雞腿菇產(chǎn)纖溶酶液體發(fā)酵體系優(yōu)化

王今雨，劉曉蘭，3*，景 言，鄭喜群，3

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院 黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

血栓栓塞性疾?。╟ardiovascular diseases，CVDs）已成為影響人類健康的第一大殺手，其成因主要是由于纖溶系統(tǒng)異常導(dǎo)致可溶性的纖維蛋白原在凝血酶的作用下轉(zhuǎn)化為不溶的纖維蛋白并在血液中沉積形成血栓[1]。當(dāng)前主要的溶栓劑有纖溶酶和纖溶酶原激活劑，通過直接或間接溶解血纖維蛋白來降解血栓[2]，雖具有較好的溶栓效果，但因特異性差、半衰期短、易引起過敏反應(yīng)等缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了其應(yīng)用[3]，因此，亟需開發(fā)安全可靠、副作用小的新型溶栓酶。

纖溶酶是一種特異性水解纖維蛋白的蛋白水解酶。廣泛存在于動物、植物和微生物中，其中微生物以其種類繁多、繁殖快、易培養(yǎng)、易改造的特點(diǎn)為開發(fā)新型溶栓劑提供了更多可用的資源[4-6]。微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)纖溶酶的主要方法，可在較短的時間內(nèi)獲得大量的目的產(chǎn)物，目前已從多種微生物代謝產(chǎn)物中分離得到纖溶酶[7-11]。研究發(fā)現(xiàn)，在大型真菌的子實(shí)體、菌絲體和培養(yǎng)液中均可分離得到纖溶酶，LI G L等[12]從茶樹菇子實(shí)體中分離得到具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶ACase，并發(fā)現(xiàn)其具有體外抗栓活性；CHOI J H等[13-14]從阿魏菇子實(shí)體中分離得到纖溶酶，發(fā)現(xiàn)該酶可以直接水解纖維蛋白聚合物，抑制纖維蛋白凝塊的形成；從牛肝菌子實(shí)體中分離得到纖溶酶并研究其酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其屬于絲氨酸蛋白酶；LIU X L等[11]以蛹蟲草為原料，通過液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)一種新型纖溶酶；崔日花等[15]研究發(fā)現(xiàn)，榆干離褶傘纖溶酶對大鼠血栓具有一定的緩解作用。以上結(jié)果表明，大型真菌是生產(chǎn)纖溶酶的優(yōu)良菌種。因此，開發(fā)新型食用菌菌種，生產(chǎn)高活性食源性纖溶酶具有現(xiàn)實(shí)意義。

雞腿菇（Coprinus comatu）學(xué)名毛頭鬼傘，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，富含包括人體8種必需氨基酸在內(nèi)的20種氨基酸及多種生物活性因子，已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織確定為集“天然、營養(yǎng)、保健”功能為一體的16種珍稀食用菌之一[16-17]。其具有抗氧化、降血糖、防止肝損傷、抗腫瘤、提高免疫力、抑菌等多種生理功能[18-19]，但目前對雞腿菇的研究多集中在多糖，尚未發(fā)現(xiàn)有其產(chǎn)纖溶酶相關(guān)方面的研究。因此，本研究以雞腿菇為菌種，采用菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵法生產(chǎn)纖溶酶，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高纖溶酶活力，為開發(fā)具有溶栓效果的功能性產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和材料

雞腿菇（Coprinus comatus）CGMCC NO.40393：中國普通微生物菌種保藏管理中心。豆餅粉、大米、玉米粉、豆粕、玉米胚芽粕：市售；玉米漿、玉米漿水解液、玉米漿水解粉：齊齊哈爾龍江阜豐生物科技有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糊精、乳糖（均為分析純或生化試劑）：天津百倫斯生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硝酸鉀、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、氯化銨（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏、酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；巴比妥鈉（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；牛凝血酶（酶活2 000 IU/mg）、牛血纖維蛋白原（純度≥98%）、尿激酶（酶活50 000 U/g）：上海經(jīng)科生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：將土豆去皮，稱質(zhì)量后切小塊煮沸25 min后，用8層紗布進(jìn)行過濾，取過濾好的土豆汁20%，分別加入瓊脂2.5%，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，pH自然。115 ℃滅菌20 min。

