東方百合兩個(gè)SERKs基因的克隆及表達(dá)分析

鄭梓唯，榮朵艷，廖曉珊，張邦躍

（1.湖南工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖南 株洲 412007；2.百合種質(zhì)資源創(chuàng)新與深加工湖南省工程研究中心，湖南 株洲 412007；3.株洲市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，湖南 株洲 412007）

1 研究背景

體細(xì)胞胚發(fā)生類受體激酶（somatic embryo genesis receptor-like kinases，SERKs） 屬 于 富含亮氨酸重復(fù)序列受體激酶（leucine-rich repeat sequence receptor-like kinases，LRR-RLKs）家族成員[1]，其蛋白結(jié)構(gòu)包含一個(gè)由5 個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）組成的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域[2]。SERK 基因最初是從胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出來(lái)的，并在單細(xì)胞胚胎形成中起重要作用[3]。后來(lái)，陸續(xù)在其他的植物中篩選到SERK 基因家族，例如，擬南芥[4]、水稻[5]、玉米[6]、大麥[7]、小麥[8]、蘋(píng)果[9]等，表明SERK蛋白廣泛地分布在植物中，并在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育及防御反應(yīng)中等方面發(fā)揮重要的作用。

目前，SERK 功能的研究主要是利用模式植物擬南芥來(lái)開(kāi)展的。擬南芥中有5 個(gè)SERKs 家族成員，從AtSERK1～AtSERK5，其中在Col-0 背景下AtSERK1～AtSERK4 具有激酶活性并參與了多種生命活動(dòng)，而AtSERK5 在Ler背景下才具有激酶活性[10]。研究表明，SERK 作為共受體（Coreceptor），與不同的受體蛋白一起感受細(xì)胞外不同的配體分子，形成“配體-受體-共受體”的模式，進(jìn)而激活相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控生命活動(dòng)[11]。分泌肽TPD1（tapetum determinant 1） 與膜受體EMS1（excess microsporocytes 1）胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，EMS1 招募AtSERK1 或AtSERK2 形成異源二聚體，并調(diào)控絨氈層細(xì)胞發(fā)育[12]，進(jìn)而調(diào)控雄配子體的形成，而擬南芥atserk1、atserk2 雙突變表現(xiàn)為雄性不育[13]。AtSERK3， 也稱為BAK1（BRI1-associated receptor kinase 1），能夠在植物激素BR（brassinosteroid，油菜素類固醇）與膜受體BRI1（brassinosteroid insensitive 1）結(jié)合后快速地被招募形成“BR-BRI1-SERK3”復(fù)合物，進(jìn)而調(diào)控BR介導(dǎo)的植物生長(zhǎng)發(fā)育[14]。 除了AtSERK3 外，AtSERK1 和AtSERK4 也在BR信號(hào)中發(fā)揮功能冗余的作用，擬南芥atserk1、atserk3、atserk4 三突變體對(duì)BR處理完全不敏感[15]。AtSERK3 與AtSERK4 一起，還介導(dǎo)了植物的免疫反應(yīng)[16]。AtSERK3 和AtSERK4 能夠分別與膜受體FLS2（flagellin-sensing 2）、EFR（elongation factor-Tu receptor）或PEPR1/2（PEP1 receptor 1/2）形成異源二聚體，并分別感受病原性蛋白flg22（一個(gè)22 個(gè)氨基酸殘基多肽）、elf18（一個(gè)18 個(gè)氨基酸殘基多肽）及植物內(nèi)源多肽Pep1（peptide 1）信號(hào)分子，進(jìn)而起始植物的免疫反應(yīng)[17]。擬南芥atserk3、atserk4 雙突變體持續(xù)激活水楊酸依賴的防御途徑，導(dǎo)致活性氧的持續(xù)生成及幼苗致死[18]。擬南芥AtSERK1～AtSERK4冗余地與受體HAE（HAESA）或HLS2（HAE-like 2）結(jié)合，并共同介導(dǎo)分泌多肽IDA（inflorescence deficient in abscission）調(diào)控的花器官脫落，atserk1、atserk2、atserk3 或atserk1、atserk3、atserk4 三 突變體表現(xiàn)出花器官不脫落的表型[19]。此外，擬南芥SERKs 還參與了調(diào)控其他生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，比如氣孔模式（stomatal patterning）形成[20-21]、根的生長(zhǎng)[22]、脅迫響應(yīng)[11]等。

