多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)PI3K/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)M2 巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制研究

彭逸倫，李楊，王曉桃，3*

1.541001 廣西壯族自治區(qū)桂林市，桂林醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院

2.541001 廣西壯族自治區(qū)桂林市，桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床試驗(yàn)中心

3.541001 廣西壯族自治區(qū)桂林市，桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科

多發(fā)性骨髓瘤是終末分化的B 淋巴細(xì)胞惡性腫瘤，是第二常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。由于瘤細(xì)胞本身的異質(zhì)性、克隆的演變等導(dǎo)致復(fù)發(fā)而進(jìn)展、治療失敗，其根源在于骨髓微環(huán)境機(jī)制尚未明確［2］。因此迫切需要探索多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病相關(guān)因素及機(jī)制，從而采取有效的預(yù)防策略，降低多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病率。

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）介導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞最近已成為研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)，TME 對(duì)瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)均有重要的作用［3］。巨噬細(xì)胞是炎性細(xì)胞之一，是參與固有免疫的重要細(xì)胞，其表型和功能與多發(fā)性骨髓瘤微環(huán)境相關(guān)，根據(jù)不同的骨髓微環(huán)境（bone marrow microenvironment，BMME）信號(hào)而表現(xiàn)出極高的可塑性和多功能性，一般認(rèn)為有兩種：M1 型，即經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞，具有白介素（interleukin，IL）-12 高/IL-10低的表型，可產(chǎn)生IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，具有明顯促炎和抗腫瘤活性；M2 型，即替代活化的巨噬細(xì)胞，在腫瘤患者中稱(chēng)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associatedmacrophages，TAMs），具有IL-12 低/IL-10 高的表型，表達(dá)CD163、CD204 和CD206，產(chǎn)生IL-10、IL-13 等抗炎因子，具有抑制腫瘤免疫、促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用［4］。TME 中，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2 和MMP9 作為腫瘤的生物標(biāo)志物具有重要功能，可作為腫瘤預(yù)測(cè)指標(biāo)、復(fù)發(fā)指標(biāo)及預(yù)后判斷等，并對(duì)血液腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要意義［5］。

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）通路的異常激活在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為中起著關(guān)鍵作用［6］。急性白血病、慢性白血病、各種類(lèi)型的淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT 通路激活及其下游效應(yīng)。PI3K/AKT 通路激活甚至發(fā)生在腫瘤早期階段，并與多種人類(lèi)癌癥不良預(yù)后和治療耐藥相關(guān)［7］。當(dāng)磷酸酶基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）缺失時(shí)，PI3K/AKT 通路可能會(huì)被激活，這種激活可能會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展。在多發(fā)性骨髓瘤患者中，推測(cè)骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞在BMME 里向M2 極性轉(zhuǎn)變，從而刺激瘤細(xì)胞增殖，導(dǎo)致骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展，復(fù)發(fā)難治。

本研究選取多發(fā)性骨髓瘤患者為研究對(duì)象，探討M2 巨噬細(xì)胞在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達(dá)及PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)M2 巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制，為臨床多發(fā)性骨髓瘤疾病的靶向治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2021 年10 月—2022 年4 月于桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科確診的多發(fā)性骨髓瘤患者48 例為試驗(yàn)組，選取同期健康志愿者（血液內(nèi)科骨髓移植健康供者）30 名為對(duì)照組。本研究已通過(guò)桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)倫理審查（編號(hào)：2021YJSLL-86），研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.1.1 患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)國(guó)際骨髓瘤工作組更新的多發(fā)性骨髓瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為多發(fā)性骨髓瘤［8-9］；（2）年齡≥18 歲。

1.1.2 患者排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性（之前診斷為其他惡性腫瘤的患者）或混合性（同時(shí)診斷為多發(fā)性骨髓瘤和其他惡性腫瘤的患者）多發(fā)性骨髓瘤；（2）合并風(fēng)濕系統(tǒng)的自身免疫性疾病或其他腫瘤性疾??；（3）合并其他造血系統(tǒng)疾病、淋巴組織疾病或?qū)嶓w腫瘤病史；（4）孕婦或哺乳期婦女。

1.2 資料收集

收集多發(fā)性骨髓瘤患者及健康志愿者的相關(guān)臨床特征資料，包括年齡、性別、免疫球蛋白分型、Durie-Salmon 分期、ISS 分期、骨質(zhì)損害程度等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及分組

