早期診斷具有巨大潛力[5]。 然而, 標記的方法是基于特征標記的檢測, 基底合成過程復雜, 因此限制了臨床應用, 尤其是即時檢測。 有研究表明, 采用無標記SERS檢測能夠收集外泌體的信號, 從而實現(xiàn)對不同來源外泌體的鑒別和分類, 采用的手段有單粒子自動拉曼捕獲分析的SPARTA系統(tǒng)[6], 磁性表面增強拉曼散射平臺[7]等。 Wang等開發(fā)的微流控拉曼生物芯片則是在原位分離和分析外泌體, 已成功應用于臨床血清樣本中外泌體的檢測, 這種新型工具具有作為前列腺臨床外泌體分析工具的潛力[8]。

目前, 大多數(shù)的研究報道是通過分別檢測外泌體或者細胞來實現(xiàn)癌癥的鑒別。 外泌體由母細胞分泌而來, 二者之間在光譜上是否有一些相關性尚未見文獻報道。 本研究將以此為出發(fā)點, 首先采用非標記、 直接檢測的方法, 收集乳腺癌細胞及其外泌體的SERS信號, 同時結合多元統(tǒng)計分析, 建立不同類型乳腺癌細胞及其外泌體的判別模型, 并從拉曼組學角度探究外泌體與母源細胞的相關性, 為乳腺癌的快速診斷與篩查提供有效的技術手段, 為臨床應用奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 材料

細胞培養(yǎng): 人正常乳腺上皮細胞MCF-10A和乳腺癌細胞MCF-7, MDA-MB-231購自國家實驗細胞資源共享平臺(National Infrastructure of Cell Line Resource, NICR)。 MCF-10A和MCF-7在DMEM/High Glucose培養(yǎng)基中培養(yǎng), MDA-MB-231則用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng), 并補充10%無外泌體的胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素, 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 SERS檢測

納米金溶膠(colliodal Au nanoparticles, AuNPs)采用化學還原法合成[9], 其在532 nm處有最大吸收峰, 金顆粒的平均粒徑約為(50±12) nm。 以金溶膠為增強基底, 采用顯微共聚焦拉曼光譜儀(Renishaw, inVia, UK)收集細胞和外泌體的SERS信號。

單細胞SERS檢測: 制備細胞懸液滴加至放有石英玻片的培養(yǎng)皿中, 于37 ℃, 5% CO2條件下培養(yǎng)4 h, 待細胞貼壁后補加新鮮的培養(yǎng)液2 mL。 待細胞密度長至70%左右時, 取出石英玻片并用PBS清冼3遍, 滴加100 μL AuNPs進行檢測。 檢測條件為785 nm, 1 200 l·mm-1光柵, 1% (1 mW)激光功率, 積分時間20 s, 積分1次, 光譜分辨率為2 cm-1。

外泌體SERS檢測: 按常規(guī)方法培養(yǎng)細胞, 待細胞長到60%～70%后, 更換新鮮DMEM培養(yǎng)基, 添加10%無外泌體胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素, 在恒溫37 ℃、 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育48 h。 待細胞鋪滿瓶壁90%后, 取5 mL細胞培養(yǎng)上清液。 按照差速離心結合超速離心方法進行外泌體收集[10]。 取3 μL外泌體提取液與3 μL AuNPs混合后滴加到石英玻片上立即檢測。 檢測條件為: 功率0.5% (0.5 mW) , 積分時間為10 s, 其余同上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)用激光共聚焦拉曼光譜儀(Renishaw)配置的Wire 4.1軟件(inVia)進行預處理, 從原始光譜中去除宇宙射線, 并進行基線校正, 以減少熒光背景和儀器噪聲的干擾。 通過Savitsky-Golay平滑算法對數(shù)據(jù)進行平滑處理, 采用Origin (2018)軟件進行繪圖, 使用SPSS 26.0和SIMCA 14.1軟件進行多元統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2.1 基于SERS技術快速檢測乳腺癌細胞及其外泌體

采用差速離心結合超速離心的方法獲得細胞來源的外泌體, 呈圓盤狀, 平均粒徑主要為110 nm, 與文獻報道一致[7-8]。 如圖1所示, 以AuNPs為增強基底, 將外泌體與AuNPs混合后直接收集其信號, 在10s內可以獲得其拉曼圖譜, 分別采集了乳腺癌細胞MDA-MB-231、 MCF-7和乳腺上皮細胞M-10A來源的外泌體SERS圖譜35張[圖2(a)]。 在圖2(a)中, 彩色實線為35組數(shù)據(jù)的平均值, 灰色區(qū)域為標準偏差, 三組外泌體的標準偏差分別為2.13%、 3.82%和3.57%, 說明該方法具有較高的重現(xiàn)性。 外泌體在500～1 600 cm-1波段范圍內有特征拉曼信號, 特征峰清晰顯著, 不同外泌體的峰形、 峰位置不同, 說明該方法具有較高的特異性和靈敏度。 由于所采用的共聚焦顯微拉曼光譜儀的光斑面積為1.8 μm×30 μm, 能覆蓋整個外泌體, 因此收集的拉曼光譜信號是外泌體整體信息的呈現(xiàn)。 同樣, 分別采集了乳腺癌細胞 MDA-MB-231、 MCF-7和乳腺上皮細胞M-10A的SERS圖譜40、 48和59張, 繪制其平均圖譜, 標準偏差分別為9.14%、 12.50%和8.37%[圖2(b)]。

