硅藻基因組學研究進展※

●宋汶軒 王振東 李亞堃 羅智慧 蔡春雨 陳 卓

（山東師范大學生命科學學院 山東 濟南 250358）

硅藻是一類單細胞光合自養(yǎng)的真核生物，起源于次級內共生過程，屬于Stramenopile譜系，絕大多數(shù)硅藻可以進行光合放氧作用[1-3]。硅藻的顯著特征之一是具有硅質化的細胞壁，其主要成分由不定形二氧化硅組成。不同硅藻硅質化細胞壁紋理和形態(tài)各不相同，早期用于硅藻的分類研究[4]。硅藻種類繁多，幾乎在所有水生棲息地包括淡水、海水及潮濕的土壤中均有發(fā)現(xiàn)。據(jù)估計，硅藻貢獻了大約50%的海洋初級生產(chǎn)力和25%的全球初級生產(chǎn)力，并參與全球生物地球化學循環(huán)[5-6]。硅藻在實際生產(chǎn)中也具有廣泛的應用價值，包括生物醫(yī)藥和生物能源等方面[7]。其中，生物醫(yī)藥方面，硅藻富含多不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、多糖、維生素和甾醇等活性物質[8]，目前已經(jīng)被用于疫苗及其佐劑和抗體合成等醫(yī)藥分子的開發(fā)[9]。生物能源方面，硅藻細胞積累的中性脂可以提取后轉化為生物柴油等[10]。

迄今為止，硅藻已有多個物種完成了基因組測序。早在2004年和2008年，即應用第一代測序技術，分別完成了中心綱偽矮海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）[1]和羽紋綱三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）[2]的基因組測序。目前，硅藻基因組測序主要借助第二代測序技術，完成了具有異源二倍體基因組結構的Fistulifera solaris[11]、具有高度雜合基因組的冷適應圓柱擬脆桿藻（Fragilariopsis cylindrus）[12]、具有較大基因組的硅藻Thalassiosira oceanica[13]和Fragilaria radians[14]等的基因組測序。研究發(fā)現(xiàn)硅藻具有“嵌合式基因組”的特點，顯示它們經(jīng)歷了復雜的進化歷程[1-2]。

硅藻基因組學的研究推動了其在生態(tài)、進化、環(huán)境適應及生產(chǎn)應用等方面的科研成果。本文主要概述硅藻結構基因組學及功能基因組學等相關研究進展。

1 硅藻結構基因組學研究

硅藻基因組的全面分析揭示了其來自藻類和異養(yǎng)祖先的內共生起源，以及來自細菌等其他物種的水平基因轉移等重要的生物學過程。此外，硅藻的嵌合式基因組還受到表觀遺傳等過程的影響[4]。硅藻結構基因組主要包括染色體基因組、質體基因組及線粒體基因組。

1.1 染色體基因組研究

偽矮海鏈藻是第一個完成基因組測序的硅藻。Armbrust等[1]報告了該藻株34 Mb堿基對的核基因組草圖，及其129 kb 堿基對質體基因組和4·4 kb 堿基對線粒體基因組。偽矮海鏈藻核基因組包含24個二倍體核染色體。測序結果鑒定了一系列基因，包括硅酸轉運和硅質化細胞壁的形成基因、高親和力鐵吸收基因和一些多不飽和脂肪酸的生物合成酶基因，以及完整的尿素循環(huán)基因等。