在其他植物中，也證實(shí)了SERKs 在介導(dǎo)植物生長(zhǎng)發(fā)育及免疫反應(yīng)過(guò)程中的功能保守性。水稻（Oryza sativa）OsSERK2 能夠與免疫受體XA21、XA3 和OsFLS2 互作，參與對(duì)水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）抗性的建立[23-25]。而OsSERK1 和OsSERK2 都能與受體OsBRI1 互作，并介導(dǎo)BR信號(hào)響應(yīng)[24-25]。本生煙草（Nicotianabenthamiana）NbSERK3A 和NbSERK3B 與NbFLS2 互作，并感受病原體分子INF1，進(jìn)而激活細(xì)胞抵御馬鈴薯晚疫病毒（Phytophthorainfestans）的侵染[26-27]。此外，番茄、棉花、土豆等植物SERKs 參與免疫響應(yīng)、配子體發(fā)育、BR響應(yīng)的功能也被發(fā)現(xiàn)[28-29]。

百合是世界上最受歡迎的花卉之一，其花香濃郁、花朵較大、花色多樣[30]。百合的成熟花藥中會(huì)釋放出大量的油性花粉粒，這會(huì)污染花瓣和衣物，降低其商品價(jià)值，因此在銷售前需要采用人工去雄方法去掉未成熟雄蕊。在規(guī)?；a(chǎn)中，百合容易受到真菌、細(xì)菌及病毒等的侵染，嚴(yán)重影響產(chǎn)量及品質(zhì)，降低其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，開(kāi)展百合花粉發(fā)育及抗病分子機(jī)制的研究，以便通過(guò)分子育種生產(chǎn)無(wú)花粉和抗病性強(qiáng)的百合，在生產(chǎn)上具有重要意義[29]。SERKs 已經(jīng)被證實(shí)參與了植物包括雄配子發(fā)育、免疫響應(yīng)等在內(nèi)的多種生命活動(dòng)，目前在百合中并沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。本研究從東方百合“西伯利亞”中克隆到了2 個(gè)SERK 同源基因，分別命名為L(zhǎng)oSERK1 和LoSERK2。利用生物信息學(xué)方法對(duì)LoSERKs 進(jìn)行了分析，同時(shí)采用實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)對(duì)SERKs 在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行了分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步了解百合中SERKs 的功能奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為東方百合“西伯利亞”種，盆栽于湖南工業(yè)大學(xué)百合工程研究中心。植物多糖多酚總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司，PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；PCR 產(chǎn)物磁珠回收試劑盒、無(wú)縫連接試劑盒和M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 購(gòu)買自上海羅氏生物公司。

2.2 總RNA 提取

利用RNA 試劑盒提取“西伯利亞”總RNA，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)（1%瓊脂糖），以總RNA 為模板，利用Oligo dT18 引物和M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA，于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 LoSERKs 的基因克隆

根據(jù)百合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，課題組發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)SERK 同源基因序列，這2 個(gè)基因包含有完整的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），長(zhǎng)度分別是1 875 bp 和1 887 bp，分別命名為L(zhǎng)oSERK1 和LoSERK2。利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)這2 個(gè)基因的特異引物L(fēng)oSERK1-LP/LoSERK1-RP 和LoSERK2-LP/LoSERK2-RP（見(jiàn)表1），用于擴(kuò)增LoSERK1 和LoSERK2 基因cDNA 序列。以cDNA 第一鏈為模板，利用PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶擴(kuò)增LoSERK1和LoSERK2 基因cDNA 序列。PCR 反應(yīng)體系為25 mmol/L dNTP Mixture 2.0 μL，GXL buffer 5.0 μL，GXL DNA Polymerase 0.5 μL，Template 0.3 μL， 正向引物0.7 μL，反向引物0.7 μL，ddH2O 補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃下擴(kuò)增預(yù)變性2 min；98 ℃下擴(kuò)增10 s，60 ℃下擴(kuò)增15 s，68 ℃下擴(kuò)增2 min，進(jìn)行32 個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸5 min，12 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，挑取條帶大小正確的目的片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)通，以確定轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中LoSERK1 和LoSERK2 基因cDNA 序列的正確性。