1.3.1 標(biāo)本處理、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：采集研究對(duì)象空腹外周靜脈血，提取單個(gè)核細(xì)胞，-80 ℃凍存。人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226 和THP-1（均由桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床試驗(yàn)中心提供）進(jìn)行傳代培養(yǎng)。采用佛波酯分化培養(yǎng)THP-1 細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。RPMI8226 細(xì)胞培養(yǎng)并用siRNA 干擾沉默PTEN 處理分成3 組：空白組、siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組和siRNA 對(duì)照組。

1.3.2 蛋白免疫印跡法（Western blot）：RPMI8226 細(xì)胞系采用AKT（艾菲公司）、p-AKT（艾菲公司）、PI3K-p85（艾菲公司）、p-PI3K-p85（艾菲公司）的一抗進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。以β-actin（艾菲公司）作為內(nèi)對(duì)照，采用Western blot 檢測(cè)空白組、siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組、siRNA 對(duì)照組3 組的AKT、p-AKT、PI3K-p85、p-PI3K-p85 蛋白表達(dá)水平。

1.3.3 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：為了證明PI3K/AKT 信號(hào)通道的激活可以提高多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵染水平，將空白組、siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組和siRNA 對(duì)照組的瘤細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)引物（表1），提取RPMI8226 細(xì)胞THP-1 誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞的RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：首先93 ℃預(yù)變性，93 ℃7 min，55 ℃1 min，72 ℃ 1 min，共經(jīng)過(guò)40 次循環(huán)，72 ℃ 7 min。檢測(cè)瘤細(xì)胞MMP2、MMP9 的mRNA，檢測(cè)共培養(yǎng)體系中THP-1 誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞的M2 型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物精氨酸酶1（arginase 1，ARG-1）和IL-10 的mRNA。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 使用引物列表Table 1 List of primers used for real-time quantitative PCR

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)：收集空白組、siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組、siRNA 對(duì)照組3 組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液加入巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系后分為4 組：M0 巨噬細(xì)胞組、瘤細(xì)胞上清液組、siRNA-PTEN 上清液組、siRNA 上清液組。采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤上清液共培養(yǎng)的M2 巨噬細(xì)胞和提取的單個(gè)核細(xì)胞中特異性抗體CD163、CD206、F4/80 表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基本臨床資料

試驗(yàn)組48 例多發(fā)性骨髓瘤患者年齡為65.5（56.8，75.0）歲，其中男25 例（52.1%）、女23 例（47.9%）；免疫球蛋白（Ig）分型：IgA 14 例（29.2%），IgG 25例（52.1%），IgD 3 例（6.3%），其他6 例（12.4%）；Durie-Salmon分期：Ⅰ期5例（10.4%），Ⅱ期7例（14.6%），Ⅲ期36 例（75.0%）；ISS 分期：Ⅰ期9 例（18.8%），Ⅱ期13 例（27.1%），Ⅲ期26 例（54.1%）；骨損害36 例（75.0%）；合并骨質(zhì)破壞25 例（52.1%）。對(duì)照組30 例健康志愿者年齡為58.0（52.0，70.0）歲，其中男12 例（40.0%）、女18 例（60.0%）；異常單克隆免疫球蛋白（M 蛋白）1 例（3.3%）。

2.2 研究對(duì)象外周血M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平

經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，試驗(yàn)組中CD163、CD206 標(biāo)記的M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平為（1.763±0.316），對(duì)照組中CD163、CD206 標(biāo)記的M2 巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平為（0.675±0.244），試驗(yàn)組M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.855，P＜0.001），見(jiàn)圖1。

圖1 研究對(duì)象外周血M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平Figure 1 Expression levels of M2 macrophages in peripheral blood

2.3 siRNA 轉(zhuǎn)染多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞后PTEN mRNA 表達(dá)水平

采用siRNA 轉(zhuǎn)染RPMI8226 細(xì)胞（圖2），并用熒光定量PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。經(jīng)熒光定量PCR 分析，多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的空白組PTEN mRNA 表達(dá)水平為（1.035±0.039），siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組PTEN mRNA 表達(dá)水平為（0.240±0.059），siRNA 對(duì)照組PTEN mRNA表達(dá)水平為（1.091±0.083），3 組PTEN mRNA 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=171.861，P＜0.001）；其中siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組PTEN mRNA 表達(dá)水平低于空白組和siRNA 對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 倒置顯微鏡下RPMI8226 細(xì)胞經(jīng)siRNA 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（熒光染色，×40）Figure 2 The cellular level of RPMI8226 cells transfected with siRNA under inverted microscope

