三亞地區(qū)2019-2020年急性腸胃炎患者A群雙埃可病毒的分子特征

黃麗菊 李泳枝 何歡 石挺麗 陳彩云 鄭麗婷 梁敏儀 陳佳琪 陳清

1三亞中心醫(yī)院（海南省第三人民醫(yī)院）（海南三亞 572000）；2肇慶醫(yī)學高等?？茖W校（廣東肇慶 526020）；3南方醫(yī)科大學（廣州 510515）

急性胃腸炎是常見的感染性疾病，通常由病毒和細菌引起，目前病毒感染已成為急性胃腸炎發(fā)生的主要原因［1］。A 群雙?？刹《荆≒arechovirus-A，PeV-A）過去稱為人雙埃可病毒，是單鏈、正股RNA病毒，屬于小RNA病毒科雙?？刹《緦伲?-4］。目前共發(fā)現(xiàn)了19種PeV-A的基因型（HPeV-1至HPeV-19），急性胃腸炎與多種基因型均有關［5］。國內外已經有一些PeV-A 相關的急性腸胃炎的流行病學研究［6-9］，熱帶地區(qū)是感染性腹瀉的高發(fā)地區(qū)，但是目前尚未見我國熱帶地區(qū)PeV-A 感染的研究報道。因此，我們在2019-2020 年間，在三亞市某哨點醫(yī)院開展了急性腸胃炎患者的PeV-A 監(jiān)測和分子流行病學分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象和樣本以門診和住院診斷為急性腸胃炎的患者為研究對象。研究對象納入標準：2019 年1 月至2020 年8 月，連續(xù)納入符合急性胃腸炎、自愿接受問卷調查的病例。急性胃腸炎患者定義：表現(xiàn)為腹瀉（過去24 h 內大便次數(shù)超過3 次），并合并腹痛、惡心和嘔吐，同時排除已證實患有炎癥性腸病、腹瀉性乳糜瀉、囊性纖維化和食物不耐受的患者。調查信息包括一般人口學信息、臨床癥狀、流行病學史和實驗室檢查結果。排除標準：基本人口信息不全或者沒有糞便標本的病例。采集臨床上確診為急性胃腸炎患者的糞便樣本。遵循“先采集，后治療”的原則。所有糞便樣本在實驗操作前均進行-80℃低溫保存。本研究獲得三亞中心醫(yī)院（海南省第三人民醫(yī)院）倫理委員會批準（批號：LLKY2311118）。

1.2 病毒核酸提取糞便樣本使用TaKaRa Mini-BEST 病毒RNA/DNA 提取試劑盒（No. 9766）進行病毒核酸提取。檢測前，使用羅氏一步法逆轉錄試劑盒（No. 4379012001）將病毒RNA 逆轉錄為cDNA 備用。

1.3 PeV-A 及其他腹瀉病毒檢測采用巢式逆轉錄聚合酶鏈式反應技術（Nest Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，Nest RT-PCR）擴增高度保守的5′端非翻譯區(qū)的片段（5′-UTR，243 bp）進行糞便樣本中的PeV-A初篩［10］。初篩陽性樣本，根據PeV-A 的VP3/VP1 連接區(qū)片段（304 bp）進行基因分型。VP1 區(qū)則使用改良引物進行擴增（758 bp）。本研究同時檢測與致腹瀉相關的腸道病毒，包括：A 群輪狀病毒、諾如病毒［11］、扎如病毒［12］、腺病毒［13］、人博卡病毒［14］、星狀病毒［15］和Salivirus［16］。PCR 產物條帶經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后在紫外光下觀察。

1.4 系統(tǒng)進化分析使用BLAST+2.14.0（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將所有5′-UTR 區(qū)及VP1 區(qū)核苷酸序列片段與NCBI 網站上的參考序列進行比較。系統(tǒng)進化分析使用MEGA-X（Mega Limited， Auckland， New Zealand）軟件進行。使用基于p-距離模型的鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。通過1 000個重復的bootstrap值來評估分支的統(tǒng)計支持度。

1.5 統(tǒng)計學方法分類變量的描述性統(tǒng)計以頻率和比例或比率表示，連續(xù)變量的描述性統(tǒng)計以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。使用Kruskal-Wallis H 檢驗法進行非參數(shù)檢驗，以比較不同組間連續(xù)變量的差異。χ2檢驗或Fisher 確切概率檢驗用于比較分類變量的差異。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)據分析均使用SPSS 26.0 版（IBM Corp.， Armonk， NY， USA）軟件進行。

2 結果

2.1 研究對象的人口學特征及臨床特征共收集了267 例臨床診斷為急性腸胃炎的門診患者（表1）及其糞便樣本。急性胃腸炎患者的中位年齡為3.9歲，5歲以下患者的比例為53.2%（142/267），男女性別比為1.36∶1。患者主要為散居兒童、幼托兒童和學生（66.6%）。

表1 2019-2020 年三亞市某醫(yī)院急性胃腸炎患者的人口學及臨床特征Tab.1 Demographic and Clinical characteristics of Sanya acute gastroenteritis patients between 2019 and 2020例（%）

在臨床特征方面，除了腹瀉（100%）癥狀，還有部分患者有惡心（14.6%）、腹痛（27.0%）、腹脹（24.0%）、發(fā)熱（17.2%）、嘔吐（14.2%）和乏力（10.1%）等癥狀（表1）。糞便特征分析顯示，32.6%病例糞便中發(fā)現(xiàn)其隱血陽性（表1），3.0%的病例觀察到黏液便。

