生肌玉紅膏治療糖尿病足潰瘍活性成分、核心作用靶點(diǎn)基因的篩選及靶向結(jié)合關(guān)系預(yù)測驗(yàn)證

周宇，郭小英，吳標(biāo)良

1 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西百色 533000；2 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院

糖尿病足潰瘍（Diabetic Foot Ulcer，DFU）是糖尿病足的主要表現(xiàn)形式，是由神經(jīng)病變、血管病變、感染和外傷等多種因素導(dǎo)致的足部皮膚和/或深層組織損傷［1］。DFU 的年發(fā)病率約為8.1%，患者截肢率可高達(dá)85%［2］，且70%的患者在截肢術(shù)后5 年內(nèi)死亡［3］。因此，早期正確預(yù)防和治療DFU 可提高糖尿病患者的生存質(zhì)量。中醫(yī)外治法是臨床上治療DFU 的常用方法，其中以潰瘍創(chuàng)面局部用藥最為常用［4］。生肌玉紅膏是一種創(chuàng)面局部外用藥物，由當(dāng)歸、甘草、紫草、白芷、血竭、蟲白蠟、麻油和輕粉（化學(xué)名稱氯化亞汞）配制而成，目前已廣泛用于壓瘡、肛周疾病術(shù)后、燒傷等瘡瘍疾病的治療中［5］。研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，生肌玉紅膏能有效提高DFU 患者的足部創(chuàng)面愈合率，緩解創(chuàng)面疼痛。但生肌玉紅膏治療DFU的具體作用機(jī)制尚不明確。2023年1—5月，我們基于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)篩選生肌玉紅膏治療DFU 的活性成分及其核心作用靶點(diǎn)基因，并驗(yàn)證生肌玉紅膏治療DFU 的活性成分及其核心作用靶點(diǎn)基因的靶向結(jié)合關(guān)系，探討生肌玉紅膏方劑治療DFU 的可能作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 生肌玉紅膏的活性成分及其作用靶點(diǎn)基因篩選 在TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https：//old. tcmsp-e. com/tcmsp.php）中檢索生肌玉紅膏的主要活性成分，在查詢界面內(nèi)依次分別輸入各成分的漢語拼音“DANG GUI、GAN CAO、ZI CAO、BAI ZHI、XUE JIE、CHONG BAI LA、MA YOU、QING FEN”，篩選出類藥性（DL）≥0.18 的生肌玉紅膏的活性成分，根據(jù)結(jié)果查詢活性成分的對應(yīng)作用靶點(diǎn)基因，并使用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www. uniprot. org）將靶點(diǎn)基因英文全稱轉(zhuǎn)換成通用簡稱；從BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫（http：//bionet. ncpsb. org. cn/batman-tcm）以相同的輸入方式中篩選出生肌玉紅膏的主要活性成分（Score cutoff≥20 和P≤0.05），并找出其對應(yīng)作用靶點(diǎn)基因。對于TCMSP 和BATMAN-TCM 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫均未收錄的藥物成分“輕粉”，通過PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫找到成分對應(yīng)的SMILES 號(hào)后輸入 SuperPred 數(shù)據(jù)庫（https：//prediction.charite.de/subpages/target_prediction.php）預(yù)測其作用靶點(diǎn)基因。匯總TCMSP 數(shù)據(jù)庫、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫、SuperPred 數(shù)據(jù)庫中篩選出生肌玉紅膏活性成分及其作用靶點(diǎn)基因，取并集。將活性成分通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫、PubChem 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換成PubChem CID號(hào)，去除無確定化學(xué)式和結(jié)構(gòu)式的成分，刪除重復(fù)值后獲得生肌玉紅膏的活性成分及其作用靶點(diǎn)基因。

1.2 DFU 發(fā)病的靶點(diǎn)基因篩選 以“diabetic foot ulcer”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards（https：//www.uniprot. org）、OMIM（https：//omim. org）、PharmGkb（https：//www. pharmgkb. org）、TTD（https：//www.pharmgkb.org）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，匯總數(shù)據(jù)庫中所有DFU 發(fā)病的靶點(diǎn)基因，取并集后獲得DFU 發(fā)病的靶點(diǎn)基因。