2.4 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 9.0 對(duì)LoSERK1 和LoSERK2 基因的ORF 及其編碼氨基酸序列進(jìn)行分析；利用NCBI數(shù) 據(jù) 庫(kù) 的BLASTp（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)LoSERK1 和LoSERK2 的同源氨基酸序列進(jìn)行搜索；利用BioEdit 7.0 對(duì)不同物種SERKs 氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，并利用MEGA 11.0 的鄰接法（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)；并用在線軟件NetPhos 3.1（https://services.healthtech.dtu.dk）預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)，使用紐普生物（https://www.novopro.cn/tools/）對(duì)其進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽的預(yù)測(cè)；使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2.5 LoSERKs 的定量分析

提取百合的不同組織，即在西伯利亞百合形成花苞時(shí)取其未開(kāi)的花瓣及未成熟的花藥，迅速液氮速凍，保存至-80 ℃冰箱中。而后等到花瓣完全展開(kāi)后1 d 取其開(kāi)放的花瓣和成熟的花藥并采取葉片，材料液氮速凍后，保存至-80 ℃冰箱中。后文出現(xiàn)兩個(gè)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)不同組織則為此兩個(gè)時(shí)間段材料的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行百合First-Strand cDNA 的合成，根據(jù)LoSERKs 基因的序列，使用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物，以百合β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參，引物序列見(jiàn)表2。

表2 qRT-PCR 分析的引物序列Table 2 Primer sequences for qRT-PCR analysis

將cDNA 母液稀釋10 倍作為qRT-PCR 反應(yīng)體系中的模板，采用qRT-PCR 的技術(shù)檢測(cè)兩個(gè)LoSERKs 基因在百合不同組織中的表達(dá)量。反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq II 10.0 μL，正向引物1.0 μL，反向引物1.0 μL，cDNA 5.0 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20.0 μL。該反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃下10 min；95 ℃下10 s，60 ℃下15 s，72 ℃下20 s，40 個(gè)循環(huán)后繪制熔解曲線，95 ℃下10 s，65 ℃下60 s，72 ℃下20 s。每個(gè)基因做3 次生物學(xué)重復(fù)以及技術(shù)性重復(fù)，添加以無(wú)菌水為模板的空白對(duì)照，按照2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 LoSERKs 基因克隆及序列分析結(jié)果

基于東方百合西伯利亞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，從中篩選出2 個(gè)體細(xì)胞胚發(fā)生類受體激酶SERK 的同源基因。以百合葉片的cDNA 的第一條鏈為模板，分別用特異引物對(duì)LoSERK1-LP/LoSERK1-RP和LoSERK2-LP/LoSERK2-RP 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。獲得LoSERK1 和LoSERK2 基因的cDNA 序列，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示目標(biāo)擴(kuò)增條帶LoSERK1 約為2 200 bp，LoSERK2 約為2 400 bp，這與預(yù)期結(jié)果相符（見(jiàn)圖1，其中M 為DL5000 DNA Maker）。

圖1 LoSERKs 的cDNA 序列PCR 電泳擴(kuò)增Fig.1 PCR electrophoresis amplification of cDNA sequences of LoSERKs

測(cè)序結(jié)果顯示，LoSERK1 和LoSERK2 基因cDNA 序列與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，包含完整ORF序列，其中LoSERK1 基因ORF 全長(zhǎng)為1 875 bp 與編碼624 個(gè)氨基酸殘基（見(jiàn)圖2，其中，圓圈為磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)），LoSERK2 基因ORF 全長(zhǎng)為1 887 bp，編碼628 個(gè)氨基酸殘基（見(jiàn)圖3，其中，圓圈為磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)）。

圖2 LoSERK1 核苷酸與編碼的氨基酸殘基序列Fig.2 LoSERK1 nucleotide and encoded amino acid residues sequence

圖3 LoSERK2 核苷酸與編碼的氨基酸殘基序列Fig.3 LoSERK2 nucleotide and encoded amino acid residues sequence

