慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道成纖維細胞過表達HSG基因對Wnt和MAPK信號通路的影響

楊義 周洵 張軍 李波 王新星 羅弦 葛正行

1貴州中醫(yī)藥大學（貴陽 550025）；貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院2呼吸內科，3科研教學部（貴陽 550003）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸系統(tǒng)常見病，以氣流受限不完全可逆為特征的肺部疾病［1］。COPD 病理變化有慢性支氣管炎、氣道重建、肺動脈重建、肺氣腫等，而以慢性支管炎和肺氣腫為主要病理改變，在COPD 病程進展中，氣道重建是關鍵，氣道重建實質是小氣道成纖維細胞的增生，目前研究［2-4］顯示MMP-9、PDGF、TGF-β1 等細胞因子是COPD 氣道重建的主要參與因子。HSG基因Mitofusin 2，對細胞增殖有抑制作用，研究［5-6］發(fā)現(xiàn)HSG在正常細胞呈高表達，在增殖細胞中呈低表達。Wnt 信號通路影響著機體的應激、免疫、細胞的分化、調亡等生理病理過程［7-8］。研究［9-11］表明Wnt信號通路與肺纖維化、特發(fā)性肺動脈高壓、肺間質性疾病等疾病的機制有重要聯(lián)系，參與調控細胞的分化、調亡、癌變及機體應激、免疫等生理病理過程。而在呼吸系統(tǒng)，Wnt 信號通路異常激活也與慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、間質性肺疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［12］。而TPA能夠通過增強CK1激酶活性而上調Wnt信號通路［13］。Wnt信號通路還和MAPK信號通路間有著相互影響［14］。MAPK/ERK 信號通路也是調節(jié)細胞生長增殖的信號通路，影響著肺部發(fā)育，也有研究［15-17］報道其與肺部腫瘤和肺炎密切相關。而EGF 作為生長因子，也是經(jīng)典的MAPK通過的激活因子［18］。HSG 基因對Wnt、MAPK 的交叉作用研究較少，推測其在COPD 中起重要作用，本研究構建HSG 過表達載體體外轉染COPD 氣道成纖維細胞并利用TPA 處理細胞而上調Wnt 信號通路，利用EGF 處理細胞而上調MAPK 信號通路，研究相關基因表達情況的變化，為尋找有效的控制和預防COPD 發(fā)展的方法提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物SD 大鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2016-0002） 。

1.2 主要試劑DMEM（gibco 10566-016）；TPA（425KO21，Solarbio）；rEGF （L1450411， Cyagen）；Lipofectamine?3000（invitrogen， 18882752）；OPTIMEM?I （gibco 331985-062）；Rat TGF-β1 試劑盒（MM-0181R1，上海酶聯(lián)）；Rat MMP-9 試劑盒（MM-20918R1，上海酶聯(lián)）；Rat PDGF試劑盒（MM-0076R1，上海酶聯(lián)）；Anti-Vimentin antibody （ab92547，abcam）；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（AP101-100-kit，MULTI SCIENCES）；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（TA-08，中杉金橋，1/2000）；Rabbit Polyclonal Anti-Mitofusin 2（別名：HSG） （ab124773，Abcam）；Rabbit Polyclonal Anti-β-catenin （ab32572，Abcam）；Rabbit Polyclonal Anti-RhoA （ab187026，Abcam）；Rabbit Polyclonal Anti-Wnt5a （bs-1948R，Bioss）；Rabbit Polyclonal Anti-ERK1/2 （D13.14.4E，Cell Signaling）。

1.3 COPD 模型建立在備皮區(qū)域用碘伏消毒；用手術剪刀沿著頸部中間剪開表皮和肌肉，使暴露出氣管；將吸取好的木瓜蛋白酶溶液（2 mg/mL）按照給藥量為0.1 mL/100 g 沿著氣管自上而下注射入氣管內使其到達肺部，而后將大鼠拿起旋轉一周，使其充分進入肺部；縫合傷口后放置于電熱毯上待其蘇醒后回籠正常飼養(yǎng)8 d。