三角褐指藻基因組測序分析揭示了硅藻中基因的多樣化來源。該模式硅藻中包含數(shù)百個來自細菌的基因，它們可能借助基因水平轉移獲得，并在硅藻感知環(huán)境信號方面發(fā)揮作用。此外，該研究重點探討了三角褐指藻營養(yǎng)代謝機制，尤其是細胞中的尿素循環(huán)。研究人員利用RNA干擾沉默了細胞中尿素循環(huán)的關鍵酶，發(fā)現(xiàn)尿素循環(huán)是維持硅藻碳氮平衡的重要原因[2]。Rastogi等[15]在不同空間和時間尺度上進行三角褐指藻采樣，然后借助全基因組重測序繪制了該模式藻種內基因組多樣性的圖譜。該藻株至少存在10個不同的生態(tài)型藻株，它們分為四個遺傳進化分枝，并在形態(tài)比例、油脂含量及環(huán)境適應性等方面存在差異。同時，無性繁殖在所有三角褐指藻種群中占主導地位。此外，這些生態(tài)型藻株展現(xiàn)了遺傳和功能的趨同特征，導致很多基因和代謝途徑的選擇壓力發(fā)生變化。該發(fā)現(xiàn)對理解自然界中硅藻種群的遺傳結構具有重要意義，并為后續(xù)開發(fā)此藻株功能基因組學研究以及生物技術的應用等提供了寶貴的資源。

海洋硅藻T. oceanica顯示出對低鐵條件的顯著耐受性。借助基因組、轉錄組及蛋白組等組學的聯(lián)合分析，揭示了T. oceanica進化出多種復雜的策略來吸收利用鐵。比如，細胞通過降低鐵的需求、提高鐵的吸收及重塑生物能量的通路等適應低鐵環(huán)境。該藻株還可以借助光能利用的重塑和整體光合電子轉移復合體的減少應對鐵缺乏。此外，鐵調節(jié)三種含金屬的二磷酸果糖醛縮酶取代不含金屬的酶系參與碳水化合物代謝轉化。該研究鑒定了高親和力的鐵吸收系統(tǒng)，推測該系統(tǒng)中一些基因是由于復制事件產(chǎn)生。此外，T. oceanica基因組高度可塑性還反應在存在很多基因水平轉移事件上。以上策略為硅藻T. oceanica適應低鐵環(huán)境提供了前提[13]。

產(chǎn)油硅藻F. solarisJPCC DA0580基因組分析數(shù)據(jù)提供了異源二倍體基因組結構的證據(jù)，顯示出該藻株特殊的分子進化過程和遺傳調控系統(tǒng)。F. solaris主要代謝途徑與非產(chǎn)油硅藻相同，但轉錄組分析揭示了油脂合成中一些基因獨特的表達模式變化，如伴隨ATP的產(chǎn)生，細胞會同步上調脂肪酸/三?；视蜕锏暮铣珊椭舅岬摩?氧化降解。這種特殊的基因表達模式可能同時刺激了細胞的生長和油脂的積累，因此，這種新型的產(chǎn)油微藻將來有望應用于生產(chǎn)生物能源[11]。

Galachyants等[14]應用高通量測序方法確定了從貝加爾湖中分離出的F. radians（早先命名為Synedra acussubsp·）的完整基因組序列，組裝后的基因組總長度為98 Mb，平均覆蓋率為33 x。隨后，轉錄組數(shù)據(jù)包含27 446個轉錄本，可能編碼21 996個預測蛋白質。借助測序組裝和注釋與定量實驗相結合的方法，鑒定到指數(shù)生長期和暗適應細胞培養(yǎng)物之間的差異表達轉錄物，以及在暗適應下細胞對光處理的早期響應時基因的表達水平變化。F. radians基因組和轉錄組測序結果為解析該物種適應環(huán)境的分子調控網(wǎng)絡提供了研究基礎[17]。

海洋硅藻Cyclotella cryptica是一種可用于大規(guī)模生產(chǎn)生物燃料和生物產(chǎn)品的微藻。對此種硅藻核基因組和甲基化組進行測序，發(fā)現(xiàn)基因組由高度甲基化的重復序列組成。在硅饑餓條件下甲基化水平不會發(fā)生顯著變化，進一步分析表明DNA甲基化的主要作用是抑制DNA轉座。糖酵解、脂質代謝和碳水化合物降解等過程有助于促使C. cryptica積累三?；视?。該研究還鑒定了參與碳轉運和幾丁質代謝等基因，同時還開發(fā)了新的遺傳操作工具，為遺傳改造該物種并應用于大規(guī)模的生產(chǎn)生物燃料等提供便利[18]。

