冰淇淋中益生菌存活率影響因素和保護(hù)技術(shù)研究進(jìn)展

余俊杰，韓剛，周志磊,3，唐俊*，毛健,3

1.阜陽師范大學(xué)生物與食品工程學(xué)院（阜陽 236037）；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心（無錫 214122）；3.江南大學(xué)（紹興）產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院（紹興 312000）

冰淇淋是一種具有誘人風(fēng)味和細(xì)膩口感的冷凍飲品，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年全球冰淇淋市場(chǎng)總市值為570億美元，并且將在2024年達(dá)到750億美元[1]。冰淇淋有著廣泛的消費(fèi)群體（兒童，成年人甚至是老人）、合適的營養(yǎng)成分（糖類，蛋白質(zhì)和脂肪）以及良好的理化性質(zhì)（偏堿性）。隨著消費(fèi)者對(duì)健康飲食需求的增加[2]，越來越多的功能性冰淇淋問世，如低熱量的代糖代脂冰淇淋[3-4]、益生菌冰淇淋[5]和能滿足一些有著特殊營養(yǎng)需求如糖尿病患者等特殊群體的功效成分冰淇淋[6]等。益生菌冰淇淋是指添加了有益的活性微生物的冰淇淋，這些活性微生物有著改善人體腸道微生物環(huán)境[7]、預(yù)防齲齒[8]、改善消化[9]等豐富的保健功效。

通常益生菌冰淇淋需要在其保質(zhì)期內(nèi)保證自己的活益生菌數(shù)量在～CFU/g[10]以上，但因?yàn)楸苛艿纳a(chǎn)過程、儲(chǔ)藏條件以及原材料的特性都可能會(huì)對(duì)益生菌造成傷害，所以需要充分考慮益生菌存活率的影響因素和采取一定的保護(hù)技術(shù)。

1 影響益生菌存活率的主要因素

1.1 生產(chǎn)原料的影響

作為冰淇淋的主要原料和益生菌存活的主要載體，乳品的種類對(duì)于益生菌存活率有著重要的影響。原料乳可以提供營養(yǎng)配比均勻的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物（主要是乳糖）。目前，用于制作冰淇淋的原料乳已經(jīng)不再局限于牛奶，關(guān)于以綿羊奶[11]、山羊奶[12]和駱駝奶[13]等動(dòng)物奶為原料制作的冰淇淋的嘗試都在不斷開展。并且其中山羊奶相比牛奶具有固形物含量高、加工過程中無需均質(zhì)化以及脂肪含量高等優(yōu)勢(shì)。除了動(dòng)物乳以外，一些植物乳也可以作為冰淇淋的原料，Aziz等[14]利用大豆加工的豆乳制作冰淇淋，豆乳具有pH適中，總固形物含量高并且含有益生元寡糖（大豆低聚糖）等特點(diǎn)，該試驗(yàn)結(jié)果中，大豆冰淇淋中益生菌在冷凍后180 d內(nèi)活菌數(shù)下降趨于穩(wěn)定，始終在106CFU/g之上，表明豆乳是益生菌的合適載體。

冰淇淋中通常會(huì)添加一些水果作為風(fēng)味配料，這樣不僅可以改善冰淇淋的口感，也可以增加冰淇淋的營養(yǎng)價(jià)值。一些水果冰淇淋如桃金娘果[15]，葡萄和核桃[16]都已經(jīng)被證明對(duì)食物中的益生菌的存活率有影響。這種影響的主要方式可能是果肉中的一些有機(jī)酸和糖分改變產(chǎn)品的pH和化學(xué)環(huán)境。Kavas[17]在用駱駝奶制成的冷凍酸奶中添加了草莓和番石榴，增加了冰淇淋中嗜酸性乳桿菌的存活率（Lacticaseibacillus casei431）。El-Shenawy等[18]在冰淇淋中添加了老虎果提取物，結(jié)果表明，用50%老虎果提取物替代水生產(chǎn)冰淇淋效果最好，在提高了益生菌菌株的存活率的同時(shí)，還改善了冰淇淋的理化性質(zhì)。風(fēng)味配料對(duì)于冰淇淋理化性質(zhì)和生物學(xué)環(huán)境的影響是多種多樣不可忽視的，所以具體的風(fēng)味配料對(duì)冰淇淋中益生菌存活率的影響可能還是需要單獨(dú)考察。

