膠體金試紙條檢測沙門氏菌的綜合實(shí)驗(yàn)與研究

周麗（南昌市青云譜區(qū)疾控中心,江西 南昌 330000）

食源性致病菌是影響食品安全最為主要的因素，因此為了能夠快速檢測出食源性致病菌，需要采用更為簡潔、快速的技術(shù)，以為治療食源性致病菌提供便利。目前應(yīng)用于實(shí)際檢測的方法為酶聯(lián)免疫吸附、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等，雖然這些方法的可靠性具有一定的保證，但是實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長，無法滿足臨床檢測的需要。為此，為了能夠快速地檢測出沙門氏菌等食源性致病菌，可利用具備生物親和性的納米金對(duì)沙門氏菌抗體進(jìn)行檢測，通過對(duì)檢測線的捕捉，判斷顏色條帶，實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌的定性和定量檢測。

1 膠體金試紙條檢測沙門氏菌綜合實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

膠體金技術(shù)是一種極為常用的分析技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)主要采用納米金技術(shù)，借助膠體金的穩(wěn)定性和靈敏性制備試紙條，對(duì)沙門氏菌進(jìn)行現(xiàn)場檢測和臨床試驗(yàn)。

1.1 主要應(yīng)用試劑 本次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的試劑為二水合檸檬酸三鈉、氯金酸、碳酸鉀、鹽酸。實(shí)驗(yàn)所有試劑均購自長期合作的化學(xué)試劑公司。同時(shí)，本次實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用了來自菲鵬生物股份有限公司的羊抗小鼠二抗，而沙門氏菌抗體則購自長期合作的Abcam公司[1]。此外，在開展實(shí)驗(yàn)的過程中，還需用到牛血清白蛋白、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌。為了保證實(shí)驗(yàn)的效果，需要借助樣品墊、結(jié)合墊和NC膜。

1.2 主要儀器 實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的儀器包括對(duì)抗體以及試劑進(jìn)行重量稱量的電子天平，用于觀測抗體變化的離心機(jī)、投射電鏡，以及用于觀測實(shí)驗(yàn)顏色變化的紫外光光度計(jì)。在實(shí)驗(yàn)過程中，還需應(yīng)用對(duì)試劑攪拌、樣品混合的控溫磁力攪拌器、恒溫振蕩器、高速切條機(jī)。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，利用超聲波清洗器對(duì)所有實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清洗。

1.3 納米金制備 本次實(shí)驗(yàn)主要采用檸檬酸鈉還原法對(duì)納米粒子進(jìn)行合成。利用濃度為0.029mol/L的氯金酸鈉溶液與超純水進(jìn)行混合，并將混合后的溶液添加至200ml的三口燒瓶中，利用磁力攪拌器對(duì)其進(jìn)行攪拌并加熱，直至將溶液煮沸。并在最短時(shí)間內(nèi)向煮沸的溶液中添加新鮮配置的檸檬酸鈉溶液，將混合溶液進(jìn)行加熱回流，待15min后停止加熱，將其放置于4℃的環(huán)境中進(jìn)行儲(chǔ)存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用[2]。

1.4 NC膜組裝 對(duì)沙門氏菌單抗進(jìn)行檢測，需要將其與羊抗鼠結(jié)合后，利用PB溶液對(duì)其進(jìn)行稀釋，以便能夠在后續(xù)實(shí)驗(yàn)的過程中利用三維劃膜儀對(duì)沙門氏菌單抗進(jìn)行檢測。在對(duì)其進(jìn)行檢測的過程中，要將沙門氏菌與單抗鼠結(jié)合放置于NC膜的劃線位置，以便能夠保證檢測線和質(zhì)控線對(duì)實(shí)驗(yàn)體進(jìn)行檢測。此外，在進(jìn)行檢測前，需將劃好線的NC膜放置于溫度為37℃的鼓風(fēng)干燥箱中，靜置2.5h后，再對(duì)其進(jìn)行烘干，將NC膜密封，保存在干燥處。