PDA液體培養(yǎng)基：土豆汁20%，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，pH自然。115 ℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，豆粕3%，（NH4）2SO40.2%，裝液量30 mL/250 mL，接種量10%，pH自然（pH 6.06）。115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

pH S-25型酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Himac CF15RX冷凍離心機(jī)：天美科學(xué)儀器有限公司；SX-700壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZQZYCF9.9振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚國儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備股份公司；0-150 mm電子游標(biāo)卡尺：桂林廣陸數(shù)字測控有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雞腿菇種子液、發(fā)酵液及粗酶液的制備

在傳代培養(yǎng)的PAD培養(yǎng)基上打孔取下直徑為0.9 cm的雞腿菇菌片1片，接種于PDA液體培養(yǎng)基中，24℃、160r/min振蕩培養(yǎng)8 d，得到種子液。雞腿菇種子液按照10%（V/V）接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，24 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，得到發(fā)酵液。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min 離心15 min，收集上清液即為雞腿菇液體發(fā)酵粗酶液。

1.3.2 生長曲線及產(chǎn)酶曲線的測定

將雞腿菇菌種經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)基活化后，接種至裝液量為50 mL/250 mL PDA液體培養(yǎng)基中，24 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)時間1～13 d內(nèi)取樣，測定生物量及纖溶酶酶活力。

1.3.3 雞腿菇纖溶酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)，分別探究添加量均為2%的碳源種類（葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、糊精、可溶性淀粉、大米粉、麩皮、玉米粉）、最佳碳源添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、添加量均為3%的無機(jī)氮源種類（KNO3、NH4H2PO4、（NH4）2SO4、NH4NO3、（NH4）2HPO4、NH4Cl）及有機(jī)氮源種類（豆粕、豆粕水解液、豆餅粉、豆餅粉水解液、玉米漿、玉米漿水解液、玉米漿水解粉、玉米胚芽粕、牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨）、最佳有機(jī)氮源添加量（1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%），無機(jī)鹽種類（CaCl2、KH2PO4、MgSO4、K2HPO4、NaCl）及最佳無機(jī)鹽添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%、0.50%）對雞腿菇產(chǎn)纖溶酶酶活力的影響。每個試驗(yàn)做3個平行。

1.3.4 雞腿菇產(chǎn)纖溶酶液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

在接種量（3%、5%、10%、15%、20%）、裝液量（25mL/250mL、50mL/250mL、75mL/250mL、100mL/250mL、125mL/250mL、150 mL/250 mL）、初始pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、發(fā)酵溫度（22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、37 ℃）、發(fā)酵時間（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d）條件下，考察各單因素對雞腿菇產(chǎn)纖溶酶活力的影響，每個試驗(yàn)做3個平行。

（2）Plackett-Burman試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)篩選重要影響因素。選取培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件等8個因素作為優(yōu)化的輸入因子。試驗(yàn)選用N=12的設(shè)計(jì)安排，對果糖（A）、豆餅粉（B）、磷酸二氫鉀（C）、硫酸鎂（D）、接種量（E）、裝液量（F）、發(fā)酵時間（G）、發(fā)酵溫度（H）8個因素進(jìn)行考察，設(shè)置3個虛擬項(xiàng)，每個因素分別取兩個水平，響應(yīng)值為酶活力。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

（3）Box-Behnken試驗(yàn)

根據(jù)單因素及Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，選取果糖（X1）、豆餅粉（X2）和發(fā)酵時間（X3）3個因素為自變量，以纖溶酶活力（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因子編碼值及自變量水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.5 分析檢測

