普托馬尼對利福平依賴結(jié)核菌感染小鼠的作用及其機制研究*

蒲冬梅，倪慧敏

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科，四川 成都 610072； 2.鷹潭市余江區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，江西 鷹潭 335000）

結(jié)核病是由抗結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis, MTB）感染引起的慢性傳染疾病，主要侵犯肺，近年來發(fā)病率逐年升高[1]。隨著菌株的不斷變異、耐藥，結(jié)核菌逐漸出現(xiàn)了依賴現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為在某種藥物特定的濃度范圍內(nèi)，結(jié)核桿菌生長更快，對該藥物具有一定的依賴作用[2-3]。有研究顯示，依賴現(xiàn)象中利福平（Rifampicin, RFP）依賴率最高[4]。目前結(jié)核桿菌對臨床常用藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性或依賴性，治療成功率較低，因此為有效防控結(jié)核病，研發(fā)療效顯著、安全性高的新型抗結(jié)核藥物意義重大[5]。普托馬尼（Pretomanid, PA-824）是硝基咪唑類的一種，對MTB 有較高的特異性，對抗結(jié)核有自己獨特的作用機制[6-7]。目前國內(nèi)關(guān)于該藥物的臨床數(shù)據(jù)較少，本研究通過復(fù)制RFP依賴結(jié)核菌感染小鼠模型，探究PA-824 對RFP 依賴結(jié)核菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級、6～8 周齡Balb/c 雄性小鼠32 只，體重18～23 g，平均（20±2）g，購自上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2021-0005，實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2019-049。結(jié)核分枝桿菌RFP 依賴株購自北京結(jié)核病防治所。

1.2 主要試劑與儀器

RFP（國藥準(zhǔn)字H13024622，北京中新藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.15 g），普托馬尼（美國Tb Alliance公司，劑量：0.2 g），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（安徽雷根生物技術(shù)有限公司）。

羅氏培養(yǎng)基（上海卡邁舒生物科技有限公司）。輪轉(zhuǎn)式切片機（型號：S700A，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型復(fù)制及分組 將結(jié)核分枝桿菌RFP 依賴株于改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)4 周后挑取完整菌落，充分研磨成勻漿后進行比濁，制成濃度1 mg/mL 的菌懸液，采用濾膜（孔徑8 μm）過濾后，置于-70 ℃環(huán)境下保存，采用活菌計數(shù)法計算1 mL 菌懸液中的菌數(shù)。將菌懸液室溫解凍，進行梯度稀釋，根據(jù)菌數(shù)配置成1×106CFU/mL 的溶液，每只小鼠尾靜脈注射0.2 mL，復(fù)制RFP 依賴結(jié)核病小鼠模型[8]。

將32 只小鼠隨機分為4 組：RFP 治療組、PA-824 治療組、聯(lián)合治療組及對照組，每組8 只。RFP治療組給予RFP 65 mg/（kg·d），PA-824 治療組給予PA-824 25 mg/（kg·d），聯(lián)合治療組給予RFP 65 mg/（kg·d）和PA-824 25 mg/（kg·d）[9]。對照組給予等量生理鹽水，每周采取灌胃的方式給藥2 次，治療6 周，每日觀察并記錄小鼠的生理狀況。

1.3.2 脾、肺組織重量 給藥第43 天，每組取4 只小鼠，稱重后處死，在無菌環(huán)境下解剖，取小鼠肺、脾組織，用電子天平進行稱重，記錄脾、肺組織重量。

1.3.3 臟器致病指數(shù)評分 肺、脾稱重后，肉眼觀察小鼠臟器病變程度，采用單盲法根據(jù)小鼠臟器致病指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)[10]。評分細則見表1。

1.3.4 肺組織RFP 依賴性 稱重后取左肺于研磨器中研磨至勻漿，進行10 倍梯度稀釋（1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5），每組分別取上述濃度于匡氏培養(yǎng)基在36.5 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，每周觀察菌株RFP 依賴性，3 周后進行菌落計數(shù)。

1.4 HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化

治療結(jié)束后，將剩余小鼠全部處死，在無菌環(huán)境下解剖，取小鼠肺組織，置于10%中性甲醛溶液中脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，在顯微鏡下觀察每組小鼠肺組織病理學(xué)變化，并估算病變部分在切片中的占比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺、脾組織重量比較

對照組、聯(lián)合治療組、RFP 治療組、PA-824 治療組肺、脾組織重量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，RFP 治療組肺、脾組織重量升高，PA-824 治療組和聯(lián)合治療組的肺、脾重量降低（P＜0.05）；與聯(lián)合治療組比較，RFP 治療組和PA-824 治療組的肺、脾組織重量升高（P＜0.05）；與RFP 治療組比較，PA-824 治療組的肺、脾組織重量降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠肺、脾組織重量比較 （n =4，g，±s）

表2 各組小鼠肺、脾組織重量比較 （n =4，g，±s）

注 ： ①與對照組比較，P ＜0.05 ；②與聯(lián)合治療組比較，P ＜0.05；③與RFP治療組比較，P ＜0.05。

脾組織重量0.219±0.033 0.121±0.025①0.286±0.035①②0.179±0.020①②③23.327 0.000組別對照組聯(lián)合治療組RFP治療組PA-824治療組F值P值肺組織重量0.284±0.022 0.195±0.047①0.353±0.035①②0.241±0.024①②③17.612 0.000

