響應面法優(yōu)化酶輔助堿法提取香榧餅粕蛋白工藝研究

廖暉，吳峰華

(浙江農林大學，浙江 杭州 311300)

香榧(Torreyagrandiscv. Merrili)又稱榧子、真榧、細榧等，紅豆杉科榧樹屬常綠喬木，為我國珍稀經濟樹種之一，已有1 300多年的栽培歷史。香榧是一種營養(yǎng)價值較高的堅果，其食用部位為種仁，研究表明，香榧種仁中油脂含量高達42.61%～54.39%，其中80%為不飽和脂肪酸[1]；蛋白質含量為10.43%～14.29%，含有17種氨基酸，且必需氨基酸總量約占總氨基酸含量的40%[2-3]。香榧餅粕是香榧子制油后產出的副產物，通常用于動物飼料和農業(yè)肥料，經濟效益低。但冷榨餅粕壓榨條件溫和，色澤淺、抗營養(yǎng)因子含量低、蛋白變性程度低，是一種極具開發(fā)價值的優(yōu)質蛋白質資源。

目前，堿法是提取植物蛋白主要方法之一，具有操作簡單、效率高、低成本等優(yōu)點。堿溶液不僅能破壞細胞壁，引起纖維素和半纖維素組分和結構的改變，而且可以增加蛋白質的溶解度[4]。但傳統(tǒng)堿法容易引起氨基酸結構的變化，使蛋白質變性，從而造成蛋白質的營養(yǎng)品質和必需氨基酸含量的下降，并且隨著pH值、溫度和提取時間的增加而加劇[5-6]。酶法輔助提取蛋白質是通過糖酶降解細胞壁中的多糖，破壞細胞骨架結構，增加細胞內蛋白質的溶出[7]。研究表明，酶輔助堿法具有提取能耗低、回收率高、溶劑用量少、對蛋白破壞程度小等特點[8-9]。本研究以香榧餅粕為原料，考察纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶等細胞壁降解酶對蛋白質提取率的影響，比較堿法與酶輔助堿法所提取蛋白的優(yōu)劣。在此基礎上，優(yōu)化酶輔助堿法提取蛋白工藝，旨在開發(fā)出一條綠色高效的高品質蛋白制備新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香榧產自浙江麗水市松陽縣三都鄉(xiāng)水竹村；植物提取復合酶制劑(主要包含纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等，純度≥99%)，購自成都萬象宏潤生物科技有限公司；果膠酶(30 000 U·g-1)、木聚糖酶(100 000 U·g-1)、纖維素酶(10 000 U·g-1)、半纖維素酶(5 000 U·g-1)，購自上海麥克林生化科技有限公司；石油醚(分析純，沸點30～60 ℃)、氫氧化鈉(分析純)、鹽酸(分析純)、考馬斯亮藍R-250(分析純)，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TDL-40B-Ⅱ低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；PHSJ-3F 實驗室pH計，上海精密科學儀器有限公司；LC-ES-60SH 電動攪拌器，上海力辰邦西儀器科技有限公司；T6 新世紀型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；AL104 電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；FD-1A-80冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；GL-3250C磁力攪拌器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；質譜儀，AutoflexⅢ型，日本島津儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理方法

將香榧剝殼后，取香榧仁進行冷榨。餅粕處理方法：將香榧餅粕粉碎成粉后過60目篩，加入5倍的石油醚，在室溫下用磁性攪拌器攪拌提取2 h，然后將其過濾、棄去上清液后收集沉淀，以上過程重復操作3次后所得的沉淀物在室溫下置于通風櫥揮干1 h后得脫脂粉。然后放入45 ℃的烘箱中干燥，使其含水量下降至5%后放入塑封袋放置于4 ℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 香榧蛋白提取工藝

酶輔助堿法提取工藝流程：香榧餅粕粉末(4 g)→添加蒸餾水(料液比1∶10)→調節(jié)pH→加酶→一定溫度水浴攪拌(100 r·min-1)酶解→95 ℃滅酶10 min→調節(jié)溶液pH值至9→50 ℃水浴攪拌(100 r·min-1)提取1 h→離心(8 000 r·min-1，10 min)分離→香榧蛋白提取液。

堿法提取工藝流程：香榧餅粕粉末(4 g)→添加蒸餾水(料液比1∶10)調節(jié)溶液pH至9→50 ℃水浴攪拌(100 r·min-1)提取3.5 h→離心(8 000 r·min-1，10 min)分離→香榧蛋白提取液。

1.3.3 蛋白提取率的計算

蛋白質含量采用凱氏定氮法進行測定，蛋白提取率按以下公式計算：

Y=100m1/m2。

式中，Y為提取率，%；m1為提取液蛋白質量，g；m2為香榧粕蛋白質量，g。

1.3.4 酶預處理輔助堿法單因素試驗

酶的篩選：控制料液比為1∶10，酶添加量為1.0%，酶解時間2 h，堿提時間1 h，比較纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、復合酶制劑在其最適酶解pH值和溫度條件下的蛋白提取率，優(yōu)選提取率高的酶進行單因素試驗及響應面優(yōu)化設計。

