歐李果漿對失眠小鼠的改善作用及機制

傅 嬈，梁 哲，溫 馨，倪元穎

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果蔬加工重點實驗室，北京 100083）

在現(xiàn)代社會，入睡困難、焦慮不安、慢性失眠等一系列睡眠問題的發(fā)生率逐漸升高。失眠癥的治療方法包括心理治療、藥物治療、物理治療和綜合治療等，其中藥物治療主要包含γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric，GABA）復(fù)合體激動藥、鎮(zhèn)靜類抗抑郁藥、選擇性褪黑素受體激動藥、抗組胺藥等[1-2]。GABA是存在于蔬菜、水果以及發(fā)酵食品中的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，也是一種常見的促進睡眠的活性物質(zhì)。在哺乳動物中，谷氨酸在谷氨酸脫羧酶的作用下產(chǎn)生GABA，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮抑制神經(jīng)遞質(zhì)的作用[3]。Yamatsu等[4]利用一項隨機、單盲、安慰劑對照的交叉設(shè)計研究評估了GABA對睡眠的影響，發(fā)現(xiàn)GABA顯著縮短了睡眠潛伏期，并延長了非快速眼動睡眠時間。Abdou等[5]以水或L-茶氨酸為對照進行腦電圖測試，13 名受試者服用GABA 1 h后，α波增加，β波減少，表明GABA有利于大腦的鎮(zhèn)靜。Okada等[6]在對20 名更年期女性的研究中發(fā)現(xiàn)，每日服用含有26.4 mg GABA的脫脂大米胚芽后，超過65%的受試者睡眠質(zhì)量得到改善，且更年期的抑郁情緒得到緩解。由于GABA功能性活性較強，利用富含GABA的膳食補充劑（如紅茶[7]、羅布麻葉[8]、酸棗仁[9]、發(fā)酵乳制品[10]、發(fā)芽糙米[11]等）輔助改善睡眠的研究近年來多有報道。

歐李（Cerasus humilis(Bge.) Sok）為我國特有的具有耐貧瘠、抗旱、抗寒、適應(yīng)性強等特性的植物[12]，主要種植于山西、內(nèi)蒙古、遼寧、河南、河北等干旱寒冷省份[13]。歐李果實富含糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，總糖相對含量為5.33%，有機酸相對含量為1.29%，與桃、杏、李等核果類相比，其總糖含量較低、有機酸含量較高[14-15]。Liu Suwen等[16]對7 種歐李進行評價，結(jié)果顯示歐李果實含有豐富的酚類物質(zhì)，其含量達339.07～770.30 mg/100 g（以鮮質(zhì)量計）。王亞君[17]采用超聲乙醇輔助提取歐李果實總黃酮，總黃酮提取量可達51.39 mg/g（以干質(zhì)量計）。目前，研究者對可鮮食歐李的研究多集中于營養(yǎng)成分的分析與測定，對于其功能性的相關(guān)研究鮮有報道。本研究選用北京地區(qū)3 種常見的可鮮食歐李品種，聚焦于歐李果實中具有助睡眠功效的GABA等成分。同時，選取經(jīng)過體外模擬消化后GABA含量較高的歐李品種進行急性毒理學(xué)實驗，評價其果漿的安全性，參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2023年版）》中的方法探究歐李果漿的助眠效果，并初步探究歐李果漿的助眠機理，為歐李果實深加工及功能食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

‘農(nóng)大7號’歐李與‘燕山2號’歐李均采摘自北京市平谷區(qū)東高村鎮(zhèn)南宅莊戶村；‘農(nóng)大4號’歐李購自河北省張家口市崇禮區(qū)石窯子鄉(xiāng)堡東溝村。3 種歐李均為2019年8月下旬的成熟期果實，去除爛果、果柄、枝葉、果核后，將果肉研磨成漿，－20 ℃冷凍備用。

