AlkB蛋白介導(dǎo)的核酸去甲基化在植物中的研究進(jìn)展

●周 穎

（重慶大學(xué)生物工程學(xué)院 重慶 404100）

AlkB蛋白介導(dǎo)的核酸去甲基化屬于表觀遺傳領(lǐng)域，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)上的一個(gè)熱門研究方向，已在癌癥早篩、伴隨診斷、藥物研發(fā)上有所應(yīng)用，如m6A去甲基化酶FTO可運(yùn)用在抑制白血病細(xì)胞增殖上，有望成為白血病新的分子治療靶點(diǎn)和臨床預(yù)后指標(biāo)[1]；ALKBH5抑制物可用于治療病毒感染性疾病或與病毒感染相關(guān)的疾病[2]。但是到目前為止，關(guān)于其家族去甲基化的研究主要集中在人和哺乳動(dòng)物，對(duì)植物的研究則相對(duì)較少，通過綜述該家族蛋白在植物領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，以期為其植物領(lǐng)域上的研究提供理論依據(jù)。

1 甲基化與去甲基化

甲基化是核酸化學(xué)修飾中最多的一種，它不改變基因的序列，卻對(duì)基因表達(dá)、細(xì)胞命運(yùn)及個(gè)體發(fā)育等過程起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。目前，已報(bào)道發(fā)生在 DNA上的甲基化修飾有3種：5-甲基胞嘧啶（5-mC），是最重要的一種DNA甲基化修飾，廣泛存在于植物、動(dòng)物等真核生物基因組中，被稱為“第五堿基”；5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），也稱哺乳動(dòng)物的“第六堿基”；N6-甲基腺嘌呤（N6-mA），最先在小鼠胚胎干細(xì)胞DNA修飾中被發(fā)現(xiàn)，也存在于細(xì)菌、藻類及動(dòng)植物基因組中。已報(bào)道發(fā)生在RNA上的甲基化有3種：N6-腺苷酸甲基化（m6A），是RNA上最豐富的一種修飾，存在于大多數(shù)真核生物和一些病毒的mRNA中，也存在于tRNA、rRNA、snRNA以及l(fā)ncRNA中；N1-腺苷酸甲基化（m1A）；胞嘧啶羥基化（m5C）。同時(shí)，人們對(duì)與甲基化相對(duì)應(yīng)的去甲基化過程越來越感興趣，研究發(fā)現(xiàn)了一種蛋白——AlkB，它可以去除DNA、RNA中的甲基和其他烷基，實(shí)現(xiàn)核酸化學(xué)修飾的可逆性。

2 AlkB蛋白的結(jié)構(gòu)特征

1983年，Kataoka等[3]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌突變菌株對(duì)甲基磺酸甲酯（MMS）十分敏感，并將該潛在功能基因命名為AlkB。隨后分析證實(shí)了AlkB是鐵（II）和α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶超家族，它以亞鐵離子為輔因子，α-酮戊二酸為共底物進(jìn)行各種氧化反應(yīng)，進(jìn)而去除DNA、RNA中的甲基和其他烷基，實(shí)現(xiàn)核酸化學(xué)修飾的可逆性。

大多數(shù)AlkB家族成員都包含一個(gè)由200～300個(gè)氨基酸組成的“Jelly-roll”拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，即AlkB結(jié)構(gòu)域，其主要由兩個(gè)β折疊片組成，也稱雙鏈β-螺旋（DSBH）。在DSBH核心“開放端”的組氨酸-X-天冬氨酸（HXD）基序，以及其下游的第二個(gè)組氨酸是這個(gè)家族中高度保守的基序。HXD這三個(gè)殘基能催化鐵原子的配位，并且α-酮戊二酸輔因子的兩個(gè)氧原子也能進(jìn)一步形成鐵的八面體配位。DSBH上的最后一個(gè)β折疊始末有兩個(gè)保守的精氨酸殘基，能與2-OG形成鹽橋相互作用，進(jìn)一步穩(wěn)定α-酮戊二酸的結(jié)合[4]。該家族還存在一個(gè)保守的核苷酸識(shí)別蓋，由一個(gè)小的β折疊組成，有助于識(shí)別底物特異性。除了催化、識(shí)別上具有保守性質(zhì)外，AlkB家族的堿基結(jié)合成員還有一個(gè)特征，就是所結(jié)合的殘基都是有芳香堆積在受損堿基上，盡管在不同的家族成員之間沒有嚴(yán)格保守的芳香殘基類型。

