銀葉金合歡葉多酚提取工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

黃秋萍，韋友歡，鄭燕菲，趙漢民，張?jiān)葡?，黃秋嬋*

（廣西民族師范學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 崇左 532200）

銀葉金合歡（Acacia podalyriifolia）是薔薇目金合歡屬植物，又名珍珠相思、真珠相思、昆士蘭銀條等[1]，在我國(guó)主要分布于浙江、廣東、廣西、云南、四川等地[2]。銀葉金合歡的使用價(jià)值較高，本種多枝、多刺，可植作綠籬；木料堅(jiān)固，可做為名貴工具；根及莢果含丹寧，可作為黑色著色汁，做藥服用能夠收斂清熱解毒；在冬天和早春有金黃色的球形狀的小花會(huì)盛開(kāi)，花帶有清香，可以提煉香料；枝莖流出的樹(shù)脂，可以供美工用及藥用[3]。同時(shí)，銀葉金合歡具備四季長(zhǎng)綠，葉子多、生長(zhǎng)較快的特點(diǎn)，可以提供充足的實(shí)驗(yàn)原材料。

目前，關(guān)于合歡屬植物的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理活性方面的研究[4]，但銀葉金合歡植物有效化學(xué)成分的提取及提取液的藥理研究鮮見(jiàn)報(bào)道。植物多酚類(lèi)化合物具有抑菌[5]、抗腫瘤[6-7]及抗氧化[8]等多種作用，且不同植物中多酚含量及活性存在一定差異[9-12]。植物多酚具體應(yīng)用研究主要集中在植物多酚對(duì)畜禽肉品質(zhì)調(diào)控作用[13-15]、調(diào)節(jié)糖脂代謝作用[16-17]、抗炎機(jī)制[18-20]等方面的研究。植物多酚目前常用的綠色提取方法主要是微波輔助提取和超聲波輔助提取，與傳統(tǒng)的提取方法對(duì)比，具有提取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、提取率高等特點(diǎn)[21-23]，但是由于實(shí)驗(yàn)條件和成本的限制，并不能大規(guī)模實(shí)施，因此進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高效、綠色、安全且能大規(guī)模實(shí)施的新型多酚提取方法是科學(xué)工作者們努力的重要方向。

為提高銀葉金合歡植物的綜合利用，本研究采用超聲波輔助提取法提取銀葉金合歡葉中的多酚，經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝條件，并探究銀葉金合歡葉多酚的抗氧化活性，以期為銀葉金合歡葉中有效成分的提取，為后期開(kāi)發(fā)應(yīng)用于天然食品抗氧化劑和天然多酚類(lèi)藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀葉金合歡葉：2021年12月采摘于廣西崇左市江州區(qū)廣西民族師范學(xué)院，洗凈，恒溫60 ℃烘干，粉碎（60目篩）備用。

石油醚、乙醇、鹽酸、抗壞血酸、丙酮、碳酸鈉、30%過(guò)氧化氫、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、對(duì)氨基苯磺酸、甲醛、三氯化鐵、單寧酸（純度＞98%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；福林酚（分析純）：上海寶曼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SB-120DT超聲清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；DF-101S磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；80-2離心沉淀器：金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng)；RE3000C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；DGH-9143BS恒溫（鼓風(fēng)）干燥箱：寧波楊輝儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 銀葉金合歡葉多酚的提取

原料的制備：稱(chēng)取適量已粉碎并過(guò)60目篩的銀葉金合歡葉的粉末，放入圓底燒瓶中，按照固液比為1∶4（g∶mL）加入石油精，在70 ℃左右油浴鍋中回流4 h，對(duì)銀葉金合歡葉進(jìn)行脫脂、脫色，趁熱減壓過(guò)濾去除濾液，放入50 ℃電烘箱中烘干，獲得脫脂脫色的銀葉金合歡葉粉。

多酚的提?。悍Q(chēng)取銀葉金合歡葉粉末原料1.000 0 g，加入體積分?jǐn)?shù)為70%丙酮溶液20 mL，在提取溫度為50 ℃，時(shí)間為20 min的情況下，進(jìn)行超聲波輔助提取（提取功率60 W），離心（2 500 r/min、10 min）取上清液，即為銀葉金合歡葉多酚的提取液，注意避光保存。

1.3.2 銀葉金合歡葉多酚的檢測(cè)