（1）纖溶酶活力的測定

纖溶酶的活力與其在血纖維蛋白平板上水解纖維蛋白后所形成的溶圈直徑呈正相關(guān)[20]，因此，采用血纖維蛋白平板法[11]測定雞腿菇纖溶酶活力。取10 μL粗酶液點(diǎn)加于血纖維蛋白平板表面，37 ℃保溫6 h后測溶圈直徑。以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用0.9%的氯化鈉溶液分別配制濃度為10 U/mL、30 U/mL、50 U/mL、100 U/mL、150 U/mL、200 U/mL、250 U/mL、300 U/mL的尿激酶溶液，測定尿激酶在血纖維平板上的溶圈直徑。纖溶酶酶活力計(jì)算公式如下：

y=0.050 6e5.4285x

式中：y為酶活力，U/mL；x為溶圈直徑，cm。

（2）生物量的測定

采用干質(zhì)量法[21]，分別將培養(yǎng)1～13 d的菌絲體在8 000 r/min條件下離心后，將菌絲體轉(zhuǎn)移至已稱質(zhì)量的干燥濾紙上，置于60 ℃恒溫干燥至水分完全除去，稱質(zhì)量，計(jì)算菌絲體干燥前后質(zhì)量差值即為菌絲體的干質(zhì)量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5繪圖及處理數(shù)據(jù)、Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Plackett-Burman及Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析、SPSS25.0分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并結(jié)合Duncan氏法多重比較，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，P＜0.05為差異顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞腿菇菌生長曲線及產(chǎn)酶曲線

雞腿菇菌絲體生長曲線及產(chǎn)酶曲線如圖1所示，在培養(yǎng)時間1～6 d時，菌體生長處于延滯期，雞腿菇孢子處于萌發(fā)狀態(tài)，生長速率低。培養(yǎng)時間6 d后菌絲干質(zhì)量迅速生長，培養(yǎng)時間8 d時，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大值，說明菌絲開始分枝繁殖進(jìn)入快速生長期，此時菌體活力最為旺盛，最適合作為種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)時間8 d后菌絲干質(zhì)量逐漸下降，菌體生長逐漸進(jìn)入衰退期，出現(xiàn)自溶。由于處于快速生長期的菌種酶系活躍，代謝旺盛，發(fā)酵生長所需時間短，能夠提高代謝物活力，由圖1亦可知，當(dāng)雞腿菇菌種種齡為8 d時，菌絲干質(zhì)量及纖溶酶活力均達(dá)到最大值。因此，最適雞腿菇菌種種齡為8 d。

圖1 雞腿菇菌液體種子生長曲線及產(chǎn)酶曲線Fig.1 Growth curve and enzyme production curve of Coprinus comatus

2.2 雞腿菇纖溶酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 碳源種類及最適碳源添加量的確定

碳源種類及最適碳源添加量對纖溶酶活力的影響結(jié)果見圖2。由圖2A可知，以果糖為碳源時，雞腿菇纖溶酶酶活力最高。這可能是因?yàn)楣菫閱翁?，作為速效碳源在發(fā)酵中易被微生物直接利用，使菌體迅速生長，與同樣是單糖的葡萄糖相比，雖二者分子式相同，但分子結(jié)構(gòu)中羥基的位置不同且代謝途徑不同，果糖相較于葡萄糖，在進(jìn)入糖酵解過程中消耗更少的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），這可能為微生物發(fā)酵產(chǎn)酶提供了更加充分的發(fā)酵能量。因此，選用果糖為最優(yōu)碳源類型，并進(jìn)一步確定其最適添加量，由圖2B可知，在果糖添加量為3%時，纖溶酶活力最高（58.46 U/mL），之后纖溶酶活力隨果糖添加量的升高而降低。其原因可能是碳源濃度過高導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓失衡，菌體代謝受到抑制，阻滯雞腿菇纖溶酶的積累[22-23]。因此，最佳碳源為果糖，最適果糖添加量為3%。

圖2 碳源種類（A）及果糖添加量（B）對纖溶酶活力的影響Fig.2 Effects of carbon sources types (A) and fructose addition (B) on fibrinolytic enzyme activities