1.3 生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點(diǎn)基因篩選及其生物學(xué)功能分析 將“1.1”得到的生肌玉紅膏的活性成分作用靶點(diǎn)基因、“1.2” 得到的DFU 發(fā)病靶點(diǎn)基因取交集，得到生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點(diǎn)基因。繪制韋恩圖，使用Cytoscape3.8.0 軟件插件CytoNCA 對各個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行Betweenness、Closeness、Eigenvector、Local Average Connectivitybased method、Network 評分，保留五項(xiàng)評分中均大于中位評分的作用靶點(diǎn)基因，為生肌玉紅膏治療DFU的作用靶點(diǎn)基因。運(yùn)用基因本體論（GO）和京都基因與基因百科全書（KEGG）通路富集分生肌玉紅膏治療DFU作用靶點(diǎn)基因的生物學(xué)功能。

1.4 生肌玉紅膏治療DFU 核心作用靶點(diǎn)基因篩選及其與生肌玉紅膏活性成分靶向結(jié)合關(guān)系預(yù)測及驗(yàn)證 生肌玉紅膏治療DFU 核心作用靶點(diǎn)基因篩選、與核心作用靶點(diǎn)基因有靶向結(jié)合關(guān)系的生肌玉紅膏活性成分預(yù)測 通過GOSemSim 包篩選出在生物過程、分子功能和細(xì)胞組分方面具有相似功能的核心DFU 發(fā)病靶點(diǎn)基因，并繪制靶點(diǎn)基因功能相似箱型圖。選取靶點(diǎn)基因功能相似箱型圖評分前5的作用靶點(diǎn)基因?yàn)楹诵淖饔冒悬c(diǎn)基因，預(yù)測與其有靶向結(jié)合關(guān)系的生肌玉紅膏活性成分。將靶點(diǎn)基因功能相似箱型圖評分前2 的核心靶點(diǎn)基因及與其具有靶向結(jié)合關(guān)系的生肌玉紅膏活性成分進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。從PubChem 網(wǎng)站下載活性成分結(jié)構(gòu)，將2 個(gè)核心靶點(diǎn)基因名稱輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫，選擇物種為智人，得到靶點(diǎn)基因?qū)?yīng)的UniProt 編號(hào)。在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www. rcsb. org）搜索靶點(diǎn)基因UniProt 編號(hào)對應(yīng)的靶點(diǎn)基因蛋白結(jié)構(gòu)，分別下載評分最高的蛋白結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Autodock vina 軟件對活性成分和靶點(diǎn)基因蛋白進(jìn)行分子對接并計(jì)算對接得分，分子對接得分絕對值＞5 kcal/moL 視為結(jié)合穩(wěn)定，使用PyMOL 軟件進(jìn)行作圖，顯示與活性成分結(jié)合的靶點(diǎn)基因的氨基酸殘基，并計(jì)算兩者連接氫鍵的長度。

2 結(jié)果

2.1 生肌玉紅膏活性成分及其作用靶點(diǎn)基因 槲皮素、熊果酸、甘草查爾酮A、1-甲基-2-十二烷基-4-喹諾酮等371 個(gè)成分為生肌玉紅膏的活性成分，與生肌玉紅膏活性成分有靶向結(jié)合關(guān)系的作用靶點(diǎn)基因有1 762 個(gè)，主要包括表皮生長因子受體（EGFR）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、SRC 原癌基因（SRC）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）等。

2.2 DFU 發(fā)病的靶點(diǎn)基因 GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD4 個(gè)數(shù)據(jù)庫中，分別獲取2 647、167、8、19 個(gè)DFU 治療靶點(diǎn)基因，取并集后去除重復(fù)的靶點(diǎn)基因，最終得到2 690個(gè)DFU發(fā)病的靶點(diǎn)基因。

