大葉蒟根莖提取物中化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)和藥理作用研究進(jìn)展

趙梓頤，武佳文，胡仁傳，黃云峰

1 廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530022；2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院

大葉蒟（Piper laetispicum）是胡椒科（Piperaceae）、胡椒屬（Piper）植物，又名山胡椒、野胡椒、小腸風(fēng)，主要分布在我國廣東、廣西、云南及海南?。?］。根據(jù)中國植物志所述，大葉蒟為木質(zhì)攀援藤本，植株可生長(zhǎng)至10 m，枝表面無毛；葉片呈革質(zhì)，其形狀一般為長(zhǎng)圓形，葉背面疏被長(zhǎng)柔毛；葉脈為羽狀網(wǎng)脈。大葉蒟雌雄異株，花為穗狀花序，與葉對(duì)生?！吨袊鴫阉庂Y源名錄》記載，大葉蒟性味辣、熱，主要用于跌打損傷、瘀血腫痛的治療［2］?，F(xiàn)代臨床研究［1，3］發(fā)現(xiàn)，大葉蒟根和莖中分離得到的大葉蒟素（Laetispicine）有顯著抗抑郁作用。目前對(duì)大葉蒟根據(jù)提取物中的化學(xué)成分及其藥理作用已有部分相關(guān)研究，但尚未有系統(tǒng)的歸納總結(jié)。現(xiàn)將大葉蒟的化學(xué)成分及其藥理作用最新研究進(jìn)展綜述如下。

1 大葉蒟根莖提取物的化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)

大葉蒟根莖提取物及其揮發(fā)油中均可提出化合物。大葉蒟根莖提取物中的化學(xué)成分的種類包括包括酰胺生物堿類化合物、吡咯烷生物堿類化合物、黃酮類化合物及甾醇類化合物；大葉蒟根莖揮發(fā)油中化學(xué)成分主要為烯萜類化合物。

1.1 基于回流法方法提取的大葉蒟根莖提取物化學(xué)成分及結(jié)構(gòu) 大葉蒟根莖提取物中的化學(xué)成分包括酰胺生物堿類化合物、吡咯烷生物堿類化合物及甾醇類化合物。潘勝利等［4］將大葉蒟的根和莖通過95 %乙醇回流提取兩次，所得浸膏用乙酸乙酯萃取，經(jīng)硅膠柱色譜反復(fù)分離純化，再應(yīng)用質(zhì)譜（Mass Spectrum， MS）、紫外和可見光譜（Ultraviolet and Visible spectrum， UV）、紅外圖譜（Infrared Spectroscopy， IR）和核磁共振波譜法（Nuclear Magnetic Resonance， NMR）鑒定提取的化合物結(jié)構(gòu)，首次分離鑒定得 3 個(gè)酰胺生物堿類化合物，并將其命名為大葉蒟素（Laetispicine，1 號(hào)單體化合物）、N-異丁基-9-苯基-2E，4E-壬二烯酰胺（15號(hào)化合物）和N-異丁基-7-苯基-2E，4E-七碳二烯酰胺（16 號(hào)化合物）。同年，靳濤等［5-6］將大葉蒟葉通過回流法提取兩次，所得浸膏一部分用醋酸乙酯萃取，反復(fù)硅膠柱層析后一部分用石油醚萃取，再經(jīng)Sephadex LH-20 和反相硅膠柱層析，另一部分用飽和正丁醇萃取，先經(jīng)D-101 大孔樹脂洗脫，再經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，最終分離出16個(gè)化合物，應(yīng)用MS、NMR 鑒定化合物結(jié)構(gòu)為酰胺生物堿類化合物8 個(gè)（1、4～6 和11～4 號(hào)）、黃酮類化合物4 個(gè)（25～28 號(hào)）和植物甾醇類化合物4 個(gè)（29～32 號(hào)）。黃酮類化合物主要有胡椒醇（C20H20O6）［5-6］、d-芝麻素（C20H18O6）［5-6］、牡荊苷（C21H20O10）［5-6］及牡荊素-2"-O-β-D-葡萄糖苷（C27H30O15）［5-6］，甾醇類化合物有β-谷甾醇（C29H50O）［5-6，9］、豆甾醇（C29H48O）［5-6，9］、匙葉桉油烯醇（ + ）（C15H24O）［5-6］、正三十二醇（C32H66O）［5-6，9］。其中（2E，4E）-N-異丁基-11-七碳二烯酰胺（13 號(hào)）和（2E，4E）-N-異丁基-15-七碳二烯酰胺（14號(hào)）是首次分離鑒定得到的天然化合物，短穗胡椒酰胺 A（4號(hào)）、Dihydropipercide（11 號(hào)）和（ + ）-匙葉桉油烯醇（31號(hào)）是從大葉蒟葉片中首次分離得到的。牡荊苷（27號(hào)）、牡荊素-2"-O-β-D-葡萄糖苷（28號(hào)）和正三十二醇（32號(hào)）是從胡椒屬植物中首次分離得到的。