1.4 COPD 模型大鼠氣道成纖維細胞原代分離麻醉處死大鼠，無菌條件下開胸，將切除的新鮮的COPD 大鼠氣道組織標本，在無菌工作臺里對組織標本反復用加入雙抗的PBS沖洗5遍。無菌手術刀刮去氣道周圍組織和氣道內膜，用消毒好的眼科剪將組織塊剪成2 mm × 2 mm 大小。將剪好的組織塊貼到培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。待其完全貼壁后，在培養(yǎng)板中加入新配制的DMEM + 20% FBS + 雙抗培養(yǎng)液，再將細胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況再進行常規(guī)處理。棄去組織塊及上清液，加入新配制的DMEM + 20% FBS + 雙抗培養(yǎng)液于培養(yǎng)皿中。

1.5 免疫熒光在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的培養(yǎng)皿用4%的多聚甲醛固定15 min，再用0.5% Triton X-100（PBS 配制）室溫通透20 min。清洗后，在培養(yǎng)皿內滴加5% BSA，37 ℃封閉30 min。吸掉封閉液，不洗，培養(yǎng)皿內滴加足夠量的稀釋好的一抗Vimentin（1∶250），37 ℃孵育3 h。清洗后，吸干培養(yǎng)皿內多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Cy3（1：200），37 ℃孵育30 min；清洗后，滴加DAPI 避光孵育5 min，對標本進行染核，之后洗去多余的DAPI；用50%甘油封閉培養(yǎng)皿，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.6 過表達HSG載體的構建NCBI查找HSG基因序列（NM_130894），引入酶切位點（HindIII/XhoI）生物合成基因片段克隆至pCDNA3.1（+）載體上。

1.7 熒光定量PCR取各組進行RNA 的提取，提取RNA 后根據(jù)逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行檢測，以GAPDH為內參，算出各組細胞中HSG、β-catenin、Wnt5a、ERK2 和RhoA 的相對表達量。引物如下：HSG F primer：AACTCCATCGTCACCGTCAA；HSG R primer：CAACCCGCAGGAAGCAA；RhoA F primer：AGAGTTGGCTTTATGGGACAC；RhoA R primer：GATGATGGGCACATTTGGA；Wnt5a F primer：GCTTCAACTCCCCAACCA；Wnt5a R primer：CTCGCAGCCGTCCATC；ERK2 F primer：CAAGCCTTCCAACCTCCTG；ERK2 R primer：TGTTCCACGGCACCTTATTT；β -catenin F primer：TTATGAGTGGGAGCAAGGC；βcatenin R primer：ACAACGGGCTGTTTCTACG；GAPDH F primer：GCAAGTTCAACGGCACAG；GAPDH R primer：CGCCAGTAGACTCCACGAC。

1.8 實驗分組空白組（Normal）；空載組（Blank）；HSG 過表達載體（HSG-oe）；空白+TPA；空載+TAP；HSG 過表達載體+TPA；空白+EGF；空載+EGF；HSG 過表達載體+EGF。TPA：10 nmol/L；rEGF：50 ng/mL，需轉染質粒的分組在轉染48 h 后再加藥作用24 h。

1.9 細胞轉染接種細胞至80%匯合度時轉染，前1 d接種或換液，取出DNA或RNA離心3 000 r/min，5 min；使用Opti-MEM?培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine?3000 試劑-充分混勻，避光室溫孵育5 min。在每管已稀釋的Lipofectamine?3000 試劑中加入稀釋的DNA 或RNA 中混勻，室溫避光孵育45 min。按照上述分組，加入DNA-脂質體復合物中或RNA-脂質體復合物。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育細胞，轉染48 h。

1.10 流式凋亡檢測收集1 × 106～ 3 × 106個細胞，離心去上清，加1 mL PBS 洗滌一遍1 500 r/min離心，5 min，棄上清。用雙蒸水將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer。取300 μL 預冷的1×Binding Buffer 重懸細胞。每管各加入3 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI-PE。輕微混勻后，室溫避光孵育10 min。再向每管中加入200 μL 預冷的1×Binding Buffer。混勻后上流式儀檢測。

1.11 ELISA 檢測分別設空白孔、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。每孔加入酶標試劑100 μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5 次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應。以空白孔調零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15 min以內進行。