1.5 試紙條組裝 試紙條的組裝需要用到樣品墊和吸水紙，利用數(shù)控裁條機(jī)將樣品墊和吸水紙裁成的規(guī)格大小為200mm×20mm，并將NC膜貼附于PVC底板上，使得被貼合后的NC膜能夠接近檢測線一端，待兩者重合后，保證其縫隙小于1mm，再將樣品墊緊緊貼合至PVC底板上，并保證其與結(jié)合墊結(jié)合的厚度在2mm左右。同時(shí)，將與吸水紙重合后的NC膜貼合至靠近質(zhì)控線的一端。待上述步驟完成后，對(duì)其進(jìn)行切割，切割至大小為3mm×6.5cm的試紙條，并將其放置于存有干燥劑的自封袋中。

2 膠體金試紙條檢測沙門氏菌綜合實(shí)驗(yàn)探究

利用膠體金試紙條對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測，需要在進(jìn)行檢測前制定完備的檢測方案，基于沙門氏菌的檢測原理，在特定條件下對(duì)其進(jìn)行檢測。在進(jìn)行檢測的過程中，應(yīng)當(dāng)針對(duì)不同濃度的沙門氏菌設(shè)計(jì)不同的檢測方案，進(jìn)行特異性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。

2.1 檢測原理 膠體金試紙條對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測，主要是基于抗體的免疫反應(yīng)以及層析作用，利用納米金探測針實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌的識(shí)別。在進(jìn)行檢測的過程中，在毛細(xì)作用的幫助下將納米金與沙門氏菌的混合溶液自NC膜向吸水紙方向推動(dòng)。待沙門氏菌與納米金混合后到達(dá)質(zhì)控線時(shí)，其會(huì)被處于質(zhì)控線的沙門氏菌抗體捕獲，從而形成鮮明的顏色條帶。而一直處于游離狀態(tài)的納米探針則會(huì)繼續(xù)向前移動(dòng)，待其被檢測線上的沙門氏菌抗體捕獲后，會(huì)再次形成顏色條帶[3]。但是如果樣品中并未含有沙門氏菌，則只能依靠檢測線的二抗作用進(jìn)行顯色。如在檢測后試紙條上的檢測線和質(zhì)控線都顯色，則表示樣品中含有沙門氏菌。當(dāng)只有檢測線顯色時(shí)，則表示樣品中并不含有沙門氏菌。而如果質(zhì)控線不顯色，則表示納米金金屬探針不能與檢測線進(jìn)行二抗結(jié)合，表示實(shí)驗(yàn)失效。整個(gè)實(shí)驗(yàn)無需采用大型儀器，只需裸眼就可分辨沙門氏菌的存在。

2.2 檢測方案 首先，提取大約50μL的沙門氏菌樣品，將其放置于微孔板中，并在樣品中添加納米金探針，再向其中添加濃度為2%的重懸液，待其體積達(dá)到100μL后，使其進(jìn)行10min的孵育。其次，將試紙條樣品墊插入混合后的溶液中，待溶液層析出爬條后，再將其放置于微孔板中，并再次加入50μL的重懸液，利用重懸液對(duì)爬條進(jìn)行清洗。最后，將其靜置20min后，觀察爬條的顯色情況，并利用智能手機(jī)進(jìn)行拍照留存，通過Image軟件對(duì)檢測線上的灰度值進(jìn)行測量，將其標(biāo)志為檢測信號(hào)，記錄樣品的灰度值和空白樣品的灰度值，以備后續(xù)使用。

2.3 檢測條件 構(gòu)建沙門氏菌的檢測條件，需要采用單因素變量法，利用其對(duì)檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，以便使沙門氏菌在最優(yōu)條件下進(jìn)行檢測。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過程中，要事先觀察爬條的顯色情況，利用已經(jīng)測定的灰度值計(jì)算出檢測沙門氏菌的最優(yōu)條件。將所有陽性沙門氏菌的濃度都設(shè)定為107CFU/ml，并在所有實(shí)驗(yàn)體中添加同體積的磷酸緩沖溶液，反復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。此外，利用封閉探針測定BSA濃度，記錄探針?biāo)捎玫目贵w量，以便能夠?qū)ζ溥M(jìn)行優(yōu)化。在進(jìn)行檢測過程中，將BSA濃度設(shè)置為1%、4%、6%三個(gè)濃度，利用修飾探針檢測應(yīng)用的抗體量。