2.2.2 氮源種類及最適氮源添加量的確定

由于微生物生長環(huán)境中存在纖溶酶底物的結(jié)構(gòu)類似物，同時又缺乏其他可利用的氮源，因此，氮源的選擇對纖溶酶的生產(chǎn)具有一定的誘導(dǎo)作用[25-26]。本實(shí)驗(yàn)分別選取無機(jī)氮源和有機(jī)氮源，其中有機(jī)氮源主要來自蛋白含量豐富的大豆和玉米的農(nóng)副產(chǎn)物，綜合考察不同氮源對雞腿菇纖溶酶活力的影響。

由圖3A可知，無機(jī)氮源中磷酸二氫銨所產(chǎn)纖溶酶活力最高為68.8 U/mL。由圖3B可知，有機(jī)氮源中以豆餅粉所產(chǎn)雞腿菇纖溶酶活力最高，可達(dá)87.25 U/mL。因此，從誘導(dǎo)酶角度，選用有機(jī)氮源豆餅粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。豆餅粉是大豆榨油后的下腳料，來源廣泛，成分穩(wěn)定，存在較為豐富的大豆蛋白且含量高、種類多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，推測有較多纖溶酶可作用的位點(diǎn)與血纖維蛋白結(jié)構(gòu)相似或一致，有利于誘導(dǎo)雞腿菇纖溶酶的產(chǎn)生[27-28]。由圖3C可知，豆餅粉添加量為3.5%時，所產(chǎn)纖溶酶活力最高，之后纖溶酶活力隨豆餅粉添加量的增加而減少，其原因可能由于添加過多的豆餅粉使培養(yǎng)基過于黏稠，溶氧量降低，不利于雞腿菇的生長及代謝產(chǎn)物的積累。因此，最佳氮源為豆餅粉，最適豆餅粉添加量為3.5%。

圖3 無機(jī)氮源（A）、有機(jī)氮源（B）種類及豆餅粉添加量（C）對纖溶酶活力的影響Fig.3 Effect of inorganic nitrogen source (A), organic nitrogen source (B) types and soybean cake addition (C) on fibrinolytic enzyme activities

2.2.3 無機(jī)鹽種類及組成的確定

不同無機(jī)鹽種類對雞腿菇纖溶酶活力的影響見圖4。由圖4A可知，不同無機(jī)鹽中MgSO4、KH2PO4對酶活力的影響最大，NaCl次之。推測K+、Mg2+、Na+容易被菌體利用，積累代謝產(chǎn)物，其中KH2PO4對發(fā)酵體系的pH具有一定的緩沖作用，為菌體提供穩(wěn)定的生長環(huán)境，同時其所含磷酸鹽可參與ATP、三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）在內(nèi)的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，為菌體生長和代謝提供能量；Mg2+可能是雞腿菇纖溶酶活性中心的組分，有助于維持酶的特定構(gòu)象，對酶的活性有激活作用[29]；Na+影響細(xì)胞和培養(yǎng)基之間的滲透壓，可以提高酶的活力[30]。因此，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)先選用MgSO4、KH2PO4為培養(yǎng)基的無機(jī)鹽組分，并進(jìn)一步優(yōu)化其添加量。由圖4A和4B可知，隨著MgSO4和KH2PO4添加量的增加，所產(chǎn)雞腿菇纖溶酶活力呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，MgSO4和KH2PO4添加量分別為0.20%、0.25%時，纖溶酶活力最高。分析原因可能是由于本發(fā)酵培養(yǎng)基配制用水為自來水，自來水中本身還有少量的金屬離子，外添加過高的Mg2+和K+可能造成了對菌株產(chǎn)纖溶酶的抑制作用。因此，最適MgSO4添加量為0.20%，最適KH2PO4添加量為0.25%。

圖4 無機(jī)鹽種類（A）及硫酸鎂（B）、磷酸二氫鉀（C）添加量對纖溶酶活力的影響Fig.4 Effects of inorganic salt types (A), magnesium sulfate (B) and potassium dihydrogen phosphate (C) addition on fibrinolytic enzyme activities