2.2 各組小鼠臟器致病指數(shù)評分比較

對照組、聯(lián)合治療組、RFP 治療組、PA-824 治療組臟器致病指數(shù)評分分別為（61.12±15.08）、（26.84±6.26）、（57.06±13.37）、（40.76±10.35）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.189，P=0.005）。與對照組比較，PA-824 治療組和聯(lián)合治療組臟器致病指數(shù)評分降低（P＜0.05）；與聯(lián)合治療組比較，RFP治療組、PA-824 治療組臟器致病指數(shù)評分升高（P＜0.05）；與RFP 治療組比較，PA-824 治療組臟器致病指數(shù)評分降低（P＜0.05）。

2.3 各組小鼠肺組織菌株RFP依賴性比較

對照組、聯(lián)合治療組、RFP 治療組、PA-824 治療組脾、肺菌量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，RFP 治療組脾、肺菌量均增多，PA-824 治療組和聯(lián)合治療組脾、肺菌量均減少（P＜0.05）；與聯(lián)合治療組比較，RFP 治療組和PA-824 治療組脾、肺菌量均升高（P＜0.05）；與RFP治療組比較，PA-824 治療組脾、肺菌量均減少（P＜0.05）。見表3 和圖1。

表3 各組小鼠肺組織菌株RFP依賴性比較（n =4，lg CFU，±s）

注 ： ①與對照組比較，P ＜0.05； ②與聯(lián)合治療組比較，P ＜0.05；③與RFP治療組比較，P ＜0.05。

肺菌量4.88±0.27 4.25±0.14①6.25±0.44①②4.49±0.11①②③42.840 0.000組別對照組聯(lián)合治療組RFP治療組PA-824治療組F 值P 值脾菌量3.19±0.17 2.62±0.17①4.06±0.45①②2.87±0.11①②③23.184 0.000

2.4 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化

對照組小鼠肺組織出現(xiàn)大范圍滲出性病變，程度嚴重，肺泡組織明顯遭到破壞，肺泡腔中性粒細胞、蛋白液大量滲出，部分病灶出現(xiàn)局部干酪樣壞死，病變范圍約為80%；RFP 治療組小鼠肺組織同樣有大量滲出性病變，局部伴有干酪樣壞死，但部分病灶部位為肉芽腫病變，病變范圍為70%～80%。經(jīng)PA-824 治療后，小鼠肺組織部分病變，滲出性病變明顯減少，以肉芽腫性病變?yōu)橹鳎∽兎秶鸀?0%～50%；聯(lián)合治療組病理學(xué)改變同PA-824 治療組，病變范圍約為20%。見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織病理切片 （HE染色×200）

3 討論

隨著對結(jié)核菌的深入了解，多數(shù)臨床上的結(jié)核菌株對RFP、異煙肼等藥物具有一定的依賴性，即在一定濃度范圍內(nèi)更利于結(jié)核菌的生長[11-12]。

PA-824 是一種新型抗結(jié)核藥物，該藥物在國外已得到證實，能夠有效抑制MTB 的活性，同時具有良好的安全性[13-14]。該藥物具有獨特的作用機制，抑制甲氧基和酮基分枝菌酸，兩者均為MTB 細胞壁脂質(zhì)的組成成分，通過抑制MTB 細胞壁合成，阻斷MTB 繁殖，從而達到抑菌的作用[15-16]。目前國內(nèi)關(guān)于PA-824 對MTB 的抑菌作用研究較少。本研究結(jié)果顯示，RFP 治療組脾、肺組織重量、荷菌量明顯高于對照組，臟器致病指數(shù)低于對照組，表明RFP 對MTB 菌株無明顯治療作用，同時有利于MTB 的生長，顯示該菌株對RFP 有明顯的依賴性。本研究結(jié)果顯示，單獨PA-824 治療與聯(lián)合治療可有效減輕脾、肺組織重量，對小鼠脾、肺荷菌量均有一定的抑制作用，同時能夠提高臟器致病指數(shù)，說明PA-824在抑制MTB 對RFP 依賴性的同時，具有較好的抑菌作用，同時能夠改善臟器病變程度。但對于RFP 依賴性的抑制程度目前尚無明確定論。

結(jié)核病的病理變化一般包括壞死性病變、滲出性病變及增生性病變3 種類型[17]。增生性病變一般發(fā)生于細胞免疫較強、細菌含量較低的情況，出現(xiàn)細胞聚集現(xiàn)象；滲出性病變則發(fā)生于病灶惡化或處于炎癥早期，出現(xiàn)水腫、白細胞浸潤等現(xiàn)象。本研究中小鼠肺組織病理結(jié)果顯示，對照組與RFP 治療組小鼠肺組織病變范圍相差較小，同樣以滲出性病變?yōu)橹?，局部出現(xiàn)壞死性病變，表明RFP 對RFP 依賴結(jié)核菌感染的小鼠治療無效。PA-824 治療組和聯(lián)合治療組的病變組織滲出性病變明顯減少，以肉芽腫性病變?yōu)橹?，?lián)合治療組的病變組織范圍略低于PA-824 治療組，但對于肺組織病變情況均有很好的改善作用，病變范圍明顯縮小，病變類型由滲出性病變改善為增生性病變，提示PA-824 對改善病變范圍和病變程度有一定的效果。目前PA-824 通過有限人群路徑已在美國上市[18]。但該藥物仍缺乏臨床研究數(shù)據(jù)，未來需進一步擴大樣本量，對PA-824的最佳有效濃度、安全性、耐藥機制及最佳聯(lián)合治療方案進行深入研究。

綜上所述，PA-824 在抑制MTB 對RFP 依賴性的同時，對RFP 依賴結(jié)核菌感染小鼠具有較好的抑菌作用，同時對改善病變范圍和病變程度有一定的效果，對RFP 依賴結(jié)核病的防治具有重要意義。