2.4 不同濃度沙門氏菌檢測 在對(duì)0.5×104、1×105、2×106、3×107等不同濃度的沙門氏菌進(jìn)行檢測時(shí)，需要觀測不同樣品的顯色情況，再確定裸眼檢測時(shí)限，通過測定樣品的相對(duì)灰度值，使得樣品濃度能夠達(dá)到擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定不同濃度沙門氏菌的半定量范圍。

2.5 特異性考察 在最佳條件下進(jìn)行考察，其能夠檢測樣品中107CFU/ml的沙門氏菌、大腸桿菌和李斯特菌。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過程中，將不同體積的緩沖溶液與空白樣品對(duì)照，并重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，觀察每組實(shí)驗(yàn)體的顯色情況，并對(duì)實(shí)驗(yàn)體的灰度值進(jìn)行測量，比對(duì)各組實(shí)驗(yàn)體的灰度值信號(hào)。

2.6 重復(fù)性考察 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中抽取9個(gè)沙門氏菌的實(shí)驗(yàn)樣品，利用9個(gè)試紙條對(duì)不同濃度的沙門氏菌進(jìn)行測試，并與陰性樣品進(jìn)行對(duì)照。并且在進(jìn)行檢測的過程中，要設(shè)置不同的探針量，可以將探針量設(shè)置為5μL、10μL、11μL、132μL，將其置于最佳條件下，對(duì)其不同濃度的沙門氏菌進(jìn)行檢測，將試紙條放置于溫度為4℃的環(huán)境中，檢測陽性樣品和隱性陰品，通過對(duì)陽性樣品和陰性樣品之間檢測結(jié)果的對(duì)比檢驗(yàn)試紙條的有效性，并依照比對(duì)結(jié)果計(jì)算回收率，再利用得出的回收率確定試紙條的實(shí)際檢驗(yàn)結(jié)果。

3 膠體金試紙條檢測沙門氏菌綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

在利用膠體金試紙條對(duì)其進(jìn)行檢測完畢后，通過分析納米金表征、沙門氏菌靶向生物探針表征分析沙門氏菌的存在情況。并且在最優(yōu)條件下，對(duì)膠體金試紙條性能和特異性結(jié)果進(jìn)行分析。

3.1 納米金表征 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，納米金在檢測完畢后呈現(xiàn)出酒紅色，通過與紫外可見光譜的對(duì)比可以看出處于521nm處的納米金粒子正處于吸收峰[4]?；趯?duì)透射電鏡圖的分析，可以明顯看出金納米粒子呈現(xiàn)出球形形狀，且通過對(duì)其尺寸的觀察可以看出金納米粒子尺寸均勻，且并無明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。在對(duì)200個(gè)顆粒粒徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)測量后，可得出金納米粒子的平均粒徑可達(dá)到14.0nm。

3.2 沙門氏菌靶向生物探針表征 在對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測時(shí)，將其置于接近蛋白質(zhì)電點(diǎn)或是偏堿的條件下進(jìn)行測量。在進(jìn)行檢測過程中，將蛋白質(zhì)與金納米粒子進(jìn)行混合，使得二者形成牢固的結(jié)合物。首先，將其置于帶電負(fù)電荷中，通過與蛋白內(nèi)氨基酸的結(jié)合，使得其中的負(fù)電荷能夠與正電荷相互吸引，以便實(shí)現(xiàn)對(duì)于沙門氏菌的分離。其次，通過與蛋白的結(jié)合，使得蛋白中的氨基酸殘基能與金納米粒子表面發(fā)生疏水吸附，從而實(shí)現(xiàn)與金元素配位結(jié)合。通過檢測，可以看出沙門氏菌抗體中所攜帶的鐵元素中含有賴氨酸、色氨酸等，且能夠吸附至金納米粒子表面，進(jìn)而發(fā)揮生物識(shí)別功能。待修飾抗體后，納米金探針在與沙門氏菌接觸后仍舊呈現(xiàn)出酒紅色。與紫外光譜對(duì)比后可以發(fā)現(xiàn)，修飾納米金呈現(xiàn)出紅移現(xiàn)象，且在經(jīng)過透射電鏡檢測后，納米金仍舊為球形且并未出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。因此，通過該結(jié)果可以判斷出，修飾對(duì)于納米金的光學(xué)性以及形貌并不會(huì)產(chǎn)生影響，其反而能夠進(jìn)一步驗(yàn)證沙門氏菌的抗體活性。