2.3 雞腿菇纖溶酶培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1 裝液量的確定

由圖5可知，隨著裝液量在25mL/250mL～150mL/250mL范圍內(nèi)的增加，雞腿菇纖溶酶活力呈現(xiàn)先增加再緩慢降低的趨勢。由于裝液量影響發(fā)酵液與空氣的接觸面積，當(dāng)轉(zhuǎn)速一定時，裝液量與氧的傳遞密切相關(guān)[30]。裝液量為50 mL/250 mL時，纖溶酶活力最高；當(dāng)裝液量過少時，發(fā)酵液中水分隨著發(fā)酵時間延長而逐漸蒸發(fā)，過少的發(fā)酵基質(zhì)不利于菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)物積累；雞腿菇是好氧微生物，當(dāng)裝液量過多時，會導(dǎo)致瓶內(nèi)溶氧不足，不能滿足菌體繁殖旺盛期耗氧量大的需求，影響雞腿菇的生長代謝。因此，最適裝液量為50 mL/250 mL。

圖5 裝液量對纖溶酶活力的影響Fig.5 Effect of liquid volume on fibrinolytic enzyme activities

2.3.2 接種量的確定

在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，為了加速產(chǎn)物的合成，使菌體能夠迅速進(jìn)入快速生長期，往往會加大接種量，但接種量過大會增加生產(chǎn)成本，因菌體生長過快，使菌體過早的進(jìn)入快速生長期，產(chǎn)生大量孢子消耗營養(yǎng)物質(zhì)，同時因培養(yǎng)液黏稠度增加導(dǎo)致溶氧不足，進(jìn)而影響代謝物的合成[31]。由圖6可知，當(dāng)接種量為10%時，纖溶酶活力最高。接種量＜10%時，因接種量過小，菌體未生長飽和，代謝速率緩慢，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率較低；當(dāng)接種量＞10%時，接種量過多，導(dǎo)致過多菌絲體同時生長繁殖，發(fā)酵液黏稠度迅速增加，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，影響代謝產(chǎn)物的合成。因此，最適接種量為10%。

2.3.3 初始pH值的確定

在發(fā)酵過程中，微生物不斷分解和同化營養(yǎng)物質(zhì)并將其轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物，引起發(fā)酵液中pH的不斷變化，直接影響酶的產(chǎn)量和質(zhì)量，在發(fā)酵過程中主要通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH的方法來在控制發(fā)酵液的pH值。發(fā)酵培養(yǎng)基的自然pH值在6.03～6.12范圍，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值，不同初始pH值對纖溶酶活力的影響結(jié)果見圖7。

圖7 初始pH值對纖溶酶活力的影響Fig.7 Effect of initial pH value on fibrinolytic enzyme activities

由圖7可知，酶活力隨培養(yǎng)基初始pH值的變化呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，當(dāng)初始pH值為6.0時，纖溶酶活力達(dá)到最高值，為108.20U/mL。因此，最適培養(yǎng)基初始pH值為自然。

2.3.4 發(fā)酵溫度的確定

控制發(fā)酵溫度對菌體生長和產(chǎn)物形成有重要作用。由圖8可知，纖溶酶活力隨發(fā)酵溫度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在發(fā)酵溫度為22～24 ℃時，纖溶酶活力隨之增加；在發(fā)酵溫度24 ℃時，纖溶酶活力達(dá)到最大值（122.73 U/mL）；在發(fā)酵溫度高于24 ℃之后，纖溶酶活力隨之下降。因此，最適發(fā)酵溫度為24 ℃。

2.3.5 發(fā)酵時間的確定

由圖9可知，纖溶酶活力隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在發(fā)酵時間為4～6 d時，纖溶酶活力隨之增加；在發(fā)酵時間為6 d時，纖溶酶活力達(dá)到最大值，為132.02 U/mL；發(fā)酵時間＞6 d之后，纖溶酶活力隨之下降。因此，最適發(fā)酵時間為6 d。

圖9 發(fā)酵時間對酶活力的影響Fig.9 Effect of fermentation time on fibrinolytic enzyme activities

2.4 雞腿菇纖溶酶培養(yǎng)條件優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)