2.3 生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點(diǎn)基因及其生物學(xué)功能 將1 762 個(gè)生肌玉紅膏活性成分作用靶點(diǎn)基因和2 690 個(gè)DFU 發(fā)病靶點(diǎn)基因取交集，共得到生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點(diǎn)基因639個(gè)。經(jīng)CytoNCA 插件對639 個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行二次評分后，最終EGFR、STAT3、AKT1 等39 個(gè)為生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點(diǎn)基因。GO 功能分析的結(jié)果顯示，生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點(diǎn)基因主要涉及上皮細(xì)胞增殖、肌細(xì)胞增殖、miRNA 轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)過程。KEGG 通路富集分析顯示，生肌玉紅膏治療DFU 的作用靶點(diǎn)基因主要富集于PI3K/AKT 信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。

2.4 生肌玉紅膏治療DFU 核心作用靶點(diǎn)基因及其與生肌玉紅膏活性成分靶向結(jié)合關(guān)系 GOSemSim包分析結(jié)果顯示，EGFR、STAT3、TGF-β1、SRC、AKT1等5個(gè)作用基因?yàn)樯∮窦t膏治療DFU的核心作用靶點(diǎn)基因。生肌玉紅膏治療DFU的5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?qū)?yīng)的活性成分共29 個(gè)，包含甘草活性成分17個(gè)、當(dāng)歸活性成分6個(gè)、白芷活性成分4個(gè)、紫草活性成分1個(gè)、血竭活性成分1個(gè)、輕粉活性成分1個(gè)，其中當(dāng)歸和白芷共有的活性成分1 個(gè)，甘草和紫草共有的活性成分1個(gè)。

靶點(diǎn)基因功能相似箱型圖評分前兩個(gè)核心靶點(diǎn)基因?yàn)镋GFR 和STAT3，生肌玉紅膏中的活性成分槲皮素、1-甲基-2-十二烷基-4-喹諾酮、氯化亞汞和EGFR 有靶向結(jié)合關(guān)系，熊果酸、甘草查爾酮A 與STAT3有靶向結(jié)合關(guān)系。分子對接結(jié)果顯示除氯化亞汞和EGFR 的結(jié)合不穩(wěn)定外，其余活性成分和靶點(diǎn)基因結(jié)合較好。其中槲皮素與EGFR 對接得分為-7.9 kcal/moL，槲皮素與EGFR 的氨基酸殘基ASP-831、GLN-767、THR-830、GLU-738 連接的氫鍵長度分別為2.5、2.2、2.1、2.1 ?，與氨基酸殘基MET-769存在兩條連接氫鍵，長度分別為2.5、2.4 ?；1-甲基-2-十二烷基-4-喹諾酮與EGFR 對接得分為-5.9 kcal/moL，1-甲基-2-十二烷基-4-喹諾酮與EGFR 的ASP-831 氨基酸殘基連接的氫鍵長度為2.5 ?；熊果酸與STAT3 對接得分為-8.0 kcal/moL，熊果酸與STAT3 的氨基酸殘基ILE-258 連接的氫鍵長度為2.1 ?；甘草查爾酮A 與STAT3 對接得分為-6.3kcal/mol，甘草查爾酮A 與STAT3 的氨基酸殘基GLU-247、GLU-326、SER-514 的連接的氫鍵長度分別為分別為2.5、2.2、2.2 ?。

3 討論

生肌玉紅膏是一種經(jīng)典外用中藥制劑，用于治療癰疽、皮膚潰爛等疾病，能減少患者的皮膚愈合時(shí)間、減輕患者痛苦。我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法獲取生肌玉紅膏各配方中的主要活性成分，通過活性成分與DFU 相關(guān)的靶點(diǎn)基因靶向結(jié)合關(guān)系發(fā)現(xiàn)生肌玉紅膏治療DFU 的關(guān)鍵成分為槲皮素、1-甲基-2-十二烷基-4-喹諾酮、熊果酸、甘草查爾酮A 等。槲皮素有抑制炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的作用［8］，局部應(yīng)用槲皮素于創(chuàng)面可以減少炎癥細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和TGF-β1的表達(dá)水平，從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和微血管生成，加速創(chuàng)面的愈合［9］。熊果酸具有抗炎、抗菌的藥理學(xué)活性［10］，在糖尿病小鼠創(chuàng)面治療中，加入熊果酸的納米纖維傷口敷料更有效地抑制炎癥和氧化應(yīng)激，同時(shí)促進(jìn)創(chuàng)面的血管生成、膠原沉積和再上皮化，從而使糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面更快愈合［11］。甘草查爾酮A是一種黃酮類化合物，具有廣泛的藥理學(xué)活性，包括抗炎、抗氧化、抗菌，調(diào)節(jié)血糖等［12］。關(guān)于1-甲基-2-十二烷基-4-喹諾酮的藥理學(xué)報(bào)道較少，而其與EGFR 分子對接能形成穩(wěn)定的化合物，說明其在治療DFU中有一定的潛能。