優(yōu)選出最優(yōu)酶后，分別對4個單因素進行梯度試驗。包括：酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、酶解溫度(10、20、30、40、50 ℃)、酶解pH(4.4、4.7、5.0、5.3、5.6)和酶解時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)。

1.3.5 蛋白提取響應面試驗

在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken試驗原理，采用響應面分析法進行優(yōu)化，以蛋白提取率為指標，設計四因素三水平的響應面試驗(表1)。

表1 響應面實驗設計因素與水平

1.3.6 氨基酸含量分析

采用GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》，略作修改。將100 mg樣品與10 mL 6 mol·L-1鹽酸放入水解管中混合，滴加苯酚2～3滴，搖勻封口。密封的水解管在110 ℃下水解22 h。水解后，將水解液轉移至比色管中進行稀釋和振動混勻。準確吸取水解液1.0 mL，置于60 ℃真空干燥箱中干燥，干燥后用1 mL水溶解殘渣，重復操作兩次。在液相色譜儀分析樣品之前，需要進行衍生化。最后采用高效液相色譜儀進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實驗3次重復，實驗結果以n±SD表示，采用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理和圖形繪制，Design-Expert 8.0.6.1用于響應面試驗設計及分析，使用SPSS 24.0 中的單因素Tukey 檢驗進行顯著性分析(P<0.05 表示差異顯著)。

2 結果與分析

2.1 最優(yōu)酶的篩選

植物細胞壁主要由纖維素和多糖類物質組成，蛋白質被纖維類物質包裹在其中。利用細胞破壁酶處理植物組織，可降解植物細胞壁的纖維素骨架，使植物細胞壁崩潰，細胞壁內的有效成分游離，提高胞內物質的提取率[10]。由圖1可知，在相同條件下，木聚糖酶對香榧蛋白的提取率最高，較半纖維素酶高了10.8百分點，較纖維素酶和混合酶制劑的提取率高了24.1百分點和27.9百分點，果膠酶提取率最低，比木聚糖酶低了35.6百分點。故選擇木聚糖酶作為最優(yōu)酶進行試驗。

同組柱上無相同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)，圖2～5同。

2.2 提取工藝單因素試驗結果

2.2.1 木聚糖酶添加量對蛋白提取率的影響

由圖2可知，隨著酶添加量的增加，蛋白質提取率不斷增加，當添加量為1.0%時提取率達到最高，為68.9%。這是因為隨著木聚糖酶添加量的增加，酶濃度增大，酶與底物接觸機會相應增大，提高蛋白提取效率。但當木聚糖酶添加量超過1%后，蛋白提取率開始下降，這是因為過量的酶濃度作用，酶會將底物包裹而減少了酶解作用[11]。故選擇酶的添加量為1.0%。

圖2 木聚糖酶添加量對蛋白提取率的影響

2.2.2 溫度對蛋白提取率的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，蛋白提取率升高，在50 ℃時達到最高點，提取率為71.4%。這是因為木聚糖酶受外界溫度變化影響大[12]。在低溫時，酶活性會被抑制，導致提取率較低，在未達到最適溫度時，隨著溫度增加，被活化的分子數(shù)增加，分子間反應幾率增加，促進酶促反應。但當溫度超過50 ℃時，蛋白提取率反而下降。這是因為高溫條件會造成酶的失活，影響蛋白提取率。此外，溫度過高會引起蛋白質發(fā)生熱變性，部分溶解的蛋白質會發(fā)生交聯(lián)聚合，蛋白質的溶解度降低使得蛋白質得率降低[13]。故選擇酶解提取溫度為50 ℃為宜。

圖3 提取溫度對蛋白提取率的影響

2.2.3 pH值對蛋白提取率的影響

由圖4可知，pH值對蛋白提取率的影響呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。當pH值較低時，蛋白質提取率隨著pH值增大而增大，當pH值達到5.0時，提取效果最佳，為70.3%。這是因為木聚糖酶在最適pH值時，酶活性強，有利于細胞壁的破裂，pH值偏高或偏低均使酶活性減弱，影響提取率[14]。故酶解pH值選擇5.0為宜。

圖4 pH值對蛋白提取率的影響

2.2.4 酶解時間對蛋白提取率的影響

由圖5可知，在酶解時間0.5～2.0 h時，蛋白提取率隨著時間的增加呈顯著上升趨勢，這是因為隨著時間的延長木聚糖酶與底物反應逐漸完全[15]，當時間達到2.0 h時，提取率達到了65.1%；當酶解時間為3.0 h時，蛋白提取率為68.5%，僅比2.0 h的提取率增加了3.4百分點。綜合考慮生產效率和蛋白質得率來看，繼續(xù)延長時間對蛋白提取意義不大，而且還會隨著時間的增加導致蛋白質變性，發(fā)生凝集沉淀[16]，因此選擇酶解時間為2.0 h。