230 只6 周齡ICR雄性小鼠（SPF級）購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010，倫理審查編號：20200007YFA-3R。5 只一籠，分籠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（23±3）℃、相對濕度（55±15）%。

淀粉酶、唾液淀粉酶、豬胃蛋白酶、胰酶、豬膽鹽西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有有限公司；戊巴比妥鈉、地西泮 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、GABA、白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocor ticotropic hormone，ACTH）、皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 武漢純度生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DR-200BS酶標(biāo)分析儀 無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司；A6半自動生化儀 北京松上技術(shù)有限公司；Neofuge 13R低溫冷凍離心機 香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；Wonbio-96c多樣品冷凍研磨儀 上海萬柏生物科技有限公司；8890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 歐李果漿中理化指標(biāo)和活性成分的測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》中的方法測定水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》中的方法測定灰分含量。參照NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定 折射儀法》中的方法測定可溶性固形物含量。參照SN/T 4592—2016《出口食品中總黃酮的測定》中的方法測定黃酮含量。參照DB12/T 885—2019《植物提取物中原花青素的測定紫外/可見分光光度法》中的方法測定花青素含量。參照T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中總多酚含量的測定 分光光度法》中的方法測定多酚含量。

參考NY/T 2890—2016《稻米中γ-氨基丁酸的測定 高效液相色譜法》中的方法并進行部分修改，測定樣品中的GABA含量。歐李果肉經(jīng)研磨后，過60 目篩備用。稱取1.0 g樣品加入10 mL提取液（V（無水乙醇）∶V（水）＝4∶1），超聲提取10 min，5 000 r/min離心5 min，重復(fù)一次提取后合并上清液，使用提取液定容至25 mL。準(zhǔn)確稱取衍生化試劑4-二甲基氨基偶氮苯-4-磺酰氯20.0 mg，使用乙腈溶解并定容至10 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。將1 mL試樣溶液或GABA標(biāo)準(zhǔn)工作液加入0.20 mL碳酸氫鈉溶液后再加入0.40 mL衍生化試劑。置于70 ℃水浴鍋內(nèi)衍生化20 min，取出后混勻過0.45 μm水相濾膜后待測。高效液相色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；檢測波長為436 nm；柱溫為30 ℃；進樣量10 μL；流動相A為無水乙腈，流動相B為三水合乙酸鈉溶液，等度洗脫（流動相A、B體積比為35∶65），流速為1.0 mL/min。采用外標(biāo)法測定GABA含量。

1.3.2 歐李果漿的體外模擬消化

參考Minekus等[18]的方法，配制模擬唾液（simulated salivary fluid，SSF）、模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）以及模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）。稱取5 g歐李果漿加入3 mL SSF、1 mLα-唾液淀粉酶以及25 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液，37 ℃反應(yīng)2 min。調(diào)節(jié)樣品至pH 3.0，加入6 mL SGF，準(zhǔn)確添加2 mL豬胃蛋白酶溶液及0.3 mol/L CaCl2溶液5 μL，氮吹處理10 s后封蓋，37 ℃反應(yīng)2 h。調(diào)節(jié)樣品至pH 6.0，準(zhǔn)確添加5 mL 80 mmol/L牛膽鹽溶液、10 mL胰酶以及40 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液，再次調(diào)節(jié)樣品至pH 7.0，氮吹處理10 s后封蓋，37 ℃反應(yīng)2 h，使用液氮進行冷凍滅酶處理。上述各階段樣品均加去離子水定容至50 mL，5 000 r/min離心3 min，收集上清液，采用超聲功率350 W提取10 min，70 ℃條件下減壓濃縮回收至20 mL，使用去離子水定容至25 mL得到樣品溶液。采用1.3.1節(jié)的方法進行GABA含量的測定。

1.3.3 歐李果漿急性經(jīng)口毒性分析

將小鼠分為雌雄兩組，參照GB 15193.3—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗》中的方法，采用限量法進行歐李果漿的急性經(jīng)口毒性試驗。記錄實驗期間小鼠體質(zhì)量及死亡數(shù)量。

