抑制陰道加德納菌的乳桿菌的篩選及其抑菌機制的研究

張 瑞,馬愛昕,王君竹,李 昶,尹海旭,白會會,劉朝暉

細菌性陰道病(bacterial vaginosis, BV)是最常見的女性下生殖道感染之一[1],主要表現(xiàn)為陰道微環(huán)境中的乳桿菌大幅減少、以陰道加德納菌為代表的厭氧菌大量增殖[2]。研究[3]表明:BV與盆腔炎、不孕、不育、流產(chǎn)、早產(chǎn)、新生兒感染和宮頸HPV感染等多種疾病的發(fā)生有關(guān)。關(guān)于BV的發(fā)病機制研究持續(xù)了很多年,但究竟是乳桿菌減少導致厭氧菌增殖,還是厭氧菌的增殖導致乳桿菌的減少,一直沒有明確的結(jié)論。有些研究認為是乳桿菌減少,厭氧菌伺機獲得增殖機會,占據(jù)主導地位;研究[4-5]表明不同的陰道微環(huán)境類型,會導致陰道上皮細胞的基因表達產(chǎn)物的種類和數(shù)量有所不同,產(chǎn)生和釋放的生物活性物質(zhì)的種類和數(shù)量不同,對微環(huán)境的保護能力存在差別。目前尚不清楚健康女性乳桿菌的各個菌種是否均對陰道加德納菌增殖有抑制作用。以往研究對篩選具有抑制陰道加德納菌的乳桿菌的研究較少。該研究將從人體分離乳桿菌菌株、陰道加德納菌菌株,通過體外實驗探討中國健康女性陰道乳桿菌菌株對陰道加德納菌的增殖的抑制效果,并對可能的機制做初步探討。

1 材料與方法

1.1 病例資料BV人群:2021年11月—2022年6月在北京大學第一醫(yī)院門診就診的18～45(28.0±2.1)歲、陰道微生態(tài)Nugent評分大于6分的育齡期女性。排除標準:① 處于月經(jīng)期;② 1個月內(nèi)使用抗生素或者抗真菌藥物者;③ 1個月內(nèi)口服或者外用避孕藥者;④ 48 h內(nèi)曾經(jīng)陰道用藥或者陰道沖洗者;⑤ 半年內(nèi)曾經(jīng)被診斷過陰道其他感染性疾病,如外陰陰道假絲酵母菌病、滴蟲性陰道炎。

健康女性人群:同期在北京大學第一醫(yī)院體檢中心體檢的無自覺癥狀和疾病的健康女性。排除標準:① 近1周內(nèi)陰道用藥者;② 1月內(nèi)用過抗生素或抗真菌藥者;③ 2周內(nèi)有任何不適;④ 半年內(nèi)被診斷過下列任何一種疾病者:盆腔炎,宮頸炎,陰道炎,其他婦科炎性疾病(支原體、衣原體、淋病、梅毒等);⑤ 性伴侶近期被診斷過患性傳播疾病者(支原體、衣原體、淋病、梅毒);⑥ 婦科檢查發(fā)現(xiàn)陽性體征者。

該研究獲得北京大學第一醫(yī)院倫理委員會批準(批準號:2017研92),所有志愿者均自愿簽署知情同意書。

1.2 菌株分離、純化和鑒定

1.2.1陰道乳桿菌的分離和純化 ① 無菌棉拭子取健康女性陰道側(cè)壁中1/3分泌物,涂MRS瓊脂平板,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑菌落,涂片,革蘭染色,鏡檢確認為革蘭陽性大桿菌后,再以MRS液體培養(yǎng)基增菌后凍存;② 凍存的革蘭陽性大桿菌復蘇后涂MRS培養(yǎng)板,37 ℃厭氧培養(yǎng)。

1.2.2陰道加德納菌的分離和純化 ① 無菌棉拭子取BV患者陰道側(cè)壁中1/3分泌物,涂于改良BHI瓊脂板上。② 將涂有陰道分泌物標本的改良BHI瓊脂板裝進厭氧袋,放置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。③ 挑取圓形、針尖樣、半透明單菌落,涂在新的改良BHI瓊脂培養(yǎng)板上,37 ℃、厭氧培養(yǎng)24～48 h。④ 從培養(yǎng)板上挑取單菌落,將獲得的菌落凍存。

1.2.3菌株鑒定 通過菌落PCR,使用引物27F/1492R(27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;1492R:5′-TACGYTACCTTGTTACGACT-3′)擴增臨床分離菌株的16s rRNA基因全長,PCR產(chǎn)物送測序由上海生工生物技術(shù)公司完成,將拼接結(jié)果的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫上的細菌16s rRNA基因序列進行比對,完成菌株鑒定。

1.3 Spot on lawn法篩選具有抑菌功能的乳桿菌將乳桿菌菌液濃度調(diào)整為0.5麥氏濁度標準(McFarland,MCF),100 μl點種在MRS瓊脂平板上,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,再將含陰道加德納菌菌株的軟瓊脂培養(yǎng)基覆蓋其上,厭氧培養(yǎng)48 h,觀察有無抑菌環(huán)形成。

1.4 雙層牛津杯法檢測菌體、菌液和上清液對加德納菌的作用選出在spot on lawn實驗中對陰道加德納菌增殖有抑制作用的乳桿菌菌株,進行雙層牛津杯法實驗。在培養(yǎng)皿底層的MRS瓊脂平板上放置牛津杯,上層為含有陰道加德納菌菌株的軟瓊脂。取培養(yǎng)18 h的乳桿菌菌液200 μl共4份,2份離心獲得上清液,1份無菌PBS清洗3遍獲得菌體,另1份為菌體菌液混合物。