3.2 LoSERKs 信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用DNAMAM9.0 軟件分析，LoSERK1 蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為68 591.0，平均等電點(diǎn)（PI）為5.35，GC 含量為48.27%；LoSERK2 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為68 933.2，平均等電點(diǎn)（PI）為5.50，GC 含量為47.38%。通過(guò)在線軟件由圖4a 和圖6 知LoSERK1 有信號(hào)肽的概率為：99.32%，信號(hào)肽類型為SP(Sec/SPI)；切割位點(diǎn)：24～25，概率為87.67%信號(hào)肽序列；MAVAERAWFLILVLLLRPIARVSA。由圖4c 可知，LoSERK1 含有一個(gè)跨膜區(qū)，位點(diǎn)在242～262。 由圖4b 可知，LoSERK2 有信號(hào)肽的概率為99.82%，信號(hào)肽類型為SP(Sec/SPI)；切割位點(diǎn)：27～28 的概率為90.90%。信號(hào)肽序列為MAVVEQSSALWFLLLIMLLDPLAKVSA， 由圖4d 可知，LoSERK2 含有一個(gè)跨膜區(qū)，其位點(diǎn)從239～261。LoSERK1 有53 個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖2），LoSERK2 有55 個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖3）。LoSERK1和LoSERK2 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖5所示，兩者以玉米SERK 為模板，使用SWISS-MODEL 進(jìn)行預(yù)測(cè)。發(fā)現(xiàn)其同源相似性高達(dá)90%。也同時(shí)與氨基酸同源序列比對(duì)結(jié)果相似。表明SERK 較為穩(wěn)定，不易突變，保守性高。

圖4 LoSERKs 信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 LoSERKs signal peptide and transmembrane structure prediction

圖5 LoSERKs 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 LoSERKs tertiary structure prediction

3.3 同源性比對(duì)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果

為了研究百合SERK 的氨基酸序列在進(jìn)化過(guò)程中的保守性及多樣性，將LoSERK1 和LoSERK2 氨基酸序列與其他植物的SERKs 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，包括擬南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（Oryza sativa）、 鳳梨（Ananascomosus）、 油棕（Elaeis guineensis）、 茶樹(shù)（Camelliasinensis）、 沉水樟（Cinnamomummicranthum）、可可樹(shù)（Theobroma cacao）。 結(jié)果顯示，LoSERK1 和LoSERK2 的氨基酸序列相似度達(dá)到90.22%，兩者與其他種類的SERKs 氨基酸序列的相似性也比較高，與鳳梨、油棕等單子葉植物的SERKs 氨基酸序列相似程度為92.74～93.21%。與雙子葉植物茶樹(shù)等的相似度也高達(dá)90%（圖6）。

通過(guò)NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure）分析發(fā)現(xiàn)LoSERKs 有兩個(gè)超家族成員，分別為PLN00113 superfamily、PKc_like superfamily（ 見(jiàn)圖6）。其中PLN00113 superfamily 是富含亮氨酸重復(fù)序列區(qū)域（LRR），PKc_like superfamily 為激酶結(jié)構(gòu)域。同時(shí)基于與擬南芥AtSERK1～AtSERK5 和水稻OsSERK1、OsSERK2 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，由圖7可知，LoSERK1 與LoSERK2 分別與水稻的OsSERK1和OsSERK2 相似性較高。

圖7 基于擬南芥、水稻及百合SERKs 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建Fig.7 Construction of SERKs phylogenetic tree based on Arabidopsis thaliana,Oryza sativa and Lilium

3.4 LoSERKs 實(shí)時(shí)定量PCR 分析

為了研究百合SERKs 在花器官中的表達(dá)模式，以百合葉片中LoSERK1、LoSERK2 基因表達(dá)量為1.00，系統(tǒng)比較兩個(gè)LoSERKs 基因在葉子、未開(kāi)放的花瓣、已開(kāi)放的花瓣、未成熟的花藥、已成熟的花藥中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)LoSERKs 基因在不同器官中的表達(dá)量存在差異，LoSERK1 基因（圖8a，其中，L 為葉片；UF 為未開(kāi)放的花瓣；OF 為開(kāi)放的花瓣；IA 為未成熟的花藥；MA 為已成熟的花藥）在未成熟的花藥中的相對(duì)表達(dá)量最高，為葉片中的14.39 倍；其在已開(kāi)放的花瓣中表達(dá)含量也高達(dá)10.76，未開(kāi)放的花瓣和已成熟的花藥中相對(duì)表達(dá)量，分別為4.43 和4.98。LoSERK2 基因（圖8b）在已開(kāi)放的花瓣中的相對(duì)表達(dá)量（4.10）顯著高于葉（1.00）、未成熟的花藥（0.79）、已成熟的花藥（0.44）、未開(kāi)放的花瓣（0.40）；而LoSERK2 基因在未成熟的花藥與已開(kāi)的花藥中的相對(duì)表達(dá)量差異只有0.35；該基因在未開(kāi)的花瓣中的相對(duì)表達(dá)量最低為0.40。