方軍等［7］通過回流法得大葉蒟根和莖的浸膏，加入醋酸乙酯萃取，經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜分離后，依次加入不同比例的石油醚-丙酮洗脫，共分離出6 個(gè)化合物，用NMR 法鑒定化合物結(jié)構(gòu)為酰胺生物堿類4個(gè)（3、9、10 和12 號(hào)）、吡咯烷生物堿類化合物1 個(gè)（24號(hào)）和黃酮類化合物1個(gè)（25號(hào)）。其中3號(hào)、9號(hào)化合物首次分離出并命名為大葉蒟酰胺B（Laetispiamide B）、酰胺生物堿（Pipercallosidine）。董棟等［8］通過回流法制備大葉蒟莖的浸膏，石油醚萃取后經(jīng)反復(fù)柱層析分離，再經(jīng)高效制備液相色譜法純化，分離出5 個(gè)化合物，使用電子轟擊質(zhì)譜法（Electron impact mass spectrometry，EI-MS）和NMR 鑒定結(jié)構(gòu)為酰胺生物堿類化合物（1～3、11～12 號(hào)）。同時(shí)又觀察了以胡椒、華南胡椒（Piper austrosineseis）和山蒟（Piper hancei）等為代表的10 種胡椒屬植物中是否含有大葉蒟素和大葉蒟酰胺A，結(jié)果顯示10 種植物均不含有上述2 個(gè)化合物，由此將大葉蒟素定為大葉蒟特征成分。后續(xù)研究［5-6］通過高效液相色譜法測(cè)定大葉蒟不同部位中大葉蒟素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大葉蒟素在葉片中含量最高，莖枝和果實(shí)次之，但葉片和果實(shí)中少量的雜質(zhì)成分嚴(yán)重影響大葉蒟素單體化合物的分離和純化，因此建議在大葉蒟莖枝中提取大葉蒟素。大葉蒟的根中雖然含有大量的活性成分大葉蒟酰胺A，但多為須根，且數(shù)量較少，不建議從根部提取大葉蒟酰胺A［4，8］。

羅學(xué)軍［9］經(jīng)回流法得到大葉蒟根莖浸膏，經(jīng)D101 大孔吸附樹脂柱分離，再經(jīng)硅膠柱粗分離，F(xiàn)lash 快速制備色譜儀分離出14 個(gè)化合物，NMR 鑒定化合物結(jié)構(gòu)為酰胺生物堿類化合物7 個(gè)（1～2、7、12～14、18號(hào)）、吡咯烷生物堿類化合物5個(gè)（19～23號(hào)）和植物甾醇類化合物2個(gè)（29～30號(hào)），經(jīng)相關(guān)譜學(xué)對(duì)照后發(fā)現(xiàn)1-［（2E， 4E， 7E）-9-（3，4-次甲二氧基苯）九碳二烯酰］四氫吡咯（23號(hào)）和1-［（2E， 7E）-N-7-（3， 4-次甲二氧基苯）九碳二烯酰］四氫吡咯（21號(hào)）與已知化合物大葉蒟酰胺A［（2E， 4E）-N-異丁基-9-（3， 4-次甲二氧基苯）七碳二烯酰胺］和大葉蒟酰胺 B［（2E， 4E， 7E）-N-異丁基-9-（3， 4-次甲二氧基苯）九碳二烯酰胺］接近，差別在于化合物大葉蒟酰胺 A和大葉蒟酰胺 B的1H-NMR中為異丁基質(zhì)子信號(hào)，而23 和21 號(hào)化合物為四氫吡咯質(zhì)子信號(hào)，即23和21號(hào)化合物為新的酰胺類化合物。