圖1 乳腺癌細胞及外泌體SERS檢測流程Fig.1 Detection process of breast cancer cells and their exosomes by SERS

圖2 乳腺癌細胞及外泌體SERS圖譜(a): M-231、 MCF-7和M-10A細胞來源的外泌體的SERS圖譜; (b): 三組細胞的SERS圖譜; (c): 外泌體與細胞的SERS平均圖譜Fig.2 SERS profiles of breast cells and exosomes(a): SERS of exosomes derived from M-231, MCF-7 and M-10A cells; (b) SERS of M-231, MCF-7 and M-10A cells; (c): Average SERS of exosomes and breast cells

為了比較外泌體與細胞的整體特征, 本實驗共采集255 780組數(shù)據(jù)。 將外泌體與細胞的拉曼數(shù)據(jù)分別取平均值, 繪制SERS平均圖譜, 如圖2(c)所示, 外泌體與細胞的誤差分別是9.97%和11.34%。 從圖2中可以清晰地看到, 外泌體在650～760 cm-1波數(shù)范圍內, 特征峰信號更強, 峰更加尖銳, 尤其是735 cm-1, 該特征峰歸屬于核酸振動。 除此之外, 特征峰963和1 318 cm-1在外泌體中的信號也較強。 這可能是因為外泌體結構相較于細胞而言更為簡單, 生物大分子的信息更容易被展現(xiàn)。 綜上, 采用直接檢測的方法簡單、 無需標記, 顯著縮短了SERS信號的收集時間, 短短幾十秒即可獲得細胞和外泌體的整體生化信息, 且信號穩(wěn)定, 是所采集樣品的整體信號的呈現(xiàn), 為腫瘤快檢提供一種新的研究思路。

2.2 乳腺癌細胞及其外泌體模型判別分析

將收集的所有SERS數(shù)據(jù)進行正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA)和主成分線性判別分析(principal component analysis-linear discrimination analysis, PCA-LDA), 將光譜數(shù)據(jù)轉化成模型更直觀地呈現(xiàn)。 OPLS-DA和PCA-LDA均是無監(jiān)督學習算法。 OPLS-DA將變量從255 780減少到5個預測主成分(t), 占總變量的85.17%。 以t1(18.21%)和t2(18.41%)繪制得分散點圖, 如圖3(a)所示每一個點均代表一個樣本, 可以看出三株細胞樣本與外泌體樣本可以完全區(qū)分開來。 同時, 三株細胞來源的外泌體也能夠100%區(qū)分, 說明將外泌體與細胞的SERS數(shù)據(jù)混合時, 仍然具有很強的區(qū)分度。 從圖3(a)中可以看出, 三株細胞樣本聚集在了一起, 提示三株細胞的相似性高, 共性更強。

圖3 乳腺癌細胞及外泌體的散點圖分析(a): 乳腺癌細胞及外泌體的OPLS-DA分析; (b): 乳腺癌細胞與正常細胞的PCA分析; (c), (d): 乳腺癌細胞的PCA分析與OPLS-DA分析Fig.3 Scatter plot of breast cancer cells and their exosomes(a): OPLS-DA model of breast cells and their exosomes; (b): PCA model of breast cancer cells and normal cells; (c), (d): PCA model and OPLS-DA model of different types of breast cancer cells

采用PCA分析, 對非腫瘤細胞(M-10A細胞)和癌細胞(MCF-7和M231)進行進一步的鑒別, 提取特征值大于1的主成分, 以PC3和PC4作圖, 可以看出乳腺癌細胞和乳腺上皮細胞被有效的聚集成兩類, 說明該模型能夠將乳腺癌細胞與正常細胞區(qū)分開來, 準確率為83.7%[圖3(b)]。 乳腺上皮細胞主要聚集在PC3大于0且PC4小于1的區(qū)域, 根據(jù)PC3載荷圖提取特征信息, 發(fā)現(xiàn)乳腺上皮細胞與乳腺癌細胞在732～738、 753～761、 996～1 037、 1 317～1 367和1 567～1 568 cm-1等波段存在差異。

