尿液脫落細(xì)胞塊切片的制備

杜天海，呂麗霞，楊潔亮，彭恒，陳敏

四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科，成都 610041

尿路上皮癌是臨床上常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)聯(lián)合熒光原位雜交（FISH）技術(shù)是目前臨床篩查尿路上皮癌的重要檢測(cè)方法，具有無(wú)創(chuàng)、快速和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)的尿脫落細(xì)胞學(xué)和FISH 檢測(cè)是在尿液細(xì)胞涂片直接染色后顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)分析，細(xì)胞涂片容易發(fā)生涂片厚、細(xì)胞堆積或分散、結(jié)構(gòu)不清及細(xì)胞量少等情況，增加了臨床醫(yī)師的閱片難度，同時(shí)還降低了脫落細(xì)胞學(xué)檢查的陽(yáng)性率?？焖?、多量的采集尿液細(xì)胞并加以固定，有助于病理細(xì)胞學(xué)的診斷。為此，我們將36例疑似尿路上皮癌患者的新鮮晨尿樣本制作成尿液脫落細(xì)胞塊，觀察尿液脫落細(xì)胞塊切片在蘇木素—伊紅染色（HE）、免疫組織化學(xué)（IHC）及FISH 檢測(cè)中的應(yīng)用情況，探討尿液脫落細(xì)胞塊在常規(guī)病理診斷中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 儀器及設(shè)備 熒光顯微鏡Leica DMLS、Abbott ThermoBrite 原位雜交儀。細(xì)胞塊試劑盒為昆明東環(huán)科技公司（內(nèi)含內(nèi)徑為8 mm 或4 mm 的專(zhuān)用含基質(zhì)離心管，細(xì)胞固定液和紅細(xì)胞裂解液）、抗體為中杉金橋公司GATA3（克隆號(hào)：EP368）即用型抗體、探針試劑盒為北京金菩嘉公司（ CSP3/CSP16 和GLP7/GSP17）、DAPI 復(fù)染劑（Abbott 公司），胃蛋白酶（Sigma 產(chǎn)品）、NP-40（Sigma 產(chǎn)品）、檸檬酸鈉緩沖液（Abbott 公司）。恒溫水浴鍋、離心機(jī)、橡膠水泥、環(huán)保透明劑、鹽酸及乙醇為市售產(chǎn)品。

1.2 尿液脫落細(xì)胞塊切片制備方法 收集2022 年7—8 月間四川大學(xué)華西醫(yī)院連續(xù)送檢的36 例臨床懷疑尿路上皮癌患者的新鮮晨尿樣本，每例份尿液樣本＞200 mL，離體時(shí)間＜3 h。①尿液沉渣收集：取36 份尿液樣本，分裝入50 mL 離心管后，1 500 r/min離心10 min，離心后送檢細(xì)胞學(xué)和FISH 檢測(cè)，收集剩余尿液沉渣。②紅細(xì)胞裂解：向尿液沉渣中加入約沉渣5 倍的專(zhuān)用紅細(xì)胞裂解工作液，混勻后靜置5 min，1 500 r/min 離心10 min 裂解紅細(xì)胞，吸去上清液。③細(xì)胞固定：向沉淀的尿脫落細(xì)胞中加入5倍于沉渣的專(zhuān)用固定液，用吸管將細(xì)胞吹打分散，常溫固定20 min。④加樣：用金屬浴融化專(zhuān)用含基質(zhì)的離心管，85 ℃加熱15 min，使離心管內(nèi)基質(zhì)完全融化。擰開(kāi)紅色離心管蓋，用吸管將固定后的細(xì)胞懸液加入融化后的基質(zhì)中并充分混勻（內(nèi)徑8 mm加樣量約1 000 μL 和內(nèi)徑4 mm 加樣量約400 μL），蓋上離心管蓋后趁熱立即1 500 r/min離心5 min，使細(xì)胞富集到一個(gè)平面上。⑤凝固基質(zhì)：離心富集細(xì)胞后將離心管放置4 ℃冰箱冷卻10 min，充分凝固基質(zhì)。⑥取材：擰開(kāi)紅色離心管蓋，撕掉專(zhuān)用離心管底端的密封膜，用棉簽從離心管蓋處推出凝固后的基質(zhì)，用刀片切下細(xì)胞富集端（底層細(xì)胞含有細(xì)胞團(tuán)和大細(xì)胞，一般為病變細(xì)胞），放入組織包埋盒，進(jìn)入與組織塊相同的脫水程序。⑦常規(guī)石蠟包埋后切片。