1.2 基于水蒸氣蒸餾法方法提取的大葉蒟根莖提取物揮發(fā)油化學(xué)成分及結(jié)構(gòu) 董棟等［1］采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）對(duì)大葉蒟根和莖及同屬植物胡椒的成熟果實(shí)—黑胡椒中揮發(fā)油成分進(jìn)行了分析和對(duì)比，大葉蒟揮發(fā)油中含量較高的前5 位化合物的分子式分別為反式-石竹烯（C15H24）、δ-蓽澄茄烯（C15H24）、γ-古蕓烯（C15H24）、羅漢柏烯（C15H24）、1-甲基-1-乙烯基-2-烯丙基-4-異丙基-環(huán)己烷（C15H24）。石竹烯［13］在大葉蒟莖、黑胡椒揮發(fā)油中均有較高的含量，分別為12.54 %、29.1 %。δ-蓽澄茄烯在大葉蒟莖中含量也較高，占7.74 %，但在黑胡椒中含量極低（0.44 %）。γ-古蕓烯、羅漢柏烯和1-甲基-1-乙烯基-2-烯丙基-4-異丙基-環(huán)己烷次之，但黑胡椒揮發(fā)油中并未檢測(cè)出該成分。

2 大葉蒟的藥理作用

研究發(fā)現(xiàn)，大葉蒟根莖提取物中大葉蒟素具有抗抑郁和鎮(zhèn)痛作用，大葉蒟揮發(fā)油中反式-石竹烯具有鎮(zhèn)靜、抗炎和抗氧化作用。

2.1 抗抑郁作用 抑郁癥是一種以慢性消極情緒為特征的心理健康障礙，抑郁癥已成為人類健康和生活質(zhì)量的主要威脅?；加幸钟舭Y的人通常會(huì)表現(xiàn)出強(qiáng)烈的悲傷、無望和絕望的癥狀，無法在日?；顒?dòng)中體驗(yàn)快樂、食欲不振、精力不足和有自殺念頭［14］。大葉蒟中特有的大葉蒟素具有抗抑郁活性和抗感傷作用［4，15］，通過小鼠強(qiáng)迫游泳模型試驗(yàn)和抗抑郁藥理活性跟蹤試驗(yàn)證明，大葉蒟素具有很好的抗抑郁活性，強(qiáng)度是氟西?。‵luoxetine）的5 倍，而N-異丁基-9-苯基-2E，4E-壬二烯酰胺（15號(hào)）和N-異丁基-7-苯基-2E，4E-七碳二烯酰胺（16 號(hào)）化合物的抗抑郁活性略低于氟西?。?］。

與其他抗抑郁化學(xué)成分不同，大葉蒟素的結(jié)構(gòu)是獨(dú)特的，沒有環(huán)胺或芳香胺。此外，它含有一種在天然產(chǎn)物中很少有的未共軛烯丙基苯基序［16］。XIE等［17］合成了39 種大葉蒟素類似物并驗(yàn)證了結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系，通過強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)驗(yàn)證類似物（N-Isobutyl-11-（4-chlorophenyl） undeca-2E， 4E， 9E-trienamide）為有效、安全的抗抑郁先導(dǎo)化合物。么春艷等［18-19］通過小鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾模型試驗(yàn)證實(shí)了大葉蒟素有較好的抗抑郁活性，其抗抑郁機(jī)制與一氧化氮通路相關(guān)，而與阿片受體和5-HT系統(tǒng)無關(guān)。同位素法研究突觸小體對(duì)單胺類遞質(zhì)的再攝取試驗(yàn)表明，大葉蒟素對(duì)三種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（NE、5-HT 和DA）有很強(qiáng)的抑制作用。YAO 等［20］通過昆明小鼠強(qiáng)迫游泳模型試驗(yàn)中驗(yàn)證了小鼠有劑量依賴性下降表現(xiàn)，說明大葉蒟素具有抗抑郁作用。另外在扭體試驗(yàn)和福爾馬林試驗(yàn)結(jié)果表明，大葉蒟素可顯著減少昆明小鼠扭體次數(shù)，并在第一期福爾馬林試驗(yàn)中縮短注射足部的舔吐時(shí)間，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)納洛酮（2 mg/kg）預(yù)處理不影響大若蒟素的抗創(chuàng)痛效果，由此說明大葉蒟素具有顯著的抗抑郁和抗傷害特性。