為了進一步區(qū)分不同類型的癌細胞, 采用PCA-LDA和OPLS-DA分析, 對兩株乳腺癌細胞進行建模判別。 以60組拉曼圖譜作為訓練集建立分類模型, 結果如圖3(c)和(d)所示, PCA-LDA和OPLS-DA模型中的大部分樣本落在95%的置信區(qū)間(橢圓區(qū)域), 只有少數(shù)幾個樣本落在置信區(qū)間以外。 但在PCA-LDA模型中, 有一些樣本存在重疊, 而OPLS-DA模型則將MCF-7和M231細胞100%進行了歸類。 以18組MCF-7細胞和10組M231細胞的SERS數(shù)據(jù)作為測試集, 在上述建立的判別模型中進行Cross-validation驗證。 PCA-LDA和OPLS-DA判別模型對MCF-7細胞和M231細胞的判別準確度分別為82.12%和85.71%(表1), 表明兩個模型均適用于不同類型乳腺癌細胞的鑒別, OPLS-DA模型的靈敏度和特異度更高。 該結果說明OPLS-DA模型更適合對不同類型的癌細胞進行判別, 同時也提示將SERS技術與OPLS-DA分析相結合有望成為揭示細胞異質性規(guī)律的有利工具。

2.3 乳腺癌細胞及其外泌體的SERS圖譜比較

為進一步探索外泌體與其母源細胞SERS圖譜的相關性, 將每株細胞及其外泌體進行PCA分析, 提取主成分, 根據(jù)PC1載荷圖信息, 選取Loading value大于等于0.7的值進行特征提取[圖4(a, c, e)], 得出三株細胞與其外泌體的差異波段, 如圖4(b, d, f)中的紅色標記。 對比分析圖4(b, d, f), 不難發(fā)現(xiàn), 在650～760、 1 200～1 300和1 400～1 500 cm-1等波段, 三組外泌體的SERS信號均相較其細胞更強, 峰更典型, 峰歸屬見表2。 說明這些波段所代表的核酸、 蛋白質等信息在外泌體里更容易被表征, 這可能與外泌體的結構更為簡單有關。

表2 乳腺細胞與其外泌體的特征峰歸屬與比較Table 2 Attribution and comparison of the characteristic peaks of breast cells and their exosomes

圖4 乳腺細胞及其外泌體的SERS圖譜比較(a) M-10A細胞及其外泌體的PC1載荷圖及(b) SERS圖譜比較; (c) M-231細胞及其外泌體的PC1載荷圖及(d) SERS圖譜比較; (e) MCF-7細胞及其外泌體的PC1載荷圖及(f) SERS圖譜比較Fig.4 Comparison of SERS profiles of breast cells and their exosomes(a) PC1 loading plot and (b) Comparison of Raman spectra between M-10A cell and exosome; (c) PC1 loading plot and (d) Comparison of Raman spectra between M-231 cell and exosome; (e) PC1 loading plot and (f) Comparison of Raman spectra between MCF-7 cell and exosome

細胞與外泌體之間存在許多相似的波段, 如506～569、 580～638、 748～847 cm-1等[圖4(b, d, f)黑色標記], 這些波段中既有代表核酸的特征峰, 也有代表蛋白質、 脂質的特征峰, 峰歸屬見表2, 這些特征峰不是很強, 所代表的物質可能屬于細胞和外泌體的基礎組成成分, 這些相一致的特征峰說明了外泌體的“母源性”。

外泌體作為腫瘤新型標志物, 在SERS圖譜上呈現(xiàn)出與其母源細胞相似的一些信息, 這些信息主要歸屬于核酸、 蛋白質、 脂質等物質。 外泌體與細胞在650～760、 1 200～1 267、 1 300～1 336 cm-1等波段呈現(xiàn)出差異。 通過對乳腺癌細胞和外泌體的SERS快速檢測與比較, 可以將二者之間的“相關性”更直觀地呈現(xiàn)出來, 為探究外泌體在腫瘤微環(huán)境以及腫瘤的侵襲與轉移中的作用提供新的視角。

3 結 論

以金溶膠為增強基底, 采用非標記、 直接檢測的方法對乳腺癌細胞及其外泌體進行SERS圖譜的采集, 該方法簡單、 靈敏、 快速、 無需標記, 收集到的圖譜信號穩(wěn)定, 是所采集樣品的整體信號的呈現(xiàn)。 結合多元統(tǒng)計分析, 可以實現(xiàn)不同類型乳腺癌細胞的分類和鑒別。 進一步對外泌體與其母細胞SERS圖譜進行對比分析, 發(fā)現(xiàn)二者在650～760、 1 200～1 300和1 400～1 500 cm-1等波段存在差異; 在506～569、 580～638、 748～847和1 010～1 070 cm-1等波段存在相似性。 這些“異同”信息提示SERS技術可以從光譜學的角度解析外泌體與母細胞之間的相關性, 進而為探究腫瘤微環(huán)境以及癌癥轉移性提供一種新方法。 外泌體的SERS檢測在體外檢測方面具有巨大的應用潛力, 可為癌癥的快速篩查和早期診斷提供技術指導, 為臨床應用奠定基礎。