圖8 不同組織中LoSERKs 的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression levels of LoSERKs in different tissues

4 討論

SERK 是植物特有的膜受體激酶，其以共受體的形式和其他膜受體激酶一起形成異源二聚體，共同感受外源或內(nèi)源分子信號(hào)，進(jìn)而激活酶聯(lián)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，例如MAPK信號(hào)通路。由于與SERK互作的受體激酶及信號(hào)分子具有的多樣性，這決定了SERK 激酶參與多元化的生物學(xué)功能，如激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)[17]、雄配子體發(fā)育[13]、花器官脫落等多方面的生理功能[19]。SERK 在植物中廣泛存在，且其介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)控模式在不同植物間具有相對(duì)保守性。例如，介導(dǎo)激素BR（BR-BRI1-SERKs）[14]和病原菌誘導(dǎo)的免疫響應(yīng)（flg22-FLS-SERKs）信號(hào)模式被證實(shí)存在于擬南芥、水稻和番茄中[11]，而調(diào)控花器官脫落的“IDA1-HAE/HSL2-SERKs”信號(hào)模式保守地存在于擬南芥和煙草中[19-20]。通過(guò)對(duì)模式植物中SERK 相關(guān)功能的研究，為其他植物中開(kāi)展SERK功能研究提供了重要參考。

本文基于百合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，克隆了2 個(gè)東方百合SERK 同源基因LoSERK1 和LoSERK2，分別編碼624 和628 個(gè)氨基酸，兩者氨基酸序列相似性非常高，達(dá)90.22%。LoSERK1 和LoSERK2 氨基酸序列與其他植物氨基酸序列相似性很高，例如與AtSERK1、AtSERK2、OsSERK1、OsSERK2 的序列相似性均高于90.28%。同時(shí)LoSERK1 和LoSERK2 氨基酸序列長(zhǎng)度與其他植物中SERKs 氨基酸長(zhǎng)度很接近，例如擬南芥AtSERK1（625）、AtSERK2（628）、OsSERK1（624）、OsSERK2（628）。通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)蛋白具有信號(hào)肽，且預(yù)測(cè)到跨膜結(jié)構(gòu)域，推測(cè)這兩個(gè)蛋白為細(xì)胞質(zhì)膜定位蛋白[21]。在其三級(jí)結(jié)構(gòu)中，LoSERK1 和LoSERK2 均以玉米ZmSERK1為模板進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，其相似程度都為90%以上。此外，LoSERK1 和LoSERK2 的氨基酸序列中都具有5 個(gè)典型的LRR結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域，這表明了SERK 在生物進(jìn)化過(guò)程中的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)研究也表明，LoSERK1 和LoSERK2 與雙子葉擬南芥AtSERK1 和AtSERK2 分為一支，與水稻中的OsSERK1 和OsSERK2 相似，這表明單子葉植物中可能并不存在與雙子葉擬南芥AtSERK3 和AtSERK4 親緣性很近的SERK。單子葉植物中的SERK 數(shù)量可能要少于雙子葉植物，例如水稻、玉米和百合中發(fā)現(xiàn)2個(gè)SERKs，而擬南芥有5 個(gè)[31]、苜蓿有6 個(gè)[32]、蘋(píng)果有12 個(gè)[3]、大豆有25 個(gè)[12]。SERK 受體與其他不同的受體（如BRI1、EMS1、FLS、HAE）一起感受不同的細(xì)胞外信號(hào)分子，進(jìn)而引起受體胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化及轉(zhuǎn)磷酸化，通過(guò)改變受體的激酶活性，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]。在進(jìn)行百合LoSERK1 和LoSERK2 氨基酸序列分析時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了這兩個(gè)蛋白質(zhì)的激酶結(jié)構(gòu)域分別有28 個(gè)和29 個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，這些磷酸化位點(diǎn)可能與胞質(zhì)激酶活性有關(guān)[22]。