甜味劑也是冰淇淋的重要配料，其類型和濃度也可能對(duì)益生菌存活有影響。Pay等[19]觀察到，添加了未精制椰子棕櫚糖的冰淇淋相比使用精制蔗糖的產(chǎn)品呈現(xiàn)出更高的益生菌存活率。此外，試驗(yàn)結(jié)果還表明添加18%糖的產(chǎn)品比添加15%或21%糖的產(chǎn)品具有更高的益生菌活力。這可能是由于高糖分會(huì)造成比較強(qiáng)的滲透壓，從而不利于益生菌的生存，而糖分過少則會(huì)無法滿足益生菌的碳源需要。用多元醇如赤蘚糖醇、木糖醇、異麥芽酮糖醇和麥芽糖醇作為甜味劑的冰淇淋中冷凍和儲(chǔ)藏過程后益生菌數(shù)量都保持在較高的水平[20]，但是赤蘚糖醇的添加會(huì)導(dǎo)致冰淇淋的硬度變小，從而使口感變差。

此外，配料中如果添加了膳食纖維或者其他益生元，同樣可以顯著地提升冰淇淋中的益生菌的存活率。Hanafi等[21]對(duì)植物乳桿菌（L.plantarum）進(jìn)行了不同膳食纖維添加量的對(duì)比試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，膳食纖維添加量最高的一組中益生菌的存活率也越高，這可能是因?yàn)樯攀忱w維可以在益生菌生長過程中起到益生元的作用，并且膳食纖維本身具有一定的物理保護(hù)作用，能夠保護(hù)益生菌免受冷凍損傷和機(jī)械應(yīng)力的剪切以及在冷凍混合過程中的凍傷。

1.2 生產(chǎn)工藝的影響

冰淇淋中大部分益生菌都是微氧或者厭氧的，因此，氧氣的含量對(duì)于益生菌的存活率有著重要的影響[22]。此外，在冷凍過程中氧氣會(huì)對(duì)膜脂和細(xì)胞蛋白質(zhì)造成損害[23]。此外，如果溶解氧進(jìn)入了厭氧的益生菌細(xì)胞內(nèi)，就會(huì)導(dǎo)致毒性含氧代謝物（如超氧陰離子）在細(xì)胞內(nèi)積累，從而降低益生菌的生存能力[24]。

由于冷凍過程中冰晶的形成，細(xì)胞在冷凍過程中所受到的傷害通常比低溫儲(chǔ)存時(shí)受到的傷害更大[25]。冷凍過程中不僅形成的冰晶會(huì)對(duì)細(xì)胞膜造成機(jī)械傷害，短時(shí)間的溫度下降也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)變性和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)損傷。由于冰晶的形成，液體形態(tài)的游離水會(huì)減少，從而升高細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)濃度，甚至可能會(huì)發(fā)生質(zhì)壁分離，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜的破裂[23]。不同的降溫速度對(duì)于冰晶形成的大小具有一定程度上的影響，快速冷凍會(huì)產(chǎn)生數(shù)量多的小冰晶；而慢速冷凍則會(huì)產(chǎn)生大冰晶[26]。但是這并不能保證快速冷凍一定可以提升益生菌的活性，Baati等[27]的試驗(yàn)表明，在一些情況下預(yù)冷凍和慢速冷凍可以提升細(xì)胞對(duì)低溫的抗性。相比直接快速降溫的對(duì)照組，經(jīng)過低溫孵育6 h的試驗(yàn)組的存活率和活性更高。嘗試分階段降溫的方法可能也是規(guī)避冷凍時(shí)益生菌損失的一種方法。

冰晶形成對(duì)于不同的益生菌所造成的傷害也不同，Sheu[28]對(duì)保加利亞乳桿菌的兩個(gè)代表菌株（L2和rr）進(jìn)行了冷凍試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同樣的條件下，細(xì)胞體積比較小的L2的存活率（45%）遠(yuǎn)高于細(xì)胞體積比較大的rr的存活率（5%），所以選用細(xì)胞體積更小的益生菌可以減少它們?cè)诶鋬鲞^程中受到的機(jī)械損傷。