1.3.4 歐李果漿助睡眠功能分析

1.3.4.1 動物飼養(yǎng)及分組

飼養(yǎng)環(huán)境：不限制飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，將小鼠參照體質(zhì)量隨機分為5 組，每組40 只，所用飼料均為普通飼料，小鼠分組及灌胃處理情況見表1。參考文獻[19-20]，根據(jù)GABA等成分含量設(shè)置陽性對照組和歐李果漿低、中、高劑量組。

表1 實驗設(shè)計及動物分組Table 1 Experimental design and animal grouping

灌胃受試物配制：1）歐李果漿：分別稱取2、4、8 g歐李果漿，用生理鹽水稀釋定容至100 mL，每次灌胃前充分混勻。2）地西泮：取30 mg地西泮藥片研磨成粉末，用生理鹽水溶解定容至100 mL，儲存于4 ℃。小鼠經(jīng)口灌胃10 mL/（kgmb·d）的生理鹽水、地西泮溶液或不同質(zhì)量濃度的歐李果漿，連續(xù)灌胃30 d。

1.3.4.2 高架十字迷宮實驗

參照陳文等[21]的方法，高架十字迷宮硬件由開放臂與封閉臂組成，2 條開放臂（長×寬＝30 cm×5 cm）相對組裝、2 條封閉臂（長×寬×高＝30 cm×5 cm×15 cm）相對組裝。開放臂與封閉臂交叉垂直安裝在中央平臺（5 cm×5 cm）上。攝像機安置于中央平臺垂直上方，記錄小鼠在裝置中的運動情況，整個裝置放置在距地50 cm的高度。實驗在安靜、無干擾的環(huán)境下進行，使用攝像機記錄5 min內(nèi)小鼠進入開放臂或封閉臂的次數(shù)和停留時間。

1.3.4.3 直接睡眠實驗和戊巴比妥鈉睡眠時間延長實驗

參照文獻[22]的方法以及《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2023版）》中改善睡眠功能評價規(guī)范部分進行改善睡眠功能實驗。各組小鼠連續(xù)30 d每天上午灌胃1 次，灌胃體積10 mL/（kgmb·d）。灌胃至第29天時稱質(zhì)量并觀察各組小鼠是否出現(xiàn)直接睡眠現(xiàn)象。第30天，小鼠末次灌胃30 min后，給每只小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠，注射量為10 mL/（kgmb·d）。翻正反射消失記為睡眠開始，小鼠恢復(fù)翻正反射記為睡眠截止，記錄小鼠睡眠時間，觀察各組小鼠戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時間是否延長。

1.3.4.4 戊巴比妥鈉閾下劑量實驗

小鼠第30天末次灌胃給藥30 min后腹腔注射10 mL/（kgmb·d）的戊巴比妥鈉（預(yù)實驗的最佳劑量）。小鼠翻正反射消失超過1 min認(rèn)為入睡成功，記錄在30 min內(nèi)入睡小鼠數(shù)量，按下式計算睡眠率。

1.3.4.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

小鼠第30天末次灌胃給藥30 min后腹腔注射10 mL/（kgmb·d）的巴比妥鈉。腹腔注射巴比妥鈉后至翻正反射消失的時間即為小鼠睡眠潛伏期。觀察并記錄各組小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期時長。

1.3.4.6 小鼠血清及大腦中相關(guān)生化指標(biāo)的測定

小鼠飼養(yǎng)至第29天，灌胃結(jié)束4 h后采集戊巴比妥鈉閾下劑量實驗組小鼠血清。其血清中GABA濃度采用比色法測定。分別在對照管、標(biāo)準(zhǔn)管與樣本管中加入受試物小鼠血清與試劑，100 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 min，室溫下放置5 min，在645 nm波長處進行吸光度測定。血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、ACTH、CORT質(zhì)量濃度使用ELISA試劑盒進行測定。