2.2 PeV-A 腹瀉患病率及與其他腹瀉病毒共感染情況通過巢式RT-PCR 方法，三亞患者糞便標本中PeV-A 核酸的檢出率為3.37%（9/267）。絕大多數(shù)PeV-A陽性者年齡在2歲以下，尤其是5 ～ 6個月的兒童。男女比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)急性胃腸炎全年流行，高峰在12 月至2 月，但與PeV-A 感染相關的季節(jié)性分布在夏季和冬季較多（圖1）。

圖1 2019-2020 年三亞市某醫(yī)院PeV-A 感染病例的季節(jié)分布圖Fig.1 Seasonal distribution of PeV-A infections in Sanya，China， 2019-2020

PeV-A 陽性者會出現(xiàn)腹瀉、呼吸道感染、惡心、腹痛、嘔吐和發(fā)燒癥狀。PeV-A 陽性者的腹瀉持續(xù)的中位天數(shù)為3.0 d，明顯高于PeV-A陰性者（P＜0.05）。但PeV-A陽性患者的最高腹瀉頻率與PeV-A陰性患者相似，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。

PeV-A 與A 群輪狀病毒（RoV-A）和諾如病毒（NoV）的共感染率分別為11.1%（1/9）和22.2%（2/9）。在嘔吐的占比方面，PeV-A陽性組高于陰性組（44.4%vs. 13.2%，P= 0.008）（表2）。

表2 PeV-A 病毒陽性患者與其他不同分組的急性胃腸炎患者的臨床癥狀比較Tab.2 Comparison of clinical symptoms of PeV-A infection between different groups of subjects with acute gastroenteritis例（%）

2.3 PeV-A 基因型的系統(tǒng)發(fā)育特征本研究糞便樣本中發(fā)現(xiàn)了HPeV-1、HPeV-3 和HPeV-5 的VP3/VP1 部分基因序列（圖2）。三亞患者的PeV-A基因型大多數(shù)為HPeV-1，與國內外的參考株系緊密聚類；其中SY-1943 和SY-1944 與廣州的參考株（MK532597、MK532589）相似性達到100%。而SY-1952 株和SY-2195 株分別與蘭州的HPeV-3 參考株（JQ715773.1）以及鎮(zhèn)江的HPeV-5 參考株（KY067444.1）形成進化分支，相似性分別為98%與93%（圖2）。此外，我們進一步對上述序列進行VP1 長片段基因區(qū)的擴增與系統(tǒng)進化分析，也得到了類似的結果，即三亞急性胃腸炎患者的PeV-A基因片段可分為3 個不同型別的進化分支；其VP1區(qū)的3 個不同基因型片段與來自北京或香港參考株的親緣關系最為接近，相似性為89% ～ 100%（圖3）。

圖2 三亞市PeV-A 病毒的VP1/VP3 片段基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed from VP1/VP3 partial gene of Sanya PeV-A

圖3 三亞市PeV-A 病毒的VP1 基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed from VP1 gene of Sanya PeV-A

3 討論

PeV-A 在急性胃腸炎患者中的檢出率不同地區(qū)報告的結果有所不同［17-19］。本研究中三亞的PeV-A 檢出率為3.37%，高于在泰國的報道（1.8%或2.4%）［20-21］，但低于CHEN 等［22］在廣州地區(qū)的研究報道。本研究幾乎所有的PeV-A 感染都發(fā)生在出生后的第1 ～ 2 年，5 ～ 6 個月齡的嬰幼兒感染比例較高，這與之前的研究結果一致［22-25］。在季節(jié)分布方面，PeV-A 的流行貫穿全年，雖然大多數(shù)研究都觀察到PeV-A感染的季節(jié)性模式，但高峰季節(jié)的差異性很大［26］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)了PeV-A在三亞地區(qū)相對明顯的季節(jié)性分布，即在夏季和冬季流行，并在7 月份達到高峰，這與泰國和日本的季節(jié)分布相似，與陳雪姣等在廣州地區(qū)的報道也相似［22，25］。

本研究中在三亞地區(qū)檢測到的PeV-A 基因型主要為HPeV-1、HPeV-3 以及HPeV-5，HPeV-1 檢出最多，其次為HPeV-3，與國內外已經發(fā)表的報告相似［22，25，27］。本研究還表明，與PeV-A 陰性腹瀉患者相比，大部分PeV-A 陽性腹瀉患者有更高比例的臨床特征：為腹瀉、呼吸道感染、惡心、腹痛、嘔吐和發(fā)燒，提示PeV-A 急性胃腸炎的癥狀比較明顯。但是，由于本研究只有9 例陽性病例，掌握其有關臨床特征還需要更大樣本量的研究。

綜上所述，本研究提供了2019-2020 年間三亞地區(qū)急性胃腸炎患者中存在PeV-A 感染的初步流行病學信息，以HPeV-1 基因型為主，其次是HPeV-3 和HPeV-5，病毒陽性者的臨床癥狀也比陰性者重，要引起重視。

【Author contributions】HUANG Liju designed the experiments and wrote the article. LI Yongzhi and HE Huan performed the experiments.SHI Tingli and CHEN Caiyun collected and analyzed data. ZHENG Liting， LIANG Minyi and CHEN Jiaqi revised the article. CHEN Qing designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.