動(dòng)物細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)狀

1 貼壁培養(yǎng)

貼壁培養(yǎng)是在某一固相表面貼附細(xì)胞并對(duì)其培養(yǎng)的一種動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)，動(dòng)物細(xì)胞必須貼附于攜帶有部分電荷的固體表面或者半固體表面，只有這樣動(dòng)物細(xì)胞才能生長(zhǎng)。目前，大部分動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)均為這一類型。

1.1 生長(zhǎng)特性

在培養(yǎng)貼壁依賴型細(xì)胞時(shí)，必須保證其緊密附著于培養(yǎng)器皿壁上或培養(yǎng)瓶瓶壁上，細(xì)胞原本形狀為圓形，在其貼壁后將會(huì)立即鋪展開來，并進(jìn)行有絲分裂，在很短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞便會(huì)開始對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。通常僅需數(shù)日細(xì)胞就會(huì)將培養(yǎng)壁表面鋪滿，同時(shí)構(gòu)建一個(gè)密集性較高的細(xì)胞單層。需注意的是，貼壁表面必須具備高度表面活性并攜帶有凈陽(yáng)電荷，同時(shí)要求微載體具備一定電荷密度，如果貼壁表面為有機(jī)物表面，還需保證其具備明顯的親水性特點(diǎn)，同時(shí)攜帶有陽(yáng)性電荷。

1.2 貼壁培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)

第一，細(xì)胞會(huì)在固相表面緊密附著，在培養(yǎng)過程中可將舊培養(yǎng)液直接倒掉，清洗干凈后直接裝入新的培養(yǎng)液，更換培養(yǎng)液較為便利。第二，由于細(xì)胞在載體表面固定，此方式無需配備過濾系統(tǒng)，可通過灌注方式以提升細(xì)胞密度。第三，在細(xì)胞附著于生長(zhǎng)基質(zhì)表面時(shí)，細(xì)胞對(duì)某一產(chǎn)品的表達(dá)效果將更加理想。第四，可利用統(tǒng)一設(shè)備對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)可以結(jié)合實(shí)際需求調(diào)整細(xì)胞液及細(xì)胞間的比例。

1.3 貼壁培養(yǎng)缺點(diǎn)

在細(xì)胞貼壁后，其消化難度較大，最終會(huì)增加擴(kuò)大培養(yǎng)的難度。培養(yǎng)過程中培養(yǎng)設(shè)施需要較大的占地面積，同時(shí)相關(guān)設(shè)備需要較多的資金。在細(xì)胞反應(yīng)器培養(yǎng)過程中，無法通過顯微鏡觀察細(xì)胞，無法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。在控制細(xì)胞環(huán)境的過程中，很難實(shí)現(xiàn)完全的均勻化。

1.4 貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)

1.4.1 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)

在貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)過程中，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)是最早采用的一種系統(tǒng)。在小型培養(yǎng)過渡至大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，一般采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)瓶（旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器）中接種細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)瓶的持續(xù)旋轉(zhuǎn)作用下培養(yǎng)細(xì)胞，這樣細(xì)胞能夠交替接觸空氣及培養(yǎng)液，獲取良好的傳熱條件，傳質(zhì)條件轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的主要特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無需投入過量資金及設(shè)備、技術(shù)較為成熟，同時(shí)這一系統(tǒng)具備良好的重復(fù)性，僅僅需要對(duì)轉(zhuǎn)瓶數(shù)量增加以實(shí)現(xiàn)放大。但是轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)也存在一定的缺點(diǎn)：即需要占據(jù)較大的空間，勞動(dòng)強(qiáng)度較大，單位體積僅可提供較小的細(xì)胞生長(zhǎng)表面積，同時(shí)其細(xì)胞生長(zhǎng)密度并不高，在培養(yǎng)過程中無法實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境條件的有效監(jiān)測(cè)及控制。目前，常見的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)可以分為二氧化碳培養(yǎng)箱及轉(zhuǎn)瓶機(jī)。

1.4.2 反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)

在應(yīng)用反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，細(xì)胞主要在固定表面貼附并生長(zhǎng)，在攪拌作用下細(xì)胞不會(huì)隨著培養(yǎng)液共同流動(dòng)，基于此，培養(yǎng)液更換較為便利，無需特定的細(xì)胞分離及培養(yǎng)液設(shè)備，通過灌流培養(yǎng)即可獲取較高的細(xì)胞密度，在此基礎(chǔ)之上獲取相關(guān)產(chǎn)品；但是在具體應(yīng)用過程中很難擴(kuò)大規(guī)模，無法對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況直接監(jiān)控，因而這一系統(tǒng)常用于價(jià)值較高、用量少的生物藥品制備。常見細(xì)胞貼壁載體主要包括中空纖維、微載體系統(tǒng)及玻璃珠等。能夠培養(yǎng)雜交瘤系統(tǒng)、CHO 細(xì)胞等多種系統(tǒng)。另外，利用反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，在接種細(xì)胞后貼壁速度極快。

2 懸浮培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)是在反應(yīng)器內(nèi)接入細(xì)胞，使其自由懸浮生長(zhǎng)，或在轉(zhuǎn)動(dòng)裝置、震蕩裝置的作用下保證細(xì)胞分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)方法。懸浮培養(yǎng)技術(shù)主要基于微生物發(fā)酵技術(shù)，一般用于培養(yǎng)非貼壁依賴型細(xì)胞。