Plackett-Burman試驗(yàn)共設(shè)計(jì)12組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果見表3，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對表3中的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)回歸性分析，所得各因素的回歸系數(shù)及重要性評價見表4。由表4可知，對雞腿菇纖溶酶活力影響最為顯著的3個因素分別為果糖添加量、豆餅粉添加量、發(fā)酵時間，其中，果糖、豆餅粉的添加量對纖溶酶活力的影響顯著（P＜0.05），發(fā)酵時間對酶活力的影響極顯著（P＜0.01），其他因素對酶活的影響不顯著（P＞0.05）。對纖溶酶活力的影響程度依次為：發(fā)酵時間＞果糖添加量＞豆餅粉添加量。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)主效應(yīng)分析Table 4 Main effect analysis of Plackett-Burman experiments design

2.5 雞腿菇纖溶酶培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果及響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素及Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，選取果糖添加量（X1）、豆餅粉添加量（X2）和發(fā)酵時間（X3）為自變量，以纖溶酶活力（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果表5，回歸模型方差分析結(jié)果見表6。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert 8.0.6 軟件，對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到果糖添加量（X1）、豆餅粉添加量（X2）和發(fā)酵時間（X3）對纖溶酶活力（Y）影響的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=129.05-6.5X1+8.11X2+9.99X3+5.56X1X2+1.96X1X3-0.96X2X3-24.67X12-32.10X22-19.67X32

由表6可知，所得回歸模型P＜0.01，極為顯著，說明模型設(shè)計(jì)合理可用，且失擬項(xiàng)檢驗(yàn)P＞0.05，不顯著，說明試驗(yàn)誤差較小，該模型數(shù)據(jù)可用，此模型決定系數(shù)R2=0.965 1，說明模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合度較高，回歸模型理想，故可用此回歸模型預(yù)測培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件與纖溶酶活力之間的關(guān)系。由P值可知，一次項(xiàng)X2、X3對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)X12、X22、X32對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。由F值可知，3個因素對結(jié)果影響順序依次為X3＞X2＞X1，即發(fā)酵時間＞豆餅粉添加量＞果糖添加量。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對回歸方程求解，得到最佳發(fā)酵條件為：果糖添加量2.89%，豆餅粉添加量3.61%，發(fā)酵時間6.25 d。在此條件下模型預(yù)測雞腿菇纖溶酶活力為131.091 U/mL。為便于實(shí)際操作，修正發(fā)酵條件為果糖添加量2.9%、豆餅粉添加量3.6%，發(fā)酵時間6 d。為了驗(yàn)證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，在次最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。平均纖溶酶酶活實(shí)際值為（136.89±2.32）U/mL，與模型預(yù)測值相差不大，因此該模型可以較好的預(yù)測實(shí)際酶活力。

通過對雞腿菇發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，確定最佳產(chǎn)酶條件為果糖2.9%、豆餅粉3.6%、KH2PO40.25%、MgSO40.2%、pH自然、接種量10%、裝液量50 mL/250 mL、發(fā)酵溫度24 ℃、發(fā)酵時間6 d、搖瓶轉(zhuǎn)速160 r/min。在此優(yōu)化條件下，雞腿菇纖溶酶活力136.89 U/mL，比優(yōu)化前提高了4.28倍。

3 結(jié)論

本研究以雞腿菇為菌種，通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)及Box-Behnken試驗(yàn)對其液體發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件進(jìn)行研究。最終確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為果糖2.9%、豆餅粉3.6%、KH2PO40.25%、MgSO40.2%；最佳發(fā)酵條件為液體種子種齡8 d，接種量10%，裝液量50 mL/250 mL、發(fā)酵溫度24 ℃、發(fā)酵時間6 d、搖瓶轉(zhuǎn)速160 r/min。在此優(yōu)化條件下，雞腿菇纖溶酶活力可達(dá)136.89 U/mL，比優(yōu)化前提高了4.28倍。本研究采用的液體發(fā)酵方法是微生物產(chǎn)纖溶酶及提高酶活力的有效途徑，為挖掘優(yōu)良食用菌種來源的纖溶酶，開發(fā)新型具有溶栓抗栓作用的酶制劑和功能性食品奠定理論基礎(chǔ)。