3 植物的AlkB蛋白

近些年，AlkB家族蛋白的生物學(xué)功能、生化活性和結(jié)構(gòu)特征主要集中在哺乳動(dòng)物與大腸桿菌上進(jìn)行研究，在植物中的報(bào)道很少。目前，在擬南芥中共鑒定出13個(gè)AlkB家族基因，即：ALKBH1A、ALKBH1B、ALKBH1C、ALKBH1D、ALKBH2、ALKBH6、ALKBH8A、ALKBH8B、ALKBH9A、ALKBH9B、ALKBH9C、ALKBH10A和ALKBH10B。其中ALKBH9A、ALKBH9B、ALKBH9C、ALKBH10A和ALKBH10B具有與人類 ALKBH5蛋白最相似的氨基酸序列。

擬南芥AtALKBH2蛋白對(duì)DNA中的甲基和乙烯加合物表現(xiàn)出體外修復(fù)活性，敲除AtALKBH2基因后植株對(duì)甲基化誘變劑MMS敏感，種子、葉片形狀不正常，細(xì)胞壞死增加，說明AtALKBH2能夠保護(hù)擬南芥免受DNA甲基化損傷，與其他AlkB同系物一樣，在擬南芥中行使去甲基化功能[5]。AtALKBH6為潛在的去甲基化酶，具有與m6A和m5C RNA結(jié)合的能力，在種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[6]。AtALKBH8A與哺乳動(dòng)物ALKBH8的功能類似，參與成熟tRNA的加工[7]。AtALKBH8B在擬南芥對(duì)鹽脅迫和脫落酸（ABA）的反應(yīng)中起作用。AtALKBH8B過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表現(xiàn)出耐鹽性，與野生相比，AtALKBH8B過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的總m6A水平降低。外源施加ABA后，AtALKBH8B突變體植株的子葉綠化和幼苗生長(zhǎng)遠(yuǎn)高于野生型[8]。AtALKBH9B具有6-meA去甲基化酶活，并與苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白相互作用，最終影響病毒感染[9]。擬南芥中敲除ALKBH10B，增加了開花激活因子（FT）及其上游基因SPL3和SPL9的m6A修飾，高甲基化的mRNA加速衰變，從而表現(xiàn)出開花延遲，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)受到抑制的表型[10]。在含有2μ、4μ的ABA培養(yǎng)基上，AtALKB10B突變體的根長(zhǎng)受到明顯的抑制，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ABI3和ABI4基因表達(dá)量上調(diào)，說明AtALKB10B還與ABA相關(guān)。AtALKBH10B突變體的還表現(xiàn)出耐鹽表型，在鹽脅迫下ATAF1、BGLU22和MYB73的表達(dá)量下調(diào)[11]。

隨后，其他植物中的AlkB蛋白也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。西瓜ClALKBH2B和ClALKBH4B受不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，且ClALKBH4B 基因可抑制黃瓜綠斑駁花葉病毒積累[12]。水稻OsALKBH1對(duì)ss DNA的m1d A具有去甲基化的酶活，且其酶活強(qiáng)于m6dA，并通過EMSA等實(shí)驗(yàn)證明OsALKBH1與ss DNA、ds DNA存在互作[13]。番茄中的SLALKBH2可介導(dǎo)6-meA去甲基化酶通過穩(wěn)定SlDML2mRNA的水平來促進(jìn)番茄果實(shí)成熟[14]。番茄SLALKBH3可以通過影響3'UTR區(qū)域中乙烯相關(guān)基因的m6A修飾的表達(dá)量來調(diào)控番茄花柄脫落[15]。番茄中還存在一個(gè)與哺乳動(dòng)物ALKBH2同源的蛋白，序列號(hào)為XP_004236651，對(duì)該基因敲除，發(fā)現(xiàn)突變體植株對(duì)DNA甲基化劑MMS高度敏感，具體表現(xiàn)在幼苗的生長(zhǎng)延緩、種子發(fā)芽率低、離體葉片快速衰老以及畸形率升高，并且敲除該同源基因還會(huì)導(dǎo)致具有高轉(zhuǎn)錄活性的rDNA甲基化程度升高[16]。

4 總結(jié)與展望

近年來，隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，在分析ALKB家族蛋白以及去甲基化方面取得了很大進(jìn)展，但是也存在一些疑問。比如擬南芥的AtALKBH10B雖屬ALKB同源物，但并不具有該家族鐵（II）和α-酮戊二酸依賴性雙加氧的典型的結(jié)構(gòu)域，卻也同樣具有去甲基化的功能，那么猜測(cè)是否該家族還存在其他發(fā)揮作用的位點(diǎn)亦或是其他原因。此外，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各階段中，ALKB受什么信號(hào)調(diào)控、何時(shí)發(fā)生去甲基化、如何維持植物體內(nèi)甲基化與去甲基化的動(dòng)態(tài)平衡等，還需要未來進(jìn)一步研究，進(jìn)而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有更好運(yùn)用。