3.3 最優(yōu)檢測條件 通過對(duì)BSA濃度、修飾抗體量以及探針用量的分析可以判斷出其對(duì)于探針的影響。根據(jù)圖譜顯示，BSA濃度在用于分析金納米粒子表面時(shí)，未發(fā)現(xiàn)與抗體結(jié)合的位點(diǎn)，并未展現(xiàn)出明顯的特異性。但是在高濃度BSA信號(hào)釋放后，隨著濃度的增大，其中的沙門氏菌含量逐漸減少，通過裸眼對(duì)檢測線顯色情況的分辨可以看出有微弱的顯色反應(yīng)，即可以判斷出存在非特異性吸附的情況。同樣，通過對(duì)表面抗體修飾量的檢測可以發(fā)現(xiàn)，隨著修飾量的增多，其中的沙門氏菌會(huì)逐漸增大，待至修飾量達(dá)到2μg后，如繼續(xù)加大抗體用量，則不會(huì)呈現(xiàn)出明顯變化，因此可以判斷出2μg抗體是探針用量與細(xì)菌結(jié)合的臨界值，在此范圍內(nèi)會(huì)使得顯色加深，但是一旦用量超出2μg的范圍，灰度值反而會(huì)出現(xiàn)下降的情況。

3.4 性能分析 在最優(yōu)的檢測條件下，其主要考察了裸眼定性檢測限值以及灰度值的半定量范圍。在進(jìn)行檢測的過程中采用該種方式能夠檢測不同濃度的沙門氏菌，待觀測到檢測線呈現(xiàn)顏色條帶后，其質(zhì)控線并未出現(xiàn)顯色情況。而隨著沙門氏菌濃度的不斷增加，在增加至1×10CFU/ml時(shí)，質(zhì)控線則會(huì)微弱地顯示出紫紅色條帶，待檢測限超出1×10CFU/ml后，隨著濃度的提升，條帶顏色會(huì)逐漸加深。同時(shí)，在Image軟件的檢測下，質(zhì)控線的相對(duì)灰度值會(huì)隨著細(xì)菌濃度的提升逐漸提高，呈現(xiàn)出線性的關(guān)系，能夠被用于半定量分析。

3.5 特異性結(jié)果 在采用幾種常見的細(xì)菌對(duì)該種方法的特異性進(jìn)行測定后，發(fā)現(xiàn)將該種方法應(yīng)用于檢測沙門氏菌，其在檢測線和質(zhì)控線上都呈現(xiàn)出了明顯的顏色條帶，而其他幾種常見菌種則并未呈現(xiàn)出明顯的顏色條帶。一些常見的菌種甚至只是在檢測線上出現(xiàn)明顯的顏色條帶，基本與空白樣品組相持平。通過對(duì)沙門氏菌的相對(duì)灰度值的檢測可以發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌的灰色值信號(hào)明顯高于其他細(xì)菌組，雖然常見細(xì)菌組的灰度值信號(hào)比空白樣品組略大，但是可以明顯看出其遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于沙門氏菌，因此采用這種方式是進(jìn)行沙門氏菌檢測的最好方式。

總而言之，在本次實(shí)驗(yàn)中，通過制備納米金的方式，利用抗原抗體的免疫反應(yīng)和層析作用對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測，簡化了沙門氏菌的檢測步驟，實(shí)現(xiàn)了對(duì)于沙門氏菌定性以及定量的判斷。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，并未使用復(fù)雜的儀器，且實(shí)驗(yàn)成本極為低廉，而且本次實(shí)驗(yàn)還囊括了化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科知識(shí)，有助于提升實(shí)驗(yàn)的綜合性，保證實(shí)驗(yàn)效果。本次實(shí)驗(yàn)主要立足于納米科技，通過對(duì)病原體的檢測，得出了精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為后續(xù)的科學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，促進(jìn)了多學(xué)科的良性循環(huán)，增添了實(shí)驗(yàn)的綜合性。