1.3 儲(chǔ)藏溫度的影響

冰淇淋通常都需要長期的低溫儲(chǔ)藏，儲(chǔ)藏過程中的低溫會(huì)抑制益生菌的生長和繁殖，并且在大部分情況下冰淇淋的儲(chǔ)藏溫度都會(huì)有一定幅度上的變化。Ullah等[29]通過對(duì)馬鈴薯細(xì)胞進(jìn)行4個(gè)不同冷凍儲(chǔ)藏處理（恒溫-80 ℃；在-17～-16，-17～-11和-17～-7 ℃之間波動(dòng)）觀察溫度變化對(duì)冰晶粒度分布的影響。結(jié)果表明，細(xì)胞和細(xì)胞間隙中的晶體生長也受到儲(chǔ)存期間溫度變化的影響，隨著溫度波動(dòng)幅度的增加，冰晶的生長也會(huì)越大，從而對(duì)細(xì)胞的損傷也越大。Park等[30]發(fā)現(xiàn)不同的儲(chǔ)藏溫度對(duì)冰晶的生長也有一定的影響，在長達(dá)52周的貯藏期間，4種儲(chǔ)藏溫度（-18，-30，-50和-70 ℃）下的冰淇淋冰晶尺寸有不同的變化。其中-18 ℃下的冰淇淋冰晶尺寸增長的幅度最大，從40.3 μm增長到了100.1 μm，而-50 ℃和-70 ℃下的冰淇淋冰晶則是從40.3 μm增長到了57～58 μm。并且不僅是只有在-50 ℃或者-70 ℃的溫度下，即便是在-10 ℃和-20 ℃的差別下，細(xì)菌的存活率也有著顯著的差別[26]。

1.4 其他影響

益生菌的種類也可能會(huì)影響到最終的存活率。與雙歧桿菌相比，乳桿菌對(duì)有害條件有著更高的抗性[31-32]。Ferraz等[33]研究了不同冰淇淋的膨脹率對(duì)益生菌存活的影響，結(jié)果表明低膨脹率的冰淇淋中嗜酸乳桿菌的活性相對(duì)較高。益生菌的冷凍應(yīng)激機(jī)制雖然未被探明，但是Streit等[34]在提高保加利亞乳桿菌的耐冷凍能力的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過30 min酸化預(yù)處理的乳桿菌有著更好的抗冷凍性能，說明一些乳桿菌的酸應(yīng)激和冷應(yīng)激機(jī)制可能存在一定程度上的關(guān)聯(lián)。

2 益生菌保護(hù)技術(shù)

2.1 微膠囊化

微膠囊技術(shù)是利用特殊材料通過乳劑、噴霧干燥、電噴霧和反乳化等微膠囊化手段[35-36]，將目標(biāo)物包裹在很小的微型膠囊壁內(nèi)的一種包裝技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用在保護(hù)冰淇淋中的益生菌時(shí)也同樣表現(xiàn)出良好的效果。Afzaal等[37]用海藻酸鈉和卡拉膠作為材料對(duì)益生菌細(xì)胞進(jìn)行包封，顯著地提高了益生菌的存活率和活力。而Zanjani等[38]對(duì)比了采用海藻酸鈣、小麥、大米、玉米淀粉、殼聚糖和聚賴氨酸不同材料作為微膠囊涂層對(duì)益生菌存活率的影響。結(jié)果表明，低聚糖和聚賴氨酸作為涂層的微膠囊方案優(yōu)于采用淀粉作為涂層的方案，而淀粉中，玉米淀粉的效果又優(yōu)于小麥和大米淀粉。除此之外，乳清濃縮蛋白、海藻酸鈣[39]和魔芋葡甘聚糖水解物[40]也可以用作冰淇淋微膠囊的壁材?？偟膩碚f，與游離細(xì)胞相比，微膠囊化促進(jìn)了益生菌在加工和儲(chǔ)存過程以及模擬腸道中的存活率的提高，主要是保護(hù)益生菌免受水結(jié)晶所造成的傷害，并且增加了厭氧的益生菌對(duì)氧氣的抵抗[35]，從而起到了保護(hù)益生菌的效果。

2.2 冷凍保護(hù)劑

向細(xì)菌懸液中添加冷凍保護(hù)劑是最常見的保護(hù)手段之一。一般情況下冷凍保護(hù)劑都是水溶性的，可以降低冰的熔點(diǎn)。當(dāng)冰晶開始形成時(shí)，益生菌會(huì)被固體冰晶擠到還沒有結(jié)冰的水溶液中，所以如果添加冷凍保護(hù)劑，那么相當(dāng)于擴(kuò)大了未結(jié)冰的部分區(qū)域，也就給了益生菌更多的生存空間，從而降低益生菌機(jī)械壓力和滲透應(yīng)力的損傷[41]。一些糖類被證明有冷凍保護(hù)劑的功能，Chen等[42]研究了冷凍干燥對(duì)開菲爾酸奶中微生物存活的影響，并測(cè)定了凍干前添加到開菲爾中的凍干保護(hù)劑（半乳糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和海藻糖）對(duì)益生菌存活率的影響。結(jié)果表明，添加10%半乳糖或蔗糖作為冷凍保護(hù)劑顯著提高了乳酸菌和酵母菌的存活率。賴田甜等[43]向含有益生性植物桿菌YW 11的冰淇淋中添加了低聚果糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這不僅能提高益生菌的整體活性，也可以改善冰淇淋的理化性質(zhì)。