小鼠延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗結(jié)束后，繼續(xù)分組灌胃飼養(yǎng)14 d，采集小鼠大腦。其大腦中GABA、5-HT含量采用雙抗體一步夾心法ELISA檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 8.6軟件作圖。采用單因素方差分析進行組間差異性檢驗，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種歐李果漿中理化成分及輔助助眠功能物質(zhì)含量分析

不同品種歐李的加工適宜性有所差別，為選擇適合加工果漿的品種，本研究對3 個品種歐李的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、灰分以及可溶性固形物含量進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，‘農(nóng)大4號’‘農(nóng)大7號’和‘燕山2號’歐李果實的水分含量分別為85.6、88.2、90.2 g/100 g，灰分含量分別為0.69、0.38、0.27 g/100 g，可溶性固形物含量分別為12.8、9.8、4.8 g/100 g?！r(nóng)大4號’歐李是水分含量最低、灰分及可溶性固形物含量最高的品種，最適合作為原料加工成歐李果漿。

‘農(nóng)大4號’‘農(nóng)大7號’和‘燕山2號’歐李果漿中總黃酮的含量分別為4 467.6、2 213.3 mg/kg和2 540.7 mg/kg，其中‘農(nóng)大4號’歐李果漿中總黃酮含量最高。3 種歐李果漿中總酚含量差異較大，其中‘農(nóng)大4號’歐李果漿中多酚含量高達4 584.87 mg/kg，‘農(nóng)大7號’和‘燕山2號’分別為2 578.9 mg/kg和2 654.4 mg/kg。黃酮可以通過調(diào)節(jié)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)如5-HT、GABA、前列腺素等發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用，并有助于改善睡眠質(zhì)量[23]。膳食中攝入的多酚能夠通過調(diào)節(jié)成人海馬體神經(jīng)形成的方式在一定程度上改善焦慮水平[24]。焦慮水平的改善有助于睡眠質(zhì)量的改善，因此黃酮和多酚成分可能是歐李果漿中能夠輔助睡眠的潛在物質(zhì)。

2.2 不同品種歐李果漿消化前后GABA的含量

通過對3 種新鮮歐李果實中GABA含量的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，‘農(nóng)大4號’歐李果實中GABA的含量最高，達到118.34 mg/kg，高于‘農(nóng)大7號’（80.26 mg/kg）和‘燕山2號’（92.72 mg/kg）。蔡愈杭等[25]采用鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜法對河北地區(qū)歐李果實中GABA的含量進行測定，發(fā)現(xiàn)其平均含量為140 mg/kg（以鮮質(zhì)量計）。董姊怡等[26]測定‘京歐2號’歐李果實不同部位的GABA含量，發(fā)現(xiàn)其果肉中的GABA含量為406.7 mg/kg（以干質(zhì)量計），不同歐李果實中GABA含量的差異可能與品種及樣品干燥工藝有關(guān)。

GABA作為一種非蛋白質(zhì)氨基酸會強烈影響睡眠的早期階段，這可能與其在血液中的水平相關(guān)，因此GABA含量高的食物進入消化道后能否被吸收利用需要進行進一步的評估。3 種歐李果漿在體外模擬消化前以及體外模擬口腔、胃、腸道消化結(jié)束后上清液中GABA的含量如表2所示。

表2 3 種歐李果漿體外模擬消化液上清液中GABA的含量Table 2 GABA contents of in vitro digestion supernatants of Chinese dwarf cherry pulp from three cultivars mg/kg

由表2可知，隨著模擬消化的進行，樣品中的GABA含量逐漸增加。其中口相和胃相模擬消化階段結(jié)束后，與消化前相比，上清液中GABA的含量無明顯變化，說明在口腔和胃部的消化過程中GABA依然存在于歐李果肉組織內(nèi)，未釋放至果漿上清液中，GABA溶出的程度較低。而進入腸道進行消化后，歐李果肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)進一步被破壞，GABA大量溶出，上清液中的GABA含量顯著增加?！r(nóng)大4號’歐李果漿在各個模擬消化階段的GABA含量均顯著高于其他兩個品種（P＜0.05）。結(jié)合2.1節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)含量測定的結(jié)果，‘農(nóng)大4號’果肉總黃酮、多酚2 個與輔助睡眠功能相關(guān)的營養(yǎng)素含量均高于另外兩個品種，因此后續(xù)實驗選取‘農(nóng)大4號’歐李作為研究對象。