采用福林酚試劑顯色法[24]，分別移取0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL、2.4 mL質(zhì)量濃度為0.137 mg/mL的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL的容量瓶中，每個(gè)容量瓶中先后加入福林酚溶液1.3 mL、飽和碳酸鈉溶液5 mL，均搖勻靜置6 min，最后用蒸餾水定容至刻度線(xiàn)，得到質(zhì)量濃度分別為0.004 mg/mL、0.006 mg/mL、0.008 mg/mL、0.010 mg/mL、0.012 mg/mL的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻避光靜置30 min，測(cè)定波長(zhǎng)760 nm處測(cè)相應(yīng)濃度的吸光度值[25]。以單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=92.2x+0.183 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1。多酚得率的測(cè)定：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程，計(jì)算多酚的質(zhì)量濃度，多酚得率的計(jì)算公式如下：

式中：W為銀葉金合歡葉多酚的得率，%；c為提取液質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；N為提取液稀釋的倍數(shù)；m為脫脂原料的質(zhì)量，g。

1.3.3 多酚提取條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取銀葉金合歡葉粉末原料1 g，加入體積分?jǐn)?shù)70%丙酮溶液20 mL，料液比為1∶20（g∶mL），進(jìn)行超聲波輔助提取，提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為20 min，經(jīng)離心（2 500 r/min、10 min）后取上清液，分別考察提取溶劑（體積分?jǐn)?shù)70%丙酮溶液、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇（1%鹽酸）溶液、蒸餾水）、丙酮體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））、提取溫度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）、提取時(shí)間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）對(duì)銀葉金合歡葉多酚得率的影響。

1.3.4 多酚提取工藝條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以丙酮體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時(shí)間（D）為影響因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 多酚提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for polyphenols extraction conditions optimization

1.3.5 抗氧化性能測(cè)定

測(cè)定最優(yōu)條件下提取的銀葉金合歡葉多酚對(duì)DPPH·、·OH、NO·3種自由基的清除能力，以對(duì)應(yīng)的清除率評(píng)價(jià)銀葉金合歡葉多酚的抗氧化活性。

DPPH·清除能力的測(cè)定：采用無(wú)水乙醇配制0.1 mg/mL的DPPH溶液，分別取質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL、0.35 mg/mL、0.4 mg/mL的銀葉金合歡葉多酚2 mL，再分別加入0.1 mg/mL的DPPH溶液2 mL，搖勻，避光放置30 min。用無(wú)水乙醇做為空白調(diào)零，在波長(zhǎng)517 nm的條件下測(cè)定其吸光度值A(chǔ)i。采用相同方法用無(wú)水乙醇替換DPPH溶液，記為Aj。取0.1 mg/mL的DPPH溶液2 mL和無(wú)水乙醇2 mL，反應(yīng)30 min，測(cè)定吸光度值記為A0。以與樣品溶液濃度相同的抗壞血酸溶液作陽(yáng)性對(duì)照[26]。試驗(yàn)平行3次，取平均值。多酚對(duì)DPPH·的清除率的計(jì)算公式如下：

·OH清除能力的測(cè)定：分別于五支10 mL比色管中加入2.0 mL質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL的銀葉金合歡葉多酚溶液，然后依次加入濃度均為6 mmol/L的FeSO4和H2O2溶液各2.0 mL并搖勻，避光靜置15 min，然后加入2.0 mL的6 mmol/L水楊酸乙醇溶液且加水定容至刻度線(xiàn)搖勻，避光靜置30 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)其吸光度值A(chǔ)1，不加水楊酸乙醇溶液的吸光度值記為A2，按照上述步驟，用蒸餾水取代樣品溶液作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)其吸光度值記為A0，以與樣品溶液濃度相同的抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照[27]。試驗(yàn)平行測(cè)定3次取平均值，多酚對(duì)·OH的清除率計(jì)算公式如下：