生肌玉紅膏治療DFU 的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?yàn)镋GFR、STAT3、TGF-β1、SRC、AKT1。EGFR 是一種跨膜酪氨酸激酶受體，屬于酪氨酸激酶受體家族的成員，主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)，在細(xì)胞生長、分化和存活等生物過程中起到關(guān)鍵作用［13］。EGFR 信號(hào)傳導(dǎo)激活能驅(qū)動(dòng)人角質(zhì)形成細(xì)胞干細(xì)胞的移動(dòng)和修復(fù)功能，從而促進(jìn)皮膚再生［14］。STAT3是一種在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，主要涉及細(xì)胞生長、分化、免疫反應(yīng)和凋亡等過程，是多種炎癥信號(hào)和血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子，可以被具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的受體EGFR 和非受體酪氨酸激酶JAK 來激活［15］。STAT3 的激活會(huì)增加血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖［16］；TGF-β1能增加糖尿病大鼠燒傷創(chuàng)面的VEGF表達(dá)水平，并誘導(dǎo)毛細(xì)血管再生和重塑以促進(jìn)傷口愈合［17］；SRC是乳腺癌發(fā)生相關(guān)的基因，能促進(jìn)傷口愈合過程中角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移；AKT1 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）的家族成員之一，主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)［18］。這5 個(gè)靶點(diǎn)基因與糖尿病足潰瘍的愈合有直接或間接的聯(lián)系，可能是生肌玉紅膏發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。

生肌玉紅膏治療DFU 靶點(diǎn)基因涉及的主要信號(hào)通路為PI3K/AKT 信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路。PI3K/AKT 信號(hào)通路不僅參與糖代謝調(diào)控，還參與創(chuàng)面愈合，許多藥物促進(jìn)傷口愈合的核心機(jī)制之一是激活PI3K/AKT 通路，通過增加VEGF 表達(dá)來促進(jìn)血管形成、肉芽形成和上皮化［19］；AGE 和RAGE 在糖尿病足潰瘍的形成和進(jìn)展中起著重要作用。AGE 是由高血糖和氧化應(yīng)激引起的糖基化終產(chǎn)物，可通過與RAGE 結(jié)合而產(chǎn)生炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。在糖尿病患者中，長期高血糖導(dǎo)致AGE 的過度積累，進(jìn)而激活RAGE。RAGE 的激活會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和影響成纖維細(xì)胞的增殖功能，從而抑制傷口的愈合和加重組織損傷［20］。HIF-1 信號(hào)通路參與了糖尿病足潰瘍的愈合，其中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）/VEGF軸功能受損是糖尿病血管生成障礙的主要機(jī)制。在糖尿病中，HIF-1α 的功能活性降低，導(dǎo)致傷口無法上調(diào)VEGF 以響應(yīng)缺血組織信號(hào)，從而導(dǎo)致血管生成受損和傷口愈合受損［21］。

綜上所述，生肌玉紅膏活性成分通過影響PI3K/AKT 信號(hào)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等，靶向調(diào)控EGFR、STAT3、AKT1 等作用靶點(diǎn)基因，參與促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖、抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物生成等過程，發(fā)揮DFU 治療作用。后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步探索生肌玉紅膏治療DFU 的活性成分與疾病靶點(diǎn)基因的具體作用機(jī)制，為生肌玉紅膏的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。