1.3 尿液脫落細(xì)胞塊切片制備效果觀察 ①HE染色： 尿液脫落細(xì)胞塊切片65 ℃烘烤10 min，依次將切片放入二甲苯和梯度酒精脫蠟至水，蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，自來(lái)水沖洗，切片入伊紅染液中染色2 min，再將切片梯度酒精脫水，二甲苯透明，晾干后中性樹(shù)膠封片。②IHC：切片脫蠟至水后在3%雙氧水浸泡10 min，純水清洗，檸檬酸緩沖液高壓鍋中煮3 min，純水清洗，PBS 洗2 次，加一抗于4 ℃過(guò)夜孵育。次日用PBS 沖洗切片數(shù)次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 沖洗切片數(shù)次，滴加DAB 顯色5 min，純水清洗蘇木精復(fù)染15 s，純水清洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片。③FISH 染色：切片65 ℃烤片過(guò)夜，環(huán)保透明劑常規(guī)脫蠟，乙醇脫水，純水高壓修復(fù)4 min，37 ℃胃蛋白酶工作液消化15 min，0.1 mol/L 鹽酸浸泡切片4 min，梯度乙醇脫水后晾干。滴加適量探針至組織區(qū)域后78 ℃變性5 min，37 ℃雜交過(guò)夜。次日梯度NP-40液清洗切片，二脒基苯基吲哚（DAPI）染色，熒光顯微鏡采圖備用。在一個(gè)視野中，細(xì)胞所占的面積超過(guò)40%視為細(xì)胞量足夠診斷，視為尿液脫落細(xì)胞塊切片制備成功。

2 結(jié)果

36 例份尿液脫落細(xì)胞塊切片HE 染色后顯微鏡下有15例份未觀察到細(xì)胞或查見(jiàn)細(xì)胞極少，另21例份制備成功，且制備成的尿液脫落細(xì)胞塊可4 μm連續(xù)切片，切片上細(xì)胞集中并單層平鋪。低倍鏡下可見(jiàn)尿液脫落細(xì)胞大小正常，結(jié)構(gòu)清楚，切面形狀規(guī)則，細(xì)胞豐富集中并單層平鋪，背景干凈，核仁清晰，細(xì)胞核和胞質(zhì)對(duì)比清晰，其形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)與組織學(xué)非常相似，易于后續(xù)診斷。

21 例份尿液脫落細(xì)胞塊切片后IHC 染色后顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞定位準(zhǔn)確，顆粒清晰，染色強(qiáng)度適宜，背景干凈，易于后續(xù)診斷。21 例份尿液脫落細(xì)胞塊切片F(xiàn)ISH 熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞單層平鋪，細(xì)胞核大小正常，形態(tài)輪廓清晰，熒光紅綠信號(hào)清晰，背景干凈，易于后續(xù)診斷。