王詠等［21］以尾靜脈注射和灌胃兩種方式給藥，發(fā)現(xiàn)大葉蒟素主要分布于大鼠的胃、肝和小腸中，屬于較容易跨血腦屏障、難吸收藥物。在低溫和高藥物濃度條件下，大葉蒟素能夠抑制在Caco-2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，加入P-gp 蛋白抑制劑后藥物吸收分泌都有所增加，由此推測(cè)有載體介導(dǎo)了大葉蒟素在Caco-2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，該載體可能與P-gp 蛋白相互作用。XIE等［17］用20 mmol/L谷氨酸處理PC12細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡，當(dāng)加入大葉蒟素則可以提高細(xì)胞的存活率，尤其是在0.5 μmol/L 時(shí)效果顯著，機(jī)制為大葉蒟素能顯著抑制損傷PC12 細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放，以進(jìn)而保護(hù)谷氨酸損傷PC12 細(xì)胞、提高細(xì)胞存活率。

大葉蒟乙酸乙酯提取物劑量大于60 mg/kg 時(shí)，在昆明小鼠中具有顯著的抗抑郁樣作用［15，22］。XIE等［23］通過Sprague-Dawley 大鼠慢性不可預(yù)測(cè)輕度應(yīng)激（CUMS）模型，發(fā)現(xiàn)各劑量組（15、30、60 mg/kg-1）提取物能下調(diào)炎癥細(xì)胞因子（IL-6）并具有抗抑郁作用。在低劑量組中，該提取物能下調(diào)凋亡細(xì)胞因子（p53）表達(dá)；在高劑量組中，提取物能與炎癥細(xì)胞因子（TNF-α）協(xié)同作用。在各劑量組處理下，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA 上調(diào)表達(dá)，凋亡細(xì)胞因子（caspase-3）mRNA表達(dá)下調(diào)，其變化趨勢(shì)與氟西汀相同，說明該提取物可能代替氟西汀藥物用來治療抑郁的。

WEI 等［11］評(píng)估了17 號(hào)化合物3-（3′， 4′-亞甲基二氧基-5-三氟甲基苯基）-2E-丙烯酸異丁基酰胺的抗抑郁作用，并研究了抑郁癥的習(xí)得性無助（Learned Helplessness）和社會(huì)失敗應(yīng)激模型（Social Defeat Stress model）小鼠模型的潛在機(jī)制。在習(xí)得性無助模型中，小鼠每天接受60 次連續(xù)的電擊試驗(yàn)，連續(xù)試驗(yàn)3 天，然后進(jìn)行2 周的給藥和無助行為評(píng)估。在社會(huì)失敗應(yīng)激模型中，小鼠每天接受1 次攻擊性CD-1小鼠的反復(fù)社交失敗試驗(yàn)，連續(xù)試驗(yàn)10天，然后進(jìn)行2周的給藥和一系列行為測(cè)序，其中包括社交互動(dòng)測(cè)試。經(jīng)證實(shí)，該化合物能顯著減少習(xí)得性無助模型誘導(dǎo)的逃逸失敗次數(shù)，同時(shí)增加了小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中的社交互動(dòng)率并縮短了不動(dòng)時(shí)間，表明3-（3′， 4′-亞甲基二氧基-5-三氟甲基苯基）-2E-丙烯酸異丁基酰胺具有顯著的抗抑郁作用。大葉蒟中除大葉蒟素外，乙酸乙酯提取物和3-（3′， 4′-亞甲基二氧基-5-三氟甲基苯基）-2E-丙烯酸異丁基酰胺均具有抗抑郁作用。

2.2 鎮(zhèn)痛作用 么春燕等［18］研究發(fā)現(xiàn)大葉蒟素在福爾馬林炎性疼痛模型中對(duì)疼痛第 Ⅰ 時(shí)相（0～10 min）的抑制率達(dá)55. 86 %（40 mg/kg，），其鎮(zhèn)痛作用與陽性對(duì)照鹽酸嗎啡的抑制率（56. 36 %，5 mg/kg）相近，但在第 Ⅱ 時(shí)相中（10～60 min）大葉蒟素任一檢測(cè)劑量都未引起小鼠舔足時(shí)間的顯著性變化。通過多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明大葉蒟粗提物屬于外周鎮(zhèn)痛藥物，單體大葉蒟素具有較強(qiáng)的中樞鎮(zhèn)痛作用，而外周鎮(zhèn)痛活性較弱，小鼠的自主行為和記憶能力沒有受到顯著影響，說明大葉蒟素具有陣痛效果，有可能代謝嗎啡、氟西汀等陣痛藥物［24-25］。