每個乳桿菌菌株做4個孔,分別加入:上清液、菌體、菌液以及上清液+蛋白酶K。用MRS液體培養(yǎng)基為陰性對照,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h,分別測量各自的抑菌環(huán)直徑。所有菌株的檢測分別做3次。

2 結(jié)果

2.1 標本收集情況共納入志愿者30例,其中健康女性20例,BV患者10例,各組臨床資料如表1所示,基線資料在健康組與BV兩組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 基線資料

通過體外培養(yǎng)、分離、純化和鑒定,健康組每份標本中均能分離出乳桿菌,從20例標本中共獲得乳桿菌菌株62株,分別屬于6個菌種(表2)。BV組10份標本中,2份標本中分離出3個陰道加德納菌菌株,另外8份未分離出陰道加德納菌。

表2 分離的乳桿菌及其抑菌情況

2.2 乳桿菌抑菌試驗在62株乳桿菌菌株中有18株對陰道加德納菌的增殖有抑制作用,44株對陰道加德納菌菌完全沒有抑制作用(表2),在卷曲乳桿菌、加氏乳桿菌、詹氏乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌中,有抑菌功能的菌株所占比例較高。

2.3 菌液、菌體、上清液和蛋白酶K處理組抑菌效果的區(qū)別如表3所示,篩選出的18個乳桿菌菌株中,所有菌株的菌液、菌體和上清液均有抑菌效應。菌液的抑菌效應明顯大于上清液組,其中14株差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上清液經(jīng)過蛋白酶K處理之后,8份標本的抑菌效果消失,10份標本的抑菌效果不同程度減弱。

表3 菌液、菌體、上清液對陰道加德納菌的抑制情況

3 討論

健康女性陰道是一個復雜的微生態(tài)系統(tǒng),定植多種細菌,其中乳桿菌為優(yōu)勢菌,通過競爭排斥、產(chǎn)生乳酸、過氧化氫、細菌素等抗菌物質(zhì)來抑制病原菌的生長,維護陰道微生態(tài)平衡[6-7]。某些因素作用下,如雌激素水平的降低,性行為及抗生素的使用等使陰道內(nèi)一些條件致病菌如陰道加德納菌過度生長,引起菌群失衡,導致BV的發(fā)生[8]。以往認為BV的致病菌是陰道加德納菌,但是越來越多的研究[1-2]表明,除了陰道加德納菌之外,普雷沃菌、阿托波菌等多個厭氧菌可能也是BV的致病菌,但陰道加德納菌比其他致病菌具有更高的毒力潛能,具有更強的黏附能力和細胞毒性,更容易形成生物膜[9],在BV的發(fā)病機制中起著更加關(guān)鍵的作用[10-11]。因此,健康女性陰道乳桿菌對陰道加德納菌的抑制情況及其機制,對闡明BV的發(fā)病機制以及如何診治BV有重要作用。然而,既往關(guān)于乳桿菌抑制陰道加德納菌的研究很少,其中僅有王友芳 等[12]研究中分離的德氏乳桿菌已研制成新型的益生菌制劑。

在該研究中,健康組分離出的乳桿菌包含6個菌種,其中95%以上的標本中含有兩個以上菌種,這與之前的研究[13]結(jié)果一致。每份標本中均能分離出乳桿菌,從20例標本中共獲得乳桿菌菌株62株。BV組的10份標本中,2份標本中分離出3個陰道加德納菌菌株,另外8份未分離出陰道加德納菌。通過體外實驗對陰道乳桿菌菌株的抑菌能力分析顯示,29.03%(18/62)的乳桿菌菌株具有抑制加德納菌增殖的功能,并不是所有的乳桿菌菌株都具有抑制病原菌的能力[3],這提示不同人群對BV的易感性可能存在差異[4]。發(fā)酵乳桿菌的分離率很低,但是分離出的菌株中有抑菌功能的菌株比例很高。加氏乳桿菌和詹氏乳桿菌的分離率很高,但是有抑菌功能的菌株比例相對很低。

陰道乳桿菌對病原菌的抑制和清理機制分為間接途徑和直接途徑,間接途徑主要是影響人體陰道免疫功能,而直接途徑包括產(chǎn)生過氧化氫、乳酸、細菌素、細菌素樣物質(zhì)和表面活性物質(zhì)[14-16]。在該研究中表明,大部分乳桿菌體外培養(yǎng)的菌液有明顯的抑菌效果,上清液的抑菌效果明顯弱于菌液,這說明乳桿菌抑制加德納菌的機制是多途徑[14-16],各種途徑在不同的菌株的抑菌過程中發(fā)揮作用的比重可能不同。然而菌體的抑菌作用和菌液大致相同這一現(xiàn)象不好解釋,可能是由于經(jīng)過PBS清洗之后的菌體加入MRS培養(yǎng)基之后,再加入牛津杯,經(jīng)過48 h的培養(yǎng)時間,相當于新形成的菌液作用于底層的加德納菌平板。

經(jīng)過蛋白酶K處理過的上清液的抑菌作用出現(xiàn)兩種變化:消失和減弱。這一現(xiàn)象說明乳桿菌培養(yǎng)上清液中含有的物質(zhì)種類可能并不單一,不同的陰道乳桿菌菌株培養(yǎng)上清液抑制陰道加德納菌的機制也存在不同,抑菌作用消失的一類,可能主要通過蛋白類物質(zhì)發(fā)揮抑菌作用,而抑菌作用減弱的一類,可能存在除了蛋白類物質(zhì)之外的機制發(fā)揮抑菌作用,比如乳酸或過氧化氫。