4.進一步放大我省水稻水產(chǎn)“兩水”資源優(yōu)勢，大力發(fā)展稻漁綜合種養(yǎng)，全省大面積推廣“雙水雙綠”技術規(guī)范，利用國家財政政策性支持資金大面積改造適宜稻田，鼓勵農業(yè)龍頭企業(yè)流轉拋荒的稻田，大面積示范“雙水雙綠”技術，建立公司+農戶的農業(yè)合作社模式，打造綠色水稻、綠色水產(chǎn)的新模式。

寒冷適應型硅藻（F. cylindrus）基因組測序顯示其總基因組大小為 61·1 Mb。作為二倍體生物，研究人員發(fā)現(xiàn)F. cylindrus基因組中大約24·7%的基因組由具有高度不同的等位基因位點組成。細胞中很多此類等位基因在不同環(huán)境條件下，包括黑暗、低鐵、冷凍、高溫和二氧化碳增加，存在差異表達。該項研究為開展硅藻響應及適應逆境（尤其是低溫環(huán)境）的分子機制提供了借鑒[12]。

Basu等[19]研究了海洋浮游硅藻Pseudonitzschia multistriata細胞有性生殖過程，該過程對種群會產(chǎn)生動態(tài)的影響并且需要精確的調控。對P. multistriata基因組測序，系統(tǒng)基因組學及轉錄組學的分析，研究了基因獲得及丟失、水平基因轉移、性相關基因的保存及其進化速率。研究發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體和環(huán)磷酸鳥苷與對有性生殖過程相關，它們可調節(jié)細胞周期、減數(shù)分裂相關和營養(yǎng)轉運等基因。P. multistriata細胞周期和基因組研究可以重建硅藻在其生命周期關鍵階段發(fā)生的變化，為探究基因的進化和其功能的鑒定提供線索，并為有性生殖的研究提供支持。

Ogura等[20]對日本海域主要的赤潮藻Skeletonema costatum進行了基因組及RNA測序的分析。進化基因組學和比較轉錄組學研究結果揭示了氧化脅迫及細胞分裂素應激響應的基因是該硅藻增殖的關鍵。研究結果同時表明S.costatum參與氧化應激和細胞分裂素反應相關的基因為多拷貝，爆發(fā)赤潮時此類基因的表達增強。

Sato等[21]借助超微結構和分子信息來重新分類硅藻Plagiostriatasp· CCMP470（之前被注釋為Leptocylindrus danicus），同時還提供了該藻株的基因組草圖。在Plagiostriata基因組中發(fā)現(xiàn)270個結構域家族數(shù)據(jù)庫（19%）在其他硅藻基因組中是未知的。值得注意的是，Plagiostriata的DNA文庫還包含一種α-變形菌的基因組。該研究對已經(jīng)發(fā)表的藻類基因組和轉錄組數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)了共生的α-變形菌序列，這表明藻類及α-變形菌可能存在廣泛的共存關系。

海洋生物膜形成硅藻Seminavis robusta基因組分析結果表明，基因家族擴展占該物種所有預測蛋白質編碼基因（36254）的1/4。串聯(lián)重復事件在擴展特定基因功能（包括光和氧感應）方面發(fā)揮著關鍵作用，這可能是S. robusta適應底棲環(huán)境的關鍵原因之一。該物種與細菌相互作用差異表達的基因在其他底棲硅藻中高度保守，而許多物種特異性基因在有性生殖階段顯著上調。同時，來自48個株系的重新測序數(shù)據(jù)分析為底棲硅藻的遺傳多樣性和基因功能的提供了見解[22]。