3 討論

尿路上皮癌是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率逐年上升［1］。尿脫落細(xì)胞學(xué)涂片檢查作為尿路上皮癌的常規(guī)檢測(cè)，具有方法簡(jiǎn)便，特異性較高，對(duì)患者無(wú)損傷等特點(diǎn)，已在各層級(jí)醫(yī)院被廣泛應(yīng)用。但常規(guī)涂片法對(duì)技術(shù)要求較高，制作的涂片往往要么細(xì)胞少而分散，要么細(xì)胞重疊堆積，觀察費(fèi)時(shí)，導(dǎo)致敏感度下降出現(xiàn)漏診的情況，同時(shí)細(xì)胞學(xué)涂片還具有難還原組織學(xué)結(jié)構(gòu)、不可重復(fù)切片和較難進(jìn)行細(xì)胞染色等缺點(diǎn)，不適用于大規(guī)模的IHC 染色和FISH 檢測(cè)。細(xì)胞塊制備技術(shù)可將尿脫落細(xì)胞離心后經(jīng)石蠟包埋制成切片，可較清晰顯示細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)，能提高病理診斷的準(zhǔn)確性，有研究顯示直接涂片相比，細(xì)胞塊聯(lián)合常規(guī)涂片可使惡性腫瘤的檢出率增加6.5%～9.0%［2-4］。細(xì)胞蠟塊還可以連續(xù)切片，同常規(guī)石蠟包埋組織一樣可運(yùn)用于免疫組化和分子檢測(cè)，為病理檢測(cè)提供額外的診斷信息。

細(xì)胞塊制備技術(shù)是一種將細(xì)胞學(xué)樣本壓制成小球并包埋在石蠟塊中以進(jìn)一步加工成組織學(xué)標(biāo)本的技術(shù)，常用的方法有直接離心法，血漿凝血酶法和瓊脂法等［5］。細(xì)胞塊制備技術(shù)已在多種標(biāo)本上常規(guī)進(jìn)行，例如胸腹水、細(xì)針穿刺等。尿液樣本因不具備網(wǎng)絡(luò)脫落細(xì)胞的纖維蛋白，在丟棄上清液后剩余的細(xì)胞沉淀很難從離心管底部提取，傳統(tǒng)的細(xì)胞塊技術(shù)往往難以獲得完全滿(mǎn)意的細(xì)胞蠟塊。我們制備了一種基于特殊基質(zhì)制作的細(xì)胞蠟塊，該方法使用專(zhuān)用含基質(zhì)的離心管，基質(zhì)在加熱到85 ℃后可轉(zhuǎn)化成液態(tài)，混入尿液混懸液后，液態(tài)基質(zhì)中的大細(xì)胞、高核漿比細(xì)胞在離心力的作用下首先分離沉降至最下層，這些細(xì)胞往往是病變細(xì)胞；在4 ℃中基質(zhì)又轉(zhuǎn)化為固態(tài)作為支架材料，將沉淀的細(xì)胞固定在特定的空間位置，再將該區(qū)域固態(tài)基質(zhì)切割下來(lái)的就形成目標(biāo)細(xì)胞塊。該方法操作簡(jiǎn)單，易于掌握，在一定程度上使細(xì)胞塊的制作標(biāo)準(zhǔn)化。試劑盒配備兩種規(guī)格離心管（直徑4 和8 mm），可以根據(jù)尿液沉渣的體積選擇合適的離心管，沉渣多的時(shí)候選擇直徑8 mm的大容量離心管，細(xì)胞量少的時(shí)候可選擇直徑4 mm的小離心管。