2.4 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞PI3K/AKT 蛋白表達(dá)水平

為了驗(yàn)證多發(fā)性骨髓瘤中PI3K/AKT 通路的激活情況，采用Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的空白組、siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組、siRNA 對(duì)照組的AKT、p-AKT、PI3K-p85、p-PI3K-p85 蛋白表達(dá)水平，見(jiàn)圖3。

圖3 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞PI3K/AKT 蛋白表達(dá)圖Figure 3 Protein expression map of PI3K/AKTin multiple myeloma cells

3 組多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞p-AKT/AKT、p-PI3K-p85/PI3K-p85 蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008）； 其中siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組中p-AKT/AKT、p-PI3K-p85/PI3K-p85 蛋白表達(dá)水平高于空白組和siRNA 對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中PI3K/AKT 蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of protein expression level of PI3K/AKT in multiple myeloma cells

表2 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中PI3K/AKT 蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of protein expression level of PI3K/AKT in multiple myeloma cells

注：AKT= 絲氨酸/ 蘇氨酸激酶，PI3K= 磷脂酰肌醇-3- 激酶；a 表示與空白組比較P＜0.05，b 表示與siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組比較P＜0.05。

組別p-AKT/AKTp-PI3K-p85/PI3K-p85空白組1.070±0.0700.843±0.287 siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組2.051±0.297a1.801±0.111a siRNA 對(duì)照組1.229±0.344b0.950±0.079b F 值11.79524.579 P 值0.008P＜0.001

2.5 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞MMP2、MMP9 的mRNA 表達(dá)水平

3 組多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞MMP2、MMP9 的mRNA 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；其中siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組中MMP2、MMP9 的mRNA 表達(dá)水平高于空白組和siRNA 對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞MMP2、MMP9 的mRNA 表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of the mRNA expression levels of MMP2 and MMP9 in multiple myeloma cells

表3 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞MMP2、MMP9 的mRNA 表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of the mRNA expression levels of MMP2 and MMP9 in multiple myeloma cells

注：a 表示與空白組比較P＜0.05，b 表示與siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組比較P＜0.05。

組別MMP2 mRNAMMP9 mRNA空白組0.979±0.0411.087±0.101 siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組2.089±0.155a2.670±0.439a siRNA 對(duì)照組1.149±0.157b1.176±0.163b F 值63.77731.007 P 值P＜0.001P＜0.001

2.6 THP-1 誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞中M2 巨噬細(xì)胞特異性抗體CD163、CD206、F4/80 表達(dá)水平

4 組M2 巨噬細(xì)胞特異性抗體CD163+F4/80、CD163+F4/80 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；其中與M0 巨噬細(xì)胞組相比，瘤細(xì)胞上清液組、siRNA-PTEN 上清液組和siRNA 上清液組M2巨噬細(xì)胞特異性抗體CD163+F4/80、CD163+F4/80、CD163+F4/80 表達(dá)水平均升高；且siRNA-PTEN 上清液組M2 巨噬細(xì)胞特異性抗體表達(dá)水平高于瘤細(xì)胞上清液組和siRNA 上清液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4、表4。

圖4 THP-1 誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞中M2 巨噬細(xì)胞特異性抗體CD163、CD206、F4/80 表達(dá)水平Figure 4 The expression levels of M2 macrophage-specific antibodies CD163，CD206，and F4/80 induced by THP-1 in differentiated macrophages

表4 THP-1 誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞中M2 巨噬細(xì)胞特異性抗體CD163、CD206、F4/80 表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 4 Comparison of the expression levels of M2 macrophage-specific antibodies CD163，CD206，and F4/80 induced by THP-1 in differentiated macrophages

注：a 表示與M0 巨噬細(xì)胞組比較P＜0.05，b 表示與瘤細(xì)胞上清液組比較P＜0.05，c 表示與siRNA-PTEN 上清液組比較P＜0.05。

組別CD163+F4/80CD206+F4/80 M0 巨噬細(xì)胞組2.900±0.6565.567±1.332瘤細(xì)胞上清液組21.667±0.874a11.033±1.498a siRNA-PTEN 上清液組46.067±1.872ab40.200±1.493ab siRNA 上清液組22.300±2.252ac12.267±1.858ac F 值384.218299.663 P 值P＜0.001P＜0.001