2.1 生長(zhǎng)特性

懸浮培養(yǎng)技術(shù)就是分散活體動(dòng)物組織，對(duì)其離心、純化及漂洗后選擇適宜的培養(yǎng)液接種，使細(xì)胞在特定條件下懸浮生長(zhǎng)。無血清懸浮培養(yǎng)采用已知來源的激素或蛋白質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞，無需后期純化，可簡(jiǎn)化操作流程，提升產(chǎn)品質(zhì)量，近年來已經(jīng)逐漸成為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的重要研究方向。

2.2 懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)

第一，懸浮培養(yǎng)技術(shù)操作簡(jiǎn)便，方便定量研究；第二，懸浮培養(yǎng)技術(shù)具備良好的傳質(zhì)及傳氧特性，可幫助細(xì)胞充分接觸培養(yǎng)基內(nèi)氣體及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，便于控制培養(yǎng)條件；第三，懸浮培養(yǎng)技術(shù)使用過程中無需附著物；第四，利用懸浮培養(yǎng)法細(xì)胞可快速繁殖，可提高產(chǎn)量，同時(shí)其各項(xiàng)設(shè)備結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)便；第五，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中無需對(duì)其再分散，僅需嚴(yán)格按照相關(guān)比例做好稀釋工作，便可繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)其培養(yǎng)規(guī)模方便擴(kuò)大，可連續(xù)提高生產(chǎn)量。即使在連續(xù)密閉系統(tǒng)內(nèi)也可以培養(yǎng)細(xì)胞，簡(jiǎn)化操作步驟，減少污染。

2.3 懸浮培養(yǎng)的缺點(diǎn)

第一，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞密度不高，很難進(jìn)行灌流培養(yǎng)；第二，培養(yǎng)過程中可能存在潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，在病毒培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)喪失病毒標(biāo)記的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致免疫能力降低；第三，適宜懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞種類并不多，多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞適宜采取貼壁培養(yǎng)方式。

3 固定化培養(yǎng)

固定化培養(yǎng)技術(shù)就是結(jié)合動(dòng)物細(xì)胞及水不溶性載體，在此基礎(chǔ)上培養(yǎng)細(xì)胞的方式。固定化培養(yǎng)所培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度高，具備較強(qiáng)的抗污染及抗剪切能力，產(chǎn)物及細(xì)胞易分開，方便分離并純化產(chǎn)物。常見的固定化培養(yǎng)方式包括以下幾種：

3.1 吸附法

吸附法就是將細(xì)胞吸附于固體吸附劑表面，從而固定細(xì)胞的方式。吸附法在應(yīng)用過程中條件溫和、操作簡(jiǎn)便，是研究歷史最為悠久的一種動(dòng)物細(xì)胞固定化培養(yǎng)方法。吸附法也存在一定缺陷，即其載體缺乏足夠的負(fù)荷能力，導(dǎo)致細(xì)胞極容易脫落。吸附法最為常見的是中空纖維培養(yǎng)及微載體培養(yǎng)。

3.2 包埋法

包埋法就是采用多孔載體，在其中包埋細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的固定化。包埋法操作條件溫和、負(fù)荷量較大、很少出現(xiàn)細(xì)胞泄露、操作簡(jiǎn)便，具備抗機(jī)械剪切的效果。但是其缺點(diǎn)為限制擴(kuò)散，無法保證全部細(xì)胞均處于最佳基質(zhì)濃度，分子量較大的基質(zhì)很難向高聚物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部滲透。包埋法一般用于固定非貼壁依賴型細(xì)胞，通常采取多孔凝膠載體。

3.3 共價(jià)貼附法

共價(jià)貼附法就是在共價(jià)鍵的作用下將動(dòng)物細(xì)胞固定于固相載體上。共價(jià)吸附法能夠降低細(xì)胞泄露量，但是在具體應(yīng)用過程中必須利用化學(xué)試劑，而化學(xué)試劑可能會(huì)影響細(xì)胞活性，無法有效保護(hù)細(xì)胞。

3.4 微囊法

微囊法就是利用親水半透膜包裹細(xì)胞，使之處于珠狀微囊中，這樣能夠有效阻止細(xì)胞溢出，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及小分子物質(zhì)在半透膜上的自由出入不會(huì)造成任何影響；在囊內(nèi)可營(yíng)造一個(gè)與液體培養(yǎng)相似的培養(yǎng)環(huán)境，避免細(xì)胞受損。采用微囊法所培養(yǎng)細(xì)胞可良好生長(zhǎng)，同時(shí)其培養(yǎng)密度也較高。

3.5 離子/共價(jià)交聯(lián)法

離子/共價(jià)交聯(lián)法就是對(duì)細(xì)胞懸浮液采用雙功能試劑處理，可連接細(xì)胞并產(chǎn)生交聯(lián)作用，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的固定化培養(yǎng)。但是這種培養(yǎng)方式在具體應(yīng)用過程中，可能會(huì)導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡，也會(huì)造成擴(kuò)散限制。