使用該技術(shù)制作的尿液細(xì)胞塊與常規(guī)組織細(xì)胞塊類(lèi)似，可連續(xù)重復(fù)制片，且與常規(guī)組織蠟塊一樣因隔絕空氣可長(zhǎng)期保存。含有特殊基質(zhì)的細(xì)胞塊經(jīng)常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋切片后HE 染色，鏡下顯示細(xì)胞單層薄片狀排列、分布均勻、形態(tài)完整、結(jié)構(gòu)清晰、染色強(qiáng)度適宜、背景干凈，胞質(zhì)對(duì)比清晰，相較于細(xì)胞涂片更容易判讀。IHC 檢測(cè)是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)使用特定的抗體與組織或細(xì)胞中的目標(biāo)分子相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的定位和定量測(cè)定。尿液細(xì)胞涂片因不具備常規(guī)組織結(jié)構(gòu)的缺點(diǎn)而不易進(jìn)行IHC 染色定位，而尿液細(xì)胞塊富集的細(xì)胞類(lèi)似于組織學(xué)結(jié)構(gòu)，可以進(jìn)行IHC 染色。本研究顯示尿液細(xì)胞塊IHC 染色效果較好，染色定位準(zhǔn)確，背景干凈，對(duì)細(xì)胞特別是腫瘤細(xì)胞的識(shí)別更加準(zhǔn)確，可以運(yùn)用于常規(guī)病理檢測(cè)。尿脫落細(xì)胞FISH 檢測(cè)可以檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞中3號(hào)、7號(hào)、17號(hào)染色體非整倍性和9 號(hào)染色體上P16 基因位點(diǎn)缺失，對(duì)尿路上皮癌的早期診斷及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)具有重要價(jià)值，但傳統(tǒng)的尿脫落細(xì)胞FISH 檢測(cè)在尿涂片上檢測(cè)，常出現(xiàn)細(xì)胞重疊或分散的情況，增加了FISH檢測(cè)的診斷難度。尿液細(xì)胞塊FISH 切片鏡下細(xì)胞富集，單層平鋪，DAPI 復(fù)染示細(xì)胞核形態(tài)輪廓清晰，熒光紅綠信號(hào)清晰，背景干凈，相對(duì)于涂片F(xiàn)ISH 染色片，細(xì)胞塊切片F(xiàn)ISH 染色更易進(jìn)行熒光顯微鏡下觀察分析，不但降低了閱片難度，還縮短了閱片時(shí)間。本研究對(duì)細(xì)胞量較多的21 例尿液細(xì)胞塊均進(jìn)行了FISH 檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果均與細(xì)胞涂片F(xiàn)ISH 結(jié)果一致，說(shuō)明尿液細(xì)胞塊FISH 檢測(cè)的特異性較高。

雖然尿液細(xì)胞塊可能是一種與組織學(xué)塊相似的重要資源，但該技術(shù)并不適合所有尿脫落細(xì)胞樣本。本研究顯示在連續(xù)送檢的36例尿液標(biāo)本中，制成石蠟塊切片后仍有15例僅查見(jiàn)到極少量細(xì)胞，經(jīng)閱片后確認(rèn)不能滿(mǎn)足診斷要求，這一比例率高達(dá)41.67%，這些尿液的狀態(tài)描述往往為黃色清亮液體，離心后沉淀體積往往小于0.05 mL，因此，對(duì)細(xì)胞量較少的尿液樣本不適用于尿液細(xì)胞塊的制作。此外，與傳統(tǒng)涂片細(xì)胞學(xué)相比，細(xì)胞蠟塊制作成本高、制作時(shí)間長(zhǎng)，我們認(rèn)為細(xì)胞塊技術(shù)不能夠成為常規(guī)尿脫落細(xì)胞檢測(cè)的替代品，而是其補(bǔ)充。我們的建議是，在篩查尿細(xì)胞學(xué)樣本時(shí)應(yīng)相當(dāng)有目的地制作細(xì)胞蠟塊，需結(jié)合診斷實(shí)際需求和尿液細(xì)胞沉淀情況，使患者從細(xì)胞塊制備中受益最大化。

綜上所述，我們成功制備了尿脫落細(xì)胞塊，且制備的尿脫落細(xì)胞塊用于HE、IHC 和FISH 檢測(cè)效果較好。尿液細(xì)胞塊是較易獲得的組織來(lái)源，可能成為惡性腫瘤患者組織學(xué)分型和基因檢測(cè)的有效途徑。但本研究納入樣本量較少，今后應(yīng)擴(kuò)大樣本量和檢測(cè)范圍進(jìn)行更深入的研究。