百合觀賞性強(qiáng)，但其生產(chǎn)中也面臨一些問(wèn)題，例如，百合花粉量大且容易污染花瓣及衣物、百合花瓣過(guò)早脫落、百合種植過(guò)程中容易染病等，這些都會(huì)影響其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。在擬南芥中AtTPD1 能夠被定位在絨氈層前體細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞質(zhì)膜上的受體激酶AtEMS1 的胞外區(qū)所感知，并快速招募AtSERK1 或AtSERK2，進(jìn)而引起受體間相互磷酸化，將信號(hào)傳遞到下游，最終決定花藥絨氈層的命運(yùn)及雄配子體的發(fā)育[32]，擬南芥atserk1、atserk2 雙突變會(huì)導(dǎo)致雄配子敗育[13]。棉花中GhSERK1 也被發(fā)現(xiàn)能控制花粉發(fā)育，RNAi 干擾GhSERK1 基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致雄性不育的表型[11]。對(duì)不同時(shí)期百合花藥的表達(dá)分析表明，LoSERK1 在未成熟和成熟花藥中的相對(duì)表達(dá)量均高于葉片中，其中未成熟花藥（14倍）和成熟花藥（5倍），而LoSERK2 在花藥中的相對(duì)表達(dá)量略低于葉片中，這暗示LoSERK1 在雄配子體形成過(guò)程中的重要性可能更大。之前研究表明，AtHAE及其同源基因AtHSL2 在花器官分離時(shí)期的離層區(qū)細(xì)胞中表達(dá)[21-22]，AtSERK1～AtSERK4 基因也在花器官離層區(qū)細(xì)胞中有表達(dá)[24]，分泌型小肽AtIDA能被受體激酶AtHAE和AtHSL2 的胞外區(qū)感知[27]，AtHAE/AtHSL2 和共受體AtSERKs形成異源二聚體，通過(guò)磷酸化作用激活下游MKK4/MKK5-MPK3/MPK6，進(jìn)而通過(guò)調(diào)控細(xì)胞壁重塑酶基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控花器官脫落[24,27]。擬南芥AtSERK1～AtSERK4 冗余地參與花器官脫落調(diào)控，其中AtSERK1 發(fā)揮最重要的功能，atserk1、atserk2、atserk3 或atserk1、atserk3、atserk4 三重突變體都會(huì)導(dǎo)致花器官不脫落[17]。兩個(gè)百合LoSERKs 均在已經(jīng)完全開(kāi)放的花瓣中表達(dá)量顯著高于未開(kāi)放花瓣和葉片，由此推測(cè)，LoSERK1 和LoSERK2 可能會(huì)與花器官脫落有關(guān)，但還需要進(jìn)一步證實(shí)。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析結(jié)果，百合與水稻的SERKs 親緣性更近，預(yù)示著LoSERKs 有在免疫反應(yīng)及激素BR響應(yīng)的功能。未來(lái)，利用基因編輯或者RNA 沉默的方法將這兩個(gè)百合SERKs 基因進(jìn)行干擾、敲除或突變，可能會(huì)獲得無(wú)花粉的百合，或者抗病性改變、花器官不脫落、植株生長(zhǎng)改變等新表型的百合材料。

5 結(jié)語(yǔ)

本文基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，對(duì)百合體細(xì)胞胚發(fā)生類受體激酶同源基因LoSERK1 和LoSERK2 進(jìn)行了克隆，并通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其功能，實(shí)時(shí)定量分析其在花器官中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，百合LoSERK1和LoSERK2 分別編碼624 和628 個(gè)氨基酸，且兩個(gè)百合SERKs 在進(jìn)化過(guò)程中具有高度的保守性，主要體現(xiàn)為蛋白質(zhì)胞外LRR重復(fù)單元和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的保守性。百合與水稻的SERKs 之間親緣關(guān)系很近，暗示百合SERKs 可能參與激素BR和免疫響應(yīng)。百合LoSERK1 基因在花藥成熟過(guò)程的表達(dá)量很高，預(yù)示LoSERK1 基因在雄配子形成中發(fā)揮功能。LoSERK1 和LoSERK2 基因在成熟花瓣中的表達(dá)量都很高，推測(cè)兩個(gè)LoSERKs 基因可能參與了花器官的脫落。本研究可為進(jìn)一步開(kāi)展百合SERKs 功能研究及育種應(yīng)用創(chuàng)造條件。