2.7 THP-1 誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞中M2 巨噬細(xì)胞特異標(biāo)志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達(dá)水平

4 組M2 巨噬細(xì)胞特異標(biāo)志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.826，P＜0.001）；其中與M0巨噬細(xì)胞組相比，瘤細(xì)胞上清液組、siRNA-PTEN 上清液組和siRNA 上清液組M2 巨噬細(xì)胞特異標(biāo)志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達(dá)水平均升高；且siRNA-PTEN 上清液組M2 巨噬細(xì)胞特異標(biāo)志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達(dá)水平高于瘤細(xì)胞上清液組和siRNA 上清液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 THP-1 誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞中M2 巨噬細(xì)胞特異標(biāo)志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 5 Comparison of the expression levels of M2 macrophage-specific markers ARG-1 and IL-10 induced by THP-1 in differentiated macrophages

表5 THP-1 誘導(dǎo)分化巨噬細(xì)胞中M2 巨噬細(xì)胞特異標(biāo)志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 5 Comparison of the expression levels of M2 macrophage-specific markers ARG-1 and IL-10 induced by THP-1 in differentiated macrophages

注：a 表示與M0 巨噬細(xì)胞組比較P＜0.05，b 表示與瘤細(xì)胞上清液組比較P＜0.05，c 表示與siRNA-PTEN 上清液組比較P＜0.05。

組別ARG-1 mRNAIL-10 mRNA M0 巨噬細(xì)胞組0.965±0.0941.015±0.099瘤細(xì)胞上清液組2.208±0.379a1.722±0.171a siRNA-PTEN 上清液組4.712±1.122ab3.653±0.601ab siRNA 上清液組2.173±0.298ac1.839±0.199ac F 值19.82634.507 P 值P＜0.001P＜0.001

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是一種終末分化的B 淋巴細(xì)胞惡性腫瘤。BMME 中，漿細(xì)胞的異?？寺≡鲋晨赡茉从跓o(wú)癥狀前體疾病，如意義未明的單克隆丙種球蛋白?。╩onoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS）或冒煙型骨髓瘤（smoldering multiple myeloma，SMM）［10］。這種疾病的主要癥狀包括高鈣血癥、骨疾病、腎功能不全和貧血等。疾病進(jìn)展和隨后的復(fù)發(fā)以亞克隆進(jìn)化和耐藥為特征，幾乎所有患者最終均會(huì)發(fā)展為復(fù)發(fā)和難治類(lèi)型，其進(jìn)展受到TME 影響顯著［11］。因此，研究多發(fā)性骨髓瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞在疾病發(fā)生、進(jìn)展中的機(jī)制，并轉(zhuǎn)化為臨床治療作用具有重要意義。

本研究選取多發(fā)性骨髓瘤患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，M2 巨噬細(xì)胞表達(dá)水平在多發(fā)性骨髓瘤患者中相比健康志愿者上調(diào)（P＜0.001），與許多國(guó)內(nèi)外研究相一致［12-13］。在多種癌癥中，腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌M2 樣細(xì)胞因子，如IL-10、趨化因子配體（CCL）2/3/4/5/7/8、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和血小板細(xì)胞衍生生長(zhǎng)因子（PDGF），這些因子可以吸引更多的單核細(xì)胞和M0 巨噬細(xì)胞，并將其轉(zhuǎn)化為M2 表型。大多數(shù)腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出M2 表型，并與一些惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)［14］。在TME 中，TAMs 最常出現(xiàn)在M2 樣的腫瘤前表型中［14］。有研究表明，多發(fā)性骨髓瘤患者中TAMs 明顯增多，提示患者具有不良預(yù)后［15］。TAMs 的極化過(guò)程可能由骨髓瘤微環(huán)境內(nèi)的瘤細(xì)胞調(diào)控，其表型比例隨多發(fā)性骨髓瘤進(jìn)展而發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)展的早期階段，皮膚中M1 TAMs 在黑色素瘤中轉(zhuǎn)移為M2 表型，M2 巨噬細(xì)胞的存在與不良預(yù)后相關(guān)［16-17］。有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性骨髓瘤患者體內(nèi)TAMs增強(qiáng)與多發(fā)性骨髓瘤進(jìn)展有關(guān)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性骨髓瘤患者體內(nèi)存在M2 巨噬細(xì)胞高表達(dá)。因此，需要進(jìn)一步探討多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中導(dǎo)致M2 巨噬細(xì)胞極化并促進(jìn)骨髓瘤進(jìn)展的機(jī)制。