2.3 歐李果漿的小鼠急性毒性實驗

經(jīng)肉眼觀察，雌雄兩組受試小鼠灌胃給藥后4 h內(nèi)狀態(tài)無明顯異常，14 d內(nèi)活動情況無異常，實驗第14天時小鼠均存活，肉眼觀察經(jīng)過解剖后的小鼠各臟器及腸道均無異常。實驗期間小鼠體質(zhì)量變化如表3所示。根據(jù)GB 15193.3—2014中的判定要求，證明歐李果漿無急性毒性。

表3 急性毒理實驗期間小鼠體質(zhì)量變化Table 3 Changes in mice body mass during acute toxicological experiments

2.4 歐李果漿對小鼠焦慮情況的緩解作用

高架十字迷宮實驗以實驗動物對于開放、高懸、無保護環(huán)境的恐懼以及嚙齒類動物對黑暗環(huán)境的趨向性，形成“探究-規(guī)避”的行為沖突，這一行為實驗可以模擬人類的焦慮狀態(tài)[26]。心理焦慮水平高的小鼠會傾向于進入封閉臂以尋求保護，因此，比較各組小鼠在高架十字迷宮內(nèi)前往開放臂與封閉臂的次數(shù)及停留時間，能夠檢測經(jīng)口灌胃歐李果漿是否會影響小鼠的焦慮水平。陽性對照組選用的3 mg/kgmb地西泮溶液是一種臨床常見的鎮(zhèn)靜催眠類藥物。如圖1所示，與空白對照組相比，歐李果漿低劑量組和中劑量組小鼠進入開放臂的次數(shù)以及在開放臂中停留的時間均無顯著差異，表明其焦慮狀況沒有得到緩解；而歐李果漿高劑量組與陽性對照組小鼠進入開放臂次數(shù)顯著增多，在開放臂中停留的時間顯著延長（P＜0.05，P＜0.01），表現(xiàn)出對陌生環(huán)境的探索欲望，表明小鼠的焦慮水平較低。趙志恒[27]對小鼠灌胃從甘草、大棗、枸杞、桑葉、黃芪、金銀花中提取的黃酮、多酚和豆甾醇混合物，進而觀察其空間自主活動行為，發(fā)現(xiàn)8.84 g/（kgmb·d）的劑量具有較好的抗抑郁、抗焦慮效果，本研究結(jié)果與之類似。Liu Huan等[28]研究了GABA對鄰苯二甲酸二酯誘導(dǎo)大鼠焦慮行為的影響，發(fā)現(xiàn)GABA降低了大鼠前額葉皮層一氧化氮水平和一氧化氮合酶活力，露天測試和迷宮測試結(jié)果表明其緩解了大鼠的焦慮行為。

2.5 歐李果漿對小鼠睡眠功能的改善作用

2.5.1 直接睡眠實驗結(jié)果

表4表明，灌胃無菌生理鹽水、不同劑量歐李果漿及地西泮后，在1 h內(nèi)各組小鼠均未失去翻正反射，且能夠正?；顒?，證明生理鹽水、歐李果漿以及地西泮對小鼠均無直接催眠作用。

表4 不同劑量歐李果漿對小鼠直接睡眠的影響Table 4 Effects of varied doses of Chinese dwarf cherry pulp on immediate sleep of mice