非光合硅藻Nitzschia Nitz4基因組測序分析了碳代謝在異養(yǎng)型硅藻中營養(yǎng)方式的轉變。分析結果顯示，該硅藻整個細胞范圍都進行了異養(yǎng)型轉變。N. Nitz4細胞保留了質體及質體基因組，但是細胞核和質體基因組中光合作用相關基因的丟失。硅藻質體中不合成類異戊二烯，線粒體糖酵解發(fā)生重塑，以便于最大限度地提高ATP產(chǎn)量。N.Nitz4基因組包含一個β-己二酸酮途徑，該途徑可能允許N. Nitz4能夠代謝木質素衍生化合物。該硅藻質體缺乏氧化磷酸戊糖途徑，使得非光合質體中NADPH的來源受到限制。該基因組研究揭示了非光合硅藻和頂復門原蟲之間在質體中提供NADPH的相似性，并強調了質體氧化磷酸戊糖途的缺失是導致光合作用喪失潛在的重要因素[23]。

全基因組復制事件與物種形成、增加譜系多樣化有關，并被確定為被子植物進化的主要驅動力。Parks等首次使用基因計數(shù)、基因進化樹和同義分歧分布對 37 種不同的硅藻物種進行全基因組復制的系統(tǒng)發(fā)育分析，并搜集了大量證據(jù)表明多倍體在硅藻中可能很常見。研究結果支持在Thalassiosiroid和羽紋綱硅藻進化分枝中存在古老的異源多倍體事件，并且異源多倍體作為多倍體形成的主要模式。該項研究證實了全基因組復制在硅藻基因組的進化中發(fā)揮了重要作用[24]。

1.2 質體基因組及線粒體基因組研究

藍藻是真核藻類及高等植物質體的祖先。通過內共生過程產(chǎn)生質體是真核生命史上最重要的事件之一。在此過程中，藍藻與宿主真核生物在遺傳、生化和細胞等生物過程整合，為藻類在復雜水生環(huán)境中的適應及進化鋪平了道路。部分真核藻類，包括硅藻，進化過程中質體也發(fā)生多次內共生事件[3]。

Moustafa等[25]早期研究發(fā)現(xiàn)硅藻核基因組中包含紅藻和綠藻基因，大約70%來自綠藻，并提出硅藻中可能隱藏著綠藻次級質體的假設。對硅藻基因組進行重新分析，結合紅藻基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中約13%水平基因轉移事件可以從藍藻到綠藻再到硅藻進行追蹤，約66%ne內共生基因轉移事件可以追溯到紅藻[26]。Morozov等[27]研究發(fā)現(xiàn)，硅藻核基因組中紅藻和綠藻水平基因轉移事件發(fā)生相對次數(shù)大致相等，這導致他們質疑硅藻祖先中是否存在完全整合綠藻的衍生質體。一些研究學者認為硅藻綠藻來源的基因更有可能是在固定紅藻的衍生質體之前涉及至少兩個不同的綠藻內共生體。

菱形硅藻（Epithemia turgida）屬于Rhopalodiaceae家族的硅藻，其內共生體為非光合藍細菌（即“球體”，簡稱EtSB）。完整基因組測序結果顯示，與該共生體的近親相比，EtSB基因組大小和基因庫有所減少。同時，研究還發(fā)現(xiàn)其基因組中存在大量的假基因，表明基因組仍在繼續(xù)減少過程中。此外，測序數(shù)據(jù)顯示EtSB已經(jīng)失去了光合作用的能力，并在代謝上依賴于其宿主細胞。因此，EtSB作為一個獨特內共生體，可以用于研究藍細菌內共生體整合到真核細胞中的過程[28]。

Nitzschia palea是一種常見的淡水硅藻，因其對受污染水道的耐受性而被用作生物指示劑。有證據(jù)表明它可能是“dinotom”甲藻（Durinskia baltica）內的第三內共生體。來自N. palea基因組DNA 被深度測序，并組裝了葉綠體和線粒體基因組。單基因系統(tǒng)發(fā)育將N. palea-Wise分組在一個明確定義的N. palea進化枝中，并顯示它與株系“SpainA3”最密切相關。N. palea的葉綠體基因組為119 447 bp，具有135個蛋白質編碼、28個tRNA和3個rRNA基因。線粒體基因組為37 754 bp，具有37個蛋白質編碼、23個tRNA和2個rRNA 基因。N. palea和D. baltica的葉綠體基因組具有相同的基因含量、同線性和92·7%的成對序列相似性，并且大多數(shù)差異發(fā)生在基因間區(qū)域。N. palea線粒體基因組和D. baltica的內共生線粒體基因組也具有相同的基因含量和順序，序列相似性為 90·7%。基于基因組的系統(tǒng)發(fā)育，表明D. baltica與N. palea比目前可用的任何其他硅藻序列更相似。這些數(shù)據(jù)表明它們與D.baltica的內共生體非常相似[29]。