2.3 鎮(zhèn)靜作用 鎮(zhèn)靜是通過使用一些鎮(zhèn)靜藥物，如異丙酚、依托咪酯、氯胺酮和芬太尼等，來減少患者的躁動(dòng)或煩躁［26-27］。但以往臨床常用的鎮(zhèn)靜藥物常可導(dǎo)致心理和身體依賴，不安、失眠、抽搐，慢性劑量導(dǎo)致死亡等不良反應(yīng)發(fā)生情況較多［28］。唇形科羅勒（Ocimum basilicum）、菊科Baccharis uncinella 和香澤蘭（Chromolaena odorata）植物精油中的主要化合物為β-石竹烯。研究［29］發(fā)現(xiàn)，200 mg/kg 羅勒精油使小鼠張開雙臂的時(shí)間顯著增加、運(yùn)動(dòng)能力顯著下降；50 和100 mg/kg 的Baccharis uncinella 精油顯著增加了小鼠的睡眠時(shí)間，尤其是100 mg/kg 精油的鎮(zhèn)靜效果與處方藥地西泮片相當(dāng)［30］，說明以上兩種植物精油對(duì)小鼠起到鎮(zhèn)靜作用。GODFRIED 等［31］通過咖啡因預(yù)激小鼠試驗(yàn)，即注射咖啡因以誘導(dǎo)小鼠興奮，之后再注射香澤蘭精油，研究發(fā)現(xiàn)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力仍顯著下降，說明β-石竹烯氧化物是一種有效的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑。因此，推測(cè)大葉蒟精油中的β-石竹烯可能有鎮(zhèn)靜作用，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

2.4 抗炎作用 炎癥是由病原體或組織損傷引起的身體防御反應(yīng)［32-33］。亞美尼亞高地牛至（Origanum vulgare of the Armenian highlands）精油中主要成分為石竹烯和β-氧化石竹烯，MOGHROVYAN等［34］通過福爾馬林試驗(yàn)驗(yàn)證了該精油具有顯著的抗炎作用；通過甲基-噻唑基-四唑測(cè)定法分析細(xì)胞活力結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中2.0 μL/mL 精油在HeLa 和Vero 細(xì)胞中的細(xì)胞毒性約為60 %?？掳啬z樹（Copaifera langsdorffii）精油中含有豐富的β-石竹烯，GUSHIKEN 等［35］以雄性Wistar 大鼠為切口模型，通過對(duì)皮膚樣本進(jìn)行宏觀、組織學(xué)分析，表明β-石竹烯處理的傷口有宏觀的收縮。通過免疫組織化學(xué)和生化分析，發(fā)現(xiàn)β-石竹烯使IL-10 和GPx 水平升高，促炎分子水平降低（TNF-α、IFN-γ、IL-1β 和IL-6）。炎癥機(jī)制對(duì)于皮膚傷口的正確愈合至關(guān)重要，IL-1β、 IL-6 和TNF-α 促炎細(xì)胞因子參與細(xì)胞分化和增殖，協(xié)調(diào)肉芽組織的合成，血管生成，再上皮化和膠原重塑機(jī)制［36］。此外，這些細(xì)胞因子與IFN-γ相關(guān)，以增強(qiáng)傷口處白細(xì)胞的遷移和增殖，改善壞死組織的清創(chuàng)和抗原的吞噬［37］。由此可知，β-石竹烯能夠通過抗炎以促進(jìn)皮膚傷口愈合，推測(cè)大葉蒟中石竹烯同樣也具有抗炎作用。

2.5 抗氧化作用 β-石竹烯具有很強(qiáng)的清除羥基自由基和超氧陰離子的活性。沉香（Aquilaria crassna）［38］揮發(fā)油中的β-石竹烯為重萜類化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化活性。古巴香脂樹（Copaifera religiosa）中β-石竹烯（430 mg/kg）能夠恢復(fù)關(guān)節(jié)炎肝臟中活性氧含量，減少谷胱甘肽含量［39］。

綜上所述，大葉蒟根莖提取物和揮發(fā)油中化學(xué)成分主要有酰胺生物堿類化合物、吡咯烷生物堿類化合物、甾醇類化合物及萜烯類化合物。大葉蒟中大葉蒟素的藥理作用主要為抗抑郁和鎮(zhèn)痛作用，揮發(fā)油化學(xué)成分主要為石竹烯，可能有鎮(zhèn)痛、抗炎和抗氧化等作用。目前對(duì)大葉蒟的藥理作用相關(guān)研究較為淺顯和零散，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步對(duì)大葉蒟藥理作用進(jìn)行深入研究。