2.5.2 戊巴比妥鈉睡眠時間延長實驗結(jié)果

通過預(yù)實驗，確定使全部小鼠入睡且睡眠持續(xù)時間適中的戊巴比妥鈉腹腔注射劑量為41 mg/kgmb。如圖2所示，與空白對照組相比，歐李果漿低劑量組和中劑量組未能延長小鼠戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠持續(xù)時間，而歐李果漿高劑量組能夠顯著延長小鼠戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠持續(xù)時間（P＜0.05），陽性對照組小鼠戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠持續(xù)時間得到了極顯著延長（P＜0.01）。本研究結(jié)果與0.83 g/kg毛葉茶GABA提取物對小鼠睡眠時間延長的結(jié)果[29]一致，Yu Leilei等[30]在對雄性ICR小鼠灌胃33.33 mg/kgmb的GABA發(fā)酵乳的研究中也觀察到了類似的結(jié)果。

圖2 不同劑量歐李果漿對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠持續(xù)時間的影響Fig. 2 Effects of varied doses of Chinese dwarf cherry pulp on pentobarbital-induced sleep duration in mice

2.5.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗結(jié)果

戊巴比妥鈉在機體內(nèi)通過肝酶代謝途徑排出體外，因此需要進行戊巴比妥鈉閾下劑量實驗，從而排除歐李果漿通過抑制肝酶活力來延長戊巴比妥鈉睡眠時間的可能性。通過預(yù)實驗，確定戊巴比妥鈉的注射劑量為28 mg/kgmb。如表5所示，腹腔注射戊巴比妥鈉后，空白對照組與歐李果漿低劑量組小鼠在1 h內(nèi)未進入睡眠狀態(tài)，而歐李果漿中劑量組有1 只小鼠在1 h內(nèi)進入睡眠，入睡率10%；歐李果漿高劑量組有2 只小鼠在1 h內(nèi)進入睡眠，入睡率20%，與空白對照組相比入睡率有所升高，但無顯著性差異。陽性對照組小鼠則在1 h內(nèi)全部進入睡眠，與空白對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。有研究表明，3.33 g/kg的毛葉茶GABA提取物可將戊巴比妥鈉（37.75 mg/kg）閾下劑量誘導(dǎo)小鼠的睡眠率提高至25%[29]，本研究中歐李果漿高劑量組小鼠表現(xiàn)出相似的效果，這可能與GABA能系統(tǒng)介導(dǎo)促睡眠作用有關(guān)。

表5 各劑量歐李果漿對戊巴比妥鈉閾下劑量入睡率的影響Table 5 Effects of varied doses of Chinese dwarf cherry pulp on sleep rate induced by sodium pentobarbital at subthreshold dose

2.5.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗結(jié)果

為小鼠進行巴比妥鈉腹腔注射，觀察小鼠巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠潛伏期，若睡眠潛伏期縮短，小鼠入睡更快，則證明受試物能夠和巴比妥鈉發(fā)生協(xié)同作用。在預(yù)實驗中，確定巴比妥鈉的注射量為300 mg/kgmb。如圖3所示，與空白對照組相比，灌胃地西泮的陽性對照組小鼠巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠潛伏期極顯著縮短（P＜0.01），歐李果漿高劑量組小鼠睡眠潛伏期也顯著縮短（P＜0.05），但中劑量和低劑量歐李果漿對巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠潛伏期的影響不顯著。這與已有的助眠食品對睡眠潛伏期的相關(guān)報道一致，如馮艷鈺等[31]使用25 mL/kg紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料可將小鼠睡眠潛伏期縮短14.37 min。

圖3 不同劑量歐李果漿對巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響Fig. 3 Effects of varied doses of Chinese dwarf cherry pulp on the sleeping incubation period induced by barbital sodium

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2023版）》中對改善睡眠功能結(jié)果的判定中，延長戊巴比妥鈉睡眠實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗以及巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗這3 個實驗中，若有兩項實驗結(jié)果為陽性，且無明顯直接誘導(dǎo)睡眠作用，則認(rèn)為受試物具有改善睡眠功能的作用。因此，高劑量歐李果漿可被判定為具有改善睡眠功能的作用。韓嘯[32]對16.67 mg/kgmb的GABA溶液的輔助睡眠作用進行了研究，結(jié)果顯示GABA在戊巴比妥鈉睡眠延長實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗以及巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗中比空白組有效，但效果不顯著。而本研究中高劑量歐李果漿灌胃具有改善睡眠功能的作用，這可能與歐李果漿中GABA及其他助眠成分的協(xié)同作用有關(guān)。