回顧既往關(guān)于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和瘤細(xì)胞遷移、侵襲、增殖的相關(guān)研究，TAMs 對(duì)腫瘤細(xì)胞幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性，并促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖［19-20］。在TME 中，TAMs 和腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。體外研究證實(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞通過(guò)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）上調(diào)巨噬細(xì)胞中補(bǔ)體應(yīng)答基因32（RGC-32）的表達(dá)，RGC-32 促進(jìn)巨噬細(xì)胞的遷移，進(jìn)一步加速結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖［21］。通過(guò)體外共培養(yǎng)TAMs 和CT26結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TAMs 調(diào)控的氧化應(yīng)激可以影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，并且癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致90%以上患者死亡的主要原因［22-23］。許多研究表明，TAMs的促腫瘤作用可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。通過(guò)MAPK 活化蛋白激酶2（MK2），TAMs 可以分泌單核細(xì)胞趨化蛋白MCP1 和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1α 和2α，這些蛋白質(zhì)可以誘導(dǎo)體外惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和入侵，并且促使癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)化［24］。通過(guò)調(diào)節(jié)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶的活性，TAMs 可以有效抑制活性氧（ROS）的產(chǎn)生，進(jìn)而維持TME 的氧化還原平衡，進(jìn)而有效促使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［25］。

因此，本研究就多發(fā)性骨髓瘤中PI3K/AKT 通路活化能否導(dǎo)致瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)進(jìn)行了驗(yàn)證。MMP2 和MMP9 作為腫瘤生物標(biāo)志物有重要功能，可作為腫瘤預(yù)測(cè)指標(biāo)，對(duì)血液腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要意義，MMP2 和MMP9 高表達(dá)提示腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，疾病進(jìn)展。本研究采用熒光定量PCR 檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物MMP2、MMP9 的mRNA 表達(dá)水平，其在siRNA-PTEN 實(shí)驗(yàn)組表達(dá)水平中較空白組和siRNA 對(duì)照組均上調(diào)（P＜0.001），表明PI3K/AKT 通路激活促進(jìn)瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)。

結(jié)合本課題組的前期研究結(jié)果和國(guó)內(nèi)外研究，本研究發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤中M2 巨噬細(xì)胞極化與PI3K/AKT 通路的活化相關(guān)［26-27］，并進(jìn)行驗(yàn)證。采用熒光定量PCR 檢測(cè)，siRNA-PTEN 上清液組通路激活后M2巨噬細(xì)胞特異性抗體CD163+F4/80 和CD206+F4/80 表達(dá)水平相對(duì)瘤細(xì)胞上清液組和siRNA 上清液組均上調(diào)（P＜0.05）；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2 巨噬細(xì)胞特異標(biāo)志物ARG-1、IL-10 的mRNA 表達(dá)水平，在siRNAPTEN 上清液組中表達(dá)水平較瘤細(xì)胞上清液組和siRNA上清液組均上調(diào)（P＜0.001）；表明多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中PI3K/AKT 通路激活促進(jìn)M2 巨噬細(xì)胞極化。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)了多發(fā)性骨髓瘤患者體內(nèi)M2 巨噬細(xì)胞增多，在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中可能是通過(guò)激活PI3K/AKT 通路促進(jìn)M2 巨噬細(xì)胞極化。本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)具有系統(tǒng)性創(chuàng)新特色，明確了PI3K/AKT 信號(hào)通路在MM 骨髓微環(huán)境中參與CD163、CD206 陽(yáng)性的M2 型巨噬細(xì)胞極性改變的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)臨床中對(duì)多發(fā)性骨髓瘤疾病的靶向治療有指導(dǎo)意義。

作者貢獻(xiàn)：王曉桃提出研究思路，設(shè)計(jì)研究方案，負(fù)責(zé)論文起草、最終版本的修訂，對(duì)論文負(fù)責(zé)；彭逸倫進(jìn)行研究過(guò)程的實(shí)施，包括進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)，熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，調(diào)查對(duì)象的選取、樣本的采集等；李楊負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、采集、清洗和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等。

本文無(wú)利益沖突。