除了水溶性的保護(hù)劑之外，飽和單甘酯結(jié)構(gòu)乳液也可以作為冷凍保護(hù)劑。在這種復(fù)雜結(jié)構(gòu)中的細(xì)菌可能將其自身普遍地置于單酸甘油酯晶體結(jié)構(gòu)附近的水性區(qū)域中，在那里它們可以找到一些疏水的營養(yǎng)物質(zhì)并且承受更小的環(huán)境壓力，從而起到保護(hù)益生菌的效果[44]。

2.3 其他保護(hù)技術(shù)

除了微膠囊化益生菌和向冰淇淋中添加冷凍保護(hù)劑之外，還有一些其他技術(shù)也可以提升益生菌的存活率。比如Terpou等[45]采用微生物固定化技術(shù)，將益生菌干酪乳桿菌ATCC393固定化在沙棘果中并添加到冷凍酸奶里面，經(jīng)過90 d/-18 ℃的低溫儲(chǔ)藏之后，益生菌存活率仍然處于較高水平，而對(duì)照組游離益生菌細(xì)胞的存活率則下降了10%。但并非所有的益生菌固定化都可以提升益生菌存活率。Pornpan[46]以香蕉粉為載體固定化益生菌，采用益生菌Lactobacillus caseiTISTR 1463和Lactobacillus acidophilusTISTR 1338所制作的冰淇淋經(jīng)過低溫儲(chǔ)存后的益生菌存活率和對(duì)照的游離益生菌組并沒有顯著差異。所以應(yīng)當(dāng)充分考慮菌種和固定化載體對(duì)固定化保護(hù)效果的影響。益生菌在低溫環(huán)境下的抗冷凍脅迫機(jī)制還未被探明，因此添加一些能夠刺激細(xì)胞活性的輔酶也有可能提高細(xì)胞的活性。比如有向冰淇淋中添加抗壞血酸的研究，結(jié)果表明抗壞血酸可以刺激冰淇淋中嗜酸乳桿菌等益生菌的生長，這可能意味著一些維生素也具有一定的益生菌保護(hù)作用[47]。

3 結(jié)語與展望

益生菌的存活很大程度上取決于它的食品基質(zhì)，所以在益生菌冰淇淋的生產(chǎn)時(shí)應(yīng)充分考慮乳品種類和配料對(duì)益生菌存活率的影響，針對(duì)特定的益生菌菌種進(jìn)行冰淇淋配方的優(yōu)化是有必要的。大部分益生菌都是厭氧菌，所以在冷凍攪拌時(shí)應(yīng)當(dāng)控制氧氣含量，防止益生菌氧中毒。在冷凍成型階段，溫度變化速度會(huì)刺激益生菌的低溫脅迫機(jī)制和導(dǎo)致冰晶形成對(duì)益生菌造成的物理損傷，所以不能夠盲目的加快降溫速度，具體工藝參數(shù)還需試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。此外，在儲(chǔ)存過程中應(yīng)當(dāng)盡量避免溫度的大幅度波動(dòng)。

一些益生菌保護(hù)技術(shù)如微膠囊化和添加冷凍保護(hù)劑等方法都已經(jīng)被證明在益生菌冰淇淋生產(chǎn)中可以有效的提高益生菌的存活率，但是具體的微膠囊化方法和冷凍保護(hù)劑的類型對(duì)于不同冰淇淋中益生菌的存活率的影響還沒有得到有針對(duì)的研究。

冰淇淋市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)日趨激烈，低熱量、功能化和口感好的新型益生菌冰淇淋將會(huì)成為市場(chǎng)追逐的熱點(diǎn)。但關(guān)于冰淇淋中益生菌的損傷機(jī)制的探究目前還停留在起步階段，具體生產(chǎn)過程中加工工藝的各個(gè)環(huán)節(jié)與益生菌損傷之間的聯(lián)系還有待進(jìn)一步的明確。