2.5.5 小鼠血清成分分析

為探究連續(xù)30 d灌胃歐李果漿對小鼠血清指標(biāo)的影響，本實驗研究小鼠血清指標(biāo)是否與小鼠睡眠情況相關(guān)，分別對小鼠血清內(nèi)GABA濃度及CORT、TNF-α、ACTH、IL-1β、IL-6質(zhì)量濃度進行測定，結(jié)果如表6、7所示。

表6 不同劑量歐李果漿對小鼠血清中CORT和ACTH質(zhì)量濃度的影響Table 6 Effects of different doses of Chinese dwarf cherry pulp on CORT and ACTH concentrations in mice serum

表7 不同劑量歐李果漿對小鼠血清中GABA濃度及IL-1β、IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度的影響Table 7 Effects of different doses of Chinese dwarf cherry pulp on GABA, IL-1β, IL-6 and TNF-α concentrations in mice serum

CORT作為一種應(yīng)激性激素，是下丘腦-垂體-腎上腺（the hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）軸的終產(chǎn)物之一，與人體代謝作用關(guān)系密切。ACTH是由垂體前葉分泌的一種激素，能夠調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素的分泌，在神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用。Suchecki等[33]的研究表明不同方式的睡眠剝奪實驗均會導(dǎo)致大鼠血清中ACTH和CORT含量的提升。Gillin等[34]的實驗證明對健康志愿者靜脈注射ACTH會縮短睡眠時間，尤其是快速動眼睡眠時間。

如表6所示，隨著灌胃歐李果漿劑量的升高，小鼠血清內(nèi)的CORT和ACTH質(zhì)量濃度逐漸降低，且除歐李果漿低劑量組與空白對照組間ACTH質(zhì)量濃度沒有顯著性差異外，其余各組間均差異顯著（P＜0.05）。在本研究中，灌胃歐李果漿能夠降低血漿中CORT和ACTH水平，證明其具有改善睡眠功能的作用，其可能是通過抑制HPA軸過度興奮和應(yīng)激狀態(tài)，調(diào)整相關(guān)激素的分泌產(chǎn)生作用。

血清中GABA濃度與歐李果漿灌胃劑量無線性相關(guān)性，這可能是因為血清中GABA的濃度是動態(tài)變化的。有研究表明小鼠攝入GABA 30 min后GABA在血清中的濃度最高，隨后會逐漸代謝分解[35]。另一方面，GABA可以由谷氨酸脫羧酶催化L-谷氨酸脫羧產(chǎn)生，其在生物體中存在兩種合成途徑。一種是通過精氨酸和精氨代謝通路，另一種則起源于三羧酸循環(huán)中的α-酮戊二酸經(jīng)由谷氨酸脫氫酶催化得到谷氨酸，進而脫羧形成GABA[36]。Suvajit等[37]對靜脈血中GABA的循環(huán)水平進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)當(dāng)谷氨酸被轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞后，GABA能夠被部分保留，且胰腺細(xì)胞、腎上腺細(xì)胞和部分免疫細(xì)胞都可能是血液循環(huán)中GABA的重要來源。因此，本研究中血清GABA濃度的波動可能與小鼠體內(nèi)多種合成與分解代謝相關(guān)。