Górecka等[30]完成了Schizostauron trachyderma完整質體和線粒體基因組的測序分析。該物種線粒體基因組大小為41 957 bp，并在cox1基因中顯示兩個II組內含子。質體基因組大小為187 029 bp，具有典型的硅藻質體基因組結構。它在petB基因中包含一個II類內含子，該內含子與大單拷貝和反向重復區(qū)域重疊。在rnl基因中還有一組IB4內含子預測可以編碼LAGLIDADG歸巢核酸內切酶。多基因的系統(tǒng)發(fā)育提供了更多證據(jù)表明S.trachyderma接近fistula-bearing的雙殼硅藻。

2 硅藻功能基因組學研究

2.1 多組學研究

基因組注釋結合轉錄本分析構建了三角褐指藻（PtDB）和偽矮海鏈藻（TpDB）的結構化EST數(shù)據(jù)庫。三角褐指藻中生成了超過12 000個表達序列標簽（EST），對該物種基因進行功能注釋，并創(chuàng)建可通過 Internet 訪問的可查詢硅藻EST數(shù)據(jù)庫[31]。早期報道涉及多種模式硅藻比如三角褐指藻和偽矮海鏈藻的轉錄組及蛋白組學等研究[32]。此外，研究人員還開展了包括代謝組學、脂質組學及糖組學等相關研究。

Popko等[33]分析了氮限制條件下PhaeodactylumPt4（UTEX 646）藻株脂質組分的變化。數(shù)據(jù)顯示在氮耗殆盡時，中性脂質增加，主要是16∶0和16∶1（n-7）在甘油三酯中積累。脂質分子種類組成表明甘油三酯主要來自1，2-二?；视?O-4'-（N，N，N-三甲基）高絲氨酸的重塑，但不排除來自質體單半乳糖基二?；视偷呢暙I。有趣的是，酰基輔酶A池富含的20∶5（n-3）和22∶6（n-3）脂肪酸幾乎不在甘油三酯中。此外，在氮饑餓下，最明顯消耗代謝物是氨基酸、溶血磷脂和三羧酸循環(huán)的中間體，而含硫代謝物以及肉堿增加。這些數(shù)據(jù)現(xiàn)在共同為改善三角褐指藻株Pt4中脂質的儲存和生產(chǎn)提供了基礎。

通過整合基因組、轉錄組、蛋白組及蛋白修飾組等多組學數(shù)據(jù)，Yang等[34]構建了三角褐指藻蛋白質基因組精細圖譜。該研究校正了506個注釋的編碼基因和73個注釋基因的可變剪切位點。此外，研究鑒定了606個新的蛋白質編碼基因，268個小肽及21個新的可變剪切體。同時，研究人員還在三角褐指藻細胞中鑒定了20多種不同種類的蛋白質翻譯后修飾，它們可能參與調控細胞逆境脅迫下的多種生物學過程。

Feij?o等[35]研究調查了溫度升高對三角褐指藻中脂質類別和編碼與脂質代謝相關酶的基因表達的影響。海洋溫度升高導致質體脂質相對量的增加，如糖脂單半乳糖基二酰基甘油、二半乳糖基二?；视秃土虼愂罄钐腔；视?，同時中性脂質減少，其中包括三?；视汀Ｅc脂質含量增加一致的是，編碼單半乳糖基二酰基甘油合成酶基因的上調及甘油三酯合成中的關鍵酶二?；视王；D移酶的下調。研究還表明，海水溫度升高會對不飽和脂肪酸的豐度產(chǎn)生負面影響，例如二十碳五烯酸（20∶5 n-3）和十六碳三烯酸（16∶3 n-4），同時也誘導不同膜脂質的相對量以及膜/儲存脂質的比例發(fā)生變化。脂質代謝關鍵基因的表達在轉錄或轉錄后水平受到調節(jié)。