圖5 酶解時間對蛋白提取率的影響

2.3 提取工藝響應面試驗結果

選擇木聚糖酶添加量、酶解溫度、酶解pH值、酶解時間為響應因素，蛋白提取率為響應值，運用Box-Behnken試驗設計原理，進行響應面試驗，試驗結果見表2。

表2 香榧蛋白提取Box-Behnken實驗設計及結果

設木聚糖酶添加量為A，酶解溫度為B，酶解pH值為C，酶解時間為D，對表2試驗數(shù)據(jù)進行逐步回歸多次擬合，可得提取率(Y)二次多項式方程：

Y= 75.16+4.08A+0.20B+3.73C-2.76D-2.83AB+0.060AC+0.10AD-4.35BC-5.78BD+0.68CD-4.26A2-9.33B2-6.29C2-8.86D2。

由表3可知，提取率的回歸模型極顯著(P<0.001)；失擬項F值為3.66，表明模型擬合度良好，能較好解釋響應中的變異。同時模型的決定系數(shù)R2=0.982 7，說明模型擬合程度良好，該模型能解釋98%響應值的變化；校正決定系數(shù)R2Adj=0.965 5，說明試驗結果有96.55%受試驗因素的影響；失擬項P值不顯著(0.111 2>0.05)，說明試驗無失擬因素存在，表明預測值與實測值之間具有高度相關性，殘差均由隨機誤差引起。因此，可以用此回歸模型對蛋白提取率進行分析和預測。

方差分析中的顯著性檢驗可以判斷自變量對因變量的影響。由表4和圖6可知，B、C和D對蛋白提取率的影響極顯著(P<0.01)，而A影響不顯著(P>0.05)；模型中的交互項BC和BD對蛋白提取率的影響極顯著(P<0.000 1)，AB影響高度顯著(P<0.01)，而AC、AD和CD影響不顯著(P>0.05)；模型中的二次項A2、B2、C2和D2對蛋白提取率的影響均達極顯著水平(P<0.000 1)。

圖6 不同因素對香榧蛋白提取率影響的響應面圖

表4 蛋白質中氨基酸含量組成 單位：mg·g-1

通過Design-Expert 8.0.6.1軟件對回歸模型進行數(shù)學分析獲得最佳工藝為木聚糖酶添加量1.26%、酶解溫度48.85 ℃、酶解pH值5.10、提取時間2.45 h，在此條件下，預測的蛋白提取率最大理論值為76.97%。

2.4 香榧蛋白提取驗證實驗

為了方便實際操作，將條件調節(jié)為木聚糖酶添加量1.30%、酶解溫度49 ℃、酶解pH 值5.1、提取時間2.5 h，并結合料液比1∶10(g·mL-1)，pH 9.0堿提1 h，對香榧餅粕中蛋白進行提取驗證試驗。3次平行試驗得到實際平均蛋白提取率為76.13%，與理論值相比，其相對誤差為1.09%，小于5%，因此，該法優(yōu)化得到的蛋白提取工藝條件準確可靠，且與堿提3.5 h蛋白提取率(77.82%)效果相當，有效減少了堿提時間，可以作為工業(yè)化應用的依據(jù)。

2.5 蛋白質中氨基酸含量分析

蛋白質中的必需氨基酸含量的高低及構成比例直接反映了蛋白質的優(yōu)劣[17]。對兩種方法提取的蛋白質中的氨基酸組成進行了分析，由表4可知，酶輔助堿法與堿法所提取的蛋白中均含有此次檢測的17種氨基酸，并包含7種必需氨基酸，色氨酸因堿性條件下水解未能檢測出。兩種方法所提取蛋白中的總氨基酸含量相近，必需氨基酸/總氨基酸平均值均高于WHO/FAO的推薦值(36%)，但酶輔助堿法所提取蛋白中的必需氨基酸/總氨基酸平均值(43.26%)顯著高于堿法所提取的蛋白中的必需氨基酸/總氨基酸平均值(39.58%)。這主要是因為用堿溶解蛋白質時間太長會導致-OH和-SH的脫氫和脫硫，導致一些氨基酸的含量降低[18]。趙素斌等[19]對燕麥麩蛋白的研究中也發(fā)現(xiàn)，與堿法相比，同等條件下酶輔助堿法所提取蛋白的必需氨基酸/總氨基酸更高。因此，酶輔助堿法切實地優(yōu)化了所提取香榧蛋白的營養(yǎng)價值。

3 結論

本文以香榧餅粕作為研究對象，以蛋白提取率為判定標準，從幾種常見的破壁酶中篩選出木聚糖酶為蛋白提取最優(yōu)酶。通過單因素試驗和Box-Behnken設計優(yōu)化，考察了影響蛋白提取率的4個因素，得到的最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶10(g·mL-1)、木聚糖酶添加量1.30%、酶解溫度49 ℃、酶解pH值5.1、酶解時間2.5 h，在此條件下蛋白提取率為76.13%，與堿法所得蛋白提取率接近，但所提取的蛋白較堿法所提取的蛋白更為優(yōu)質。利用酶輔助堿法提取香榧蛋白，方法操作和儀器設備簡單，反應條件溫和，蛋白提取率高?？s短了常規(guī)堿性提取的持續(xù)時間，減少了蛋白質損傷和不期望產物形成的可能，明顯提高了被提取的香榧蛋白的質量。