1.12 Western blot（WB）取各組細胞加入相應的裂解液，4 ℃裂解30 min，在10 000 r/min 離心10 min，小心吸取上清，即得總蛋白。利用BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定。蛋白變性、上樣、電泳1 ～ 2 h，濕法轉膜30 ～ 50 min。4 ℃孵育一抗溶液過夜；室溫孵育二抗1 ～ 2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用“Quantity one”軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.13 流式周期檢測收集各組細胞用EP 管分裝好后向每管中加入1 mL PBS 溶液2 000 r/min 離心2 min，棄上清，重復3 次。離心收集1 ～ 5 × 105個細胞。加入1 mL 冰浴預冷70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4 ℃固定12 h。按照說明書混合染色緩沖液、碘化丙啶和RNAse A，配制碘化丙啶染色液。每管細胞樣品中加入0.5 mL 碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min。之后用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm 波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況并進行細胞DNA 含量分析和光散射分析，根據(jù)結果擬合得出細胞周期情況。

1.14 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析，經(jīng)t檢驗，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 COPD 模型的組織學鑒定見圖1，正常對照組大鼠肺組織病理切片光鏡下見肺泡結構規(guī)整，無肺泡腔病理性擴張及融合，支氣管管壁未見增厚。氣道粘膜上皮光滑，纖毛排列整齊，無炎癥細胞浸澗，氣管腔內無明顯炎性滲出。COPD 模型組大鼠肺組織HE 染色出現(xiàn)肺氣腫病理變化，肺泡出現(xiàn)擴張，肺泡壁變薄，并逐步斷裂融合成肺大皰，肺泡數(shù)目顯著減少。氣道粘膜纖毛出現(xiàn)粘連、變性和壞死，甚至脫落。支氣管上皮杯狀細胞增生肥大，有大量的炎性細胞如中性粒細胞、巨噬細胞浸潤管腔，小氣道管腔狹窄同時伴小氣道壁纖維結締組織増生。

圖1 肺組織HE 染色結果Fig.1 HE staining of lung tissue

2.2 成纖維細胞鑒定見圖2，紅色的是蛋白Vimentin，藍色是細胞核，分離培養(yǎng)所得的細胞中都大量表達了Vimentin，可以判斷細胞為成纖維細胞。

圖2 細胞免疫熒光結果（100 ×）Fig.2 Results of cellular immunofluorescence （100 ×）

2.3 qPCR 檢測各組實驗HSG 和Wnt 信號通路基因表達情況見圖3，qPCR檢測顯示過表達HSG能抑制基因Wnt5a 和ERK1/2 的表達。受TPA 處理后，Wnt5a 表達上調而HSG 表達受抑制；受EGF處理后，ERK2 表達上調而HSG 表達受抑制。

圖3 PCR 檢測結果Fig.3 PCR detection results

2.4 WB 檢測各組實驗HSG 和Wnt 信號通路基因表達情況見圖4，WB 檢測顯示過表達HSG 能抑制基因Wnt5a 和ERK1/2 的表達。受TPA 處理后，Wnt5a 表達上調而HSG 表達受抑制；受EGF 處理后，ERK2 表達上調而HSG 表達受抑制。

圖4 蛋白質表達的WB 檢測結果Fig.4 Western blot （WB） detection results of protein expression

2.5 ELISA 檢測各組實驗細胞上清中TGF-β1、PDGF、MMP-9 的含量見圖5，ELISA 檢測結果顯示，過表達HSG 能降低TGF-β1、PDGF、MMP-9的含量，受相應激動劑處理后TGF-β1、PDGF、MMP-9 的含量上升，而過表達HSG 依然有抑制效果。

圖5 細胞培養(yǎng)液上清中TGF-β1、PDGF、MMP-9 的含量Fig.5 Contents of TGF-β1， PDGF， and MMP-9 in the cell culture supernatant

2.6 細胞流式檢測細胞凋亡見圖6，各組實驗細胞流式檢測細胞凋亡結果顯示過表達HSG 會明顯上調細胞凋亡率，而相應的激動劑處理會降低過表達HSG 促進細胞凋亡的效果。