Jin等[36]以三角褐指藻為材料，針對其在長期海洋酸化后進行了脂質組分析。該研究共鑒定長期高CO2（即海洋酸化條件）和低CO2（即環(huán)境條件）下476種脂質代謝物。進一步研究表明，細胞在長期高CO2環(huán)境下通過下調33種和上調42種脂質代謝物來適應環(huán)境。單半乳糖基二?；视驮陂L期高CO2選擇條件下顯著下調，但大多數(shù)（～80%）磷脂酰甘油（PG）上調。揭示了脂質重塑是海洋硅藻應對正在進行的海洋酸化適應策略。

蛋白質翻譯后修飾在硅藻中已經(jīng)開展相關研究[32，34]，包括磷酸化[37]、乙?；痆38]及N-糖基化等。Xie等[39]鑒定三角褐指藻中的639種N-糖蛋白及863種不同的N-糖肽。其中，參與N-糖基化途徑的12種蛋白質被鑒定為N-糖蛋白。同時，該項研究分析了N-聚糖結構，更新了微藻中的N-聚糖數(shù)據(jù)庫。Behnke等[40]研究了T.oceanica中蛋白的 N-連接糖基化途徑，鑒定參與N-連接糖基化途徑必需的代謝酶。研究還鑒定了118個N-連接糖基化肽段，81%肽段具有NXT型基序（X是除脯氨酸以外的任何氨基酸）。

2.2 基因編輯研究

基因組測序完成后，通常借助缺失、過表達及亞細胞定位等相關技術探究基因功能[41]。相比隨機誘變方法，近年來，TALENs（Transcription activator-like （TAL） effector nucleases）和CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）系統(tǒng)被廣泛用于硅藻目的基因進行定點修飾和靶向敲除[42-43]。由于TALEN技術的復雜性限制了其在硅藻分子遺傳學中的應用，而CRISPR/Cas9技術越來越多被研究人員選用。Cas9（D10 A）核酸酶是Cas9核酸酶的突變形式，可以用于引入目標 DNA并進行精確的雙切割，因而抑制了天然Cas9核酸酶的脫靶效應。該項研究用于偽矮海鏈藻預測的θ型碳酸酐酶基因，實現(xiàn)了在硅藻基因組引入精確且相對較短的雙等位基因插入缺失，且脫靶效應最小[44]。目前，CRISPR/Cas9技術在硅藻細胞中精準編輯及優(yōu)化正在進行中。

3 總結與展望

硅藻是食物鏈底層中最多樣化和最成功的浮游植物之一，調節(jié)地球的生物地球化學循環(huán)。近年來，為了探索硅藻的進化過程，多種模式物種也在陸續(xù)開展功能基因組學的研究。針對已經(jīng)完成的硅藻基因組進行了綜合比較分析，概述了其次級內共生起源、基因水平轉移、特殊代謝途徑及環(huán)境適應機制等多個生物學現(xiàn)象的研究進展。此類研究極大擴展人們對硅藻基因組復雜性的認識。同時展望了硅藻基因組學的發(fā)展方向，以及在全基因組水平上開展重要功能基因驗證等科學問題。未來硅藻物種測序將借助多組學聯(lián)合分析，采用更多新的技術手段，包括單細胞基因組、單細胞轉錄組、單細胞蛋白組及亞細胞定位組學等前沿技術，優(yōu)化基因編輯技術，同時利用基因工程及合成生物學等技術手段來開發(fā)利用硅藻資源。基因組學的深入研究將有助于進一步揭示硅藻重要的生物學特性及環(huán)境適應性等。