歐李果漿低劑量組與空白對照組的IL-1β、IL-6質(zhì)量濃度之間無顯著性差異（P＜0.05），但隨著歐李果漿灌胃劑量的增加，IL-1β、IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度均顯著降低（P＜0.05），陽性對照組小鼠上述3 個指標(biāo)的降低效果最明顯，且與歐李高劑量組具有顯著性差異（P＜0.05）。Irwin等[38]對睡眠障礙、睡眠時間和炎癥關(guān)系進行薈萃分析發(fā)現(xiàn)，睡眠障礙與炎癥因子水平的增長有關(guān)。Haack等[39]的研究顯示長期睡眠剝奪會造成免疫細(xì)胞數(shù)量增加，從而引起IL-1β、IL-6、TNF-α等與睡眠相關(guān)的促炎細(xì)胞因子和炎癥標(biāo)記物水平升高，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。而灌胃歐李果漿能夠顯著降低小鼠血清內(nèi)的炎癥因子質(zhì)量濃度，因此，歐李果漿改善睡眠功能的作用可能與降低炎癥因子含量和體內(nèi)炎癥應(yīng)激水平有關(guān)。

2.5.6 小鼠大腦中GABA和5-HT含量

上述實驗表明灌胃高劑量歐李果漿組小鼠改善睡眠功能效果最明顯，因此，在繼續(xù)飼養(yǎng)14 d后，對空白對照組、歐李果漿高劑量組和陽性對照組的小鼠大腦內(nèi)GABA和5-HT含量進行測定，結(jié)果如表8所示。

表8 高劑量歐李果漿對小鼠大腦中GABA和5-HT含量的影響Table 8 Effects of high dose of Chinese dwarf cherry pulp on GABA and 5-HT contents in mice brain

大腦中GABA含量的降低可能與抑郁癥、帕金森病、焦慮癥等精神疾病的發(fā)生相關(guān)[40]。5-HT是一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，其可通過作用于特異的5-HT1A受體相關(guān)信號通路實現(xiàn)對小鼠行為學(xué)的改善[41]。歐李果漿高劑量組和陽性對照組小鼠大腦內(nèi)GABA和5-HT含量與空白對照組之間差異不顯著，但歐李果漿高劑量組與陽性對照組小鼠大腦內(nèi)GABA含量的改變量略有不同，這可能是因為腦組織中各部位GABA水平差別很大，其中黑質(zhì)和蒼白球中含量最高（大于9 μmol/g），下丘腦次之[42]，這可能是GABA在不同大腦區(qū)域的轉(zhuǎn)移引起的[43]。本研究中小鼠腦組織整體取樣可能會造成GABA含量的波動。GABA及其受體雖然具有調(diào)節(jié)睡眠的功能，但通常與大腦中去甲腎上腺素、褪黑素和谷氨酸等其他神經(jīng)遞質(zhì)共同發(fā)生作用，維持睡眠-覺醒功能[44]，后期可對大腦中海馬體、下丘腦等區(qū)域的神經(jīng)遞質(zhì)進行研究。

3 結(jié) 論

‘農(nóng)大4號’歐李果實中總黃酮、多酚及GABA含量均高于其他品種，體外模擬消化實驗結(jié)果表明，‘農(nóng)大4號’歐李果漿釋放于消化液上清液中的GABA含量最高。高架十字迷宮實驗結(jié)果顯示，以800 mg/kgmb劑量灌胃歐李果漿能夠顯著改善小鼠焦慮水平。歐李果漿高劑量組小鼠在戊巴比妥鈉睡眠延長實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗以及巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗中，戊巴比妥鈉睡眠延長實驗和巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗的結(jié)果為陽性，且無明顯的直接催眠作用，可判定800 mg/kgmb劑量歐李果漿灌胃具有改善小鼠睡眠功能的作用。高劑量歐李果漿對睡眠功能的改善可能是通過抑制HPA軸興奮，調(diào)節(jié)該途徑中ACTH、CORT等激素質(zhì)量濃度，同時降低血清內(nèi)免疫因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）質(zhì)量濃度，從而發(fā)揮減輕小鼠焦慮、輔助睡眠的作用。本研究結(jié)果初步探討了歐李果漿發(fā)揮助眠功能的機制，為新資源歐李產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用提供了新思路。