圖6 細胞凋亡率檢測結果Fig.6 Results of cell apoptosis rate detection

3 討論

本文的實驗設計旨在檢驗過表達HSG 基因能否抑制COPD 模型大鼠氣道中的成纖維細胞生長，從而抑制相關的肺部纖維化，并研究此效果與Wnt 信號通路和MAPK 信號通路的相關性。Wnt信號通路和MAPK 信號通路功能上有著相似性，而且兩個信號通路間也有著相互促進的作用［19-20］。MAPK 信號通路中的成分例如ERK1/2、p38 和JNK 能夠促進LRP6 蛋白質磷酸化，從而上調Wnt/β-catenin 信號通路［21］。Wnt5a 則能夠促進ERK1/2蛋白質磷酸化［14，22］。TGF-β1 是Wnt 信號通路的一個靶基因，廣泛分布于氣管支氣管內，在COPD 發(fā)病過程中其主要來源于肺部局部浸潤的中性粒細胞、巨噬細胞及氣道壁成纖維細胞，它是最重要的致纖維化細胞因子，并且能反向調節(jié)刺激成纖維細胞合成和分泌細胞外基質，進而導致氣道纖維增生［23-25］。MMP-9 則是另一個受Wnt 信號通路調節(jié)的基因，在COPD 的發(fā)病機制上主要是通過對肺泡基質成分的破壞，加重擴大肺泡腔，導致其彈性下降，回縮力降低；另一方面，通過破壞上皮細胞及內皮細胞而參與氣道組織重建［26-28］。而PDGF是對間質細胞有著顯著影響的生長因子，能刺激小氣道成纖維細胞趨化和增殖及細胞外基質合成，是引起氣道重建機制之一，而其受體屬于酪氨酸激酶受體，可以激活MAPK 信號通路和Wnt 信號通路［29-31］。Wnt 信號通路可通過抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）介導的磷酸化和抑制細胞質中β-連環(huán)素的降解來誘導EMT［32］。TGF-β 可通過MAPK 信號通路（如p38，Erk1/2）刺激細胞外基質（ECM）的合成和積累從而誘導EMT［33］。進一步證實差異基因可能通過影響EMT/MET 平衡從而參與細胞纖維化進程進而改善或加劇COPD 癥狀。

實驗結果顯示，過表達HSG 會大大提高成纖維細胞凋亡率，降低成纖維細胞的增殖，降低細胞分泌TGF-β1、PDGF、MMP-9 的含量，可以推測過表達HSG 能抑制肺部纖維化。而且過表達HSG會抑制Wnt5a 和ERK1/2 的表達，說明Wnt 信號通路和MAPK 信號通路都受到了抑制。用Wnt 信號通路激動劑TPA 或者MAPK 信號通路激動劑EGF處理成纖維細胞之后，相應的Wnt5a 和ERK1/2 的表達上升，但是HSG 過表達組的Wnt5a 和ERK1/2的表達水平是明顯低于受對應激動劑處理的空載組的，這些實驗結果說明HSG 拮抗Wnt 信號通路和MAPK 信號通路。值得注意的是，在激動劑處理成纖維細胞之后，正常對照組和空載組HSG 表達水平下降，同時HSG 過表達組的HSG 表達水平也明顯下降，約為受激動劑處理前HSG 表達水平的三分之一。這說明Wnt 信號通路和MAPK 信號通路上調不僅調控抑制成纖維細胞本身的HSG 表達，也同樣調控抑制外源轉染的HSG 表達，由此可以推測Wnt 信號通路和MAPK 信號通路可以直接調控細胞質中HSG 的mRNA 水平，Wnt 信號通路和MAPK信號通路或能夠促進HSG的mRNA降解，這也許涉及到受Wnt 信號通路和MAPK 信號通路誘導的microRNA。

綜上所述，HSG 基因通過拮抗Wnt 信號通路和MAPK 信號通路可以達到抑制肺部纖維化的效果。然而，研究并沒有對介導HSG 基因的上游通路及EMT 途徑影響纖維化進行分析。在未來的研究中，將進一步探索HSG 如何調節(jié)COPD 的纖維化，旨在明確HSG 在COPD 發(fā)展中的臨床價值和潛在機制。

【Author contributions】GE Zhengxing participated in project design and manuscript modification， YANG Yi participated in project design， experiments， and manuscript writing. ZHOU Xun， ZHANG Jun， LI Bo， WANG Xinxing， and LUO Xian all participated in the experiments. All authors have read and agreed to submit the final manuscript.