NO·清除能力測(cè)定：分別移取質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL、0.50 mg/mL、0.75 mg/mL、1.00 mg/mL、1.25 mg/mL的銀葉金合歡葉多酚溶液2 mL于10 mL比色管中，加入10 μg/mL的亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻避光條件下反應(yīng)30 min，后加入4 g/L對(duì)氨基苯磺酸1.0 mL，搖勻避光靜置5 min，再加入2 g/L的鹽酸萘乙二胺溶液1.0 mL，用去離子水定容至刻度線(xiàn)，搖勻避光靜置15 min，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)其吸光度值A(chǔ)i，其中沒(méi)有加亞硝酸鈉溶液的吸光度值記為Aj，按照相同的實(shí)驗(yàn)步驟，用蒸餾水取代銀葉金合歡葉多酚溶液作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)其吸光度值記為A0，同時(shí)以與樣品溶液濃度相同的抗壞血酸溶液對(duì)NO·的清除率作為陽(yáng)性對(duì)照[28]。試驗(yàn)平行測(cè)定3次取平均值，多酚對(duì)NO·的清除率計(jì)算公式如下：

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次取平均值，采用Origin8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溶劑的確定

由圖1可知，不同的提取溶劑對(duì)銀葉金合歡葉多酚提取率不同，當(dāng)以體積分?jǐn)?shù)70%丙酮溶液作為提取溶劑時(shí)，得到的多酚提取率最高，為15.93%。其以相似相溶原理為依據(jù)，多酚物質(zhì)和丙酮溶液的極性相似[29]，因此，確定銀葉金合歡葉多酚的提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)70%丙酮。

圖1 不同提取溶劑對(duì)銀葉金合歡葉多酚得率的影響Fig.1 Effect of different extraction solvent on polyphenols yield from Acacia podalyriifolia leaves

2.1.2 丙酮體積分?jǐn)?shù)的確定

由圖2可知，隨著丙酮體積分?jǐn)?shù)在50%～70%范圍內(nèi)的增加，銀葉金合歡葉多酚的得率呈增加趨勢(shì)；當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，銀葉金合歡葉多酚得率最高，為15.97%；丙酮體積分?jǐn)?shù)＞70%，銀葉金合歡葉多酚得率逐漸降低，其原因可能是，提取劑的體積分?jǐn)?shù)過(guò)大，脂溶性物質(zhì)也逐漸增多[30]。因此，確定丙酮體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖2 丙酮體積分?jǐn)?shù)對(duì)銀葉金合歡葉多酚得率的影響Fig.2 Effect of acetone volume fraction on polyphenols yield from Acacia podalyriifolia leaves

2.1.3 料液比的確定

由圖3可知，當(dāng)料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（mg∶mL）時(shí)，多酚得率逐漸增加；當(dāng)料液比為1∶20（g∶mL）時(shí)，多酚得率最高，為15.63%；料液比為1∶20、1∶25（g∶mL）時(shí)，多酚得率逐漸降低。其原因可能是，其他雜質(zhì)隨著溶劑量增大而溶出增多[31]。因此，確定料液比為1∶20（g∶mL）。

圖3 料液比對(duì)銀葉金合歡葉多酚得率的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on polyphenols yield from Acacia podalyriifolia leaves

2.1.4 提取時(shí)間的確定由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間為5～20 min時(shí)，銀葉金合歡葉

圖4 提取時(shí)間對(duì)銀葉金合歡葉多酚得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on polyphenols yield from Acacia podalyriifolia leaves

多酚得率呈增加趨勢(shì)；提取時(shí)間為20 min時(shí)；銀葉金合歡葉多酚得率達(dá)到最高值，為15.97%；當(dāng)提取時(shí)間＞20 min時(shí)，多酚得率下降，其原因可能是，多酚被氧化分解導(dǎo)致多酚得率降低[32]。因此，確定提取時(shí)間為20 min。

2.1.5 提取溫度的確定

由圖5可知，當(dāng)提取溫度為45～55 ℃時(shí)，多酚得率逐漸增加；當(dāng)提取溫度55 ℃時(shí)，銀葉金合歡葉多酚得率最高，為16.35%，其原因可能是，滲透和擴(kuò)散作用隨溫度升高而加快，多酚溶出增多而得率增大[33]；當(dāng)提取溫度高于55 ℃時(shí)，多酚得率逐漸下降。因此，確定提取時(shí)間為55 ℃。

圖5 提取溫度對(duì)銀葉金合歡葉多酚得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on polyphenols yield from Acacia podalyriifolia leaves

2.2 提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以丙酮體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時(shí)間（D）為影響因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，多酚提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表4。

表4 多酚提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiment for polyphenols extraction conditions optimization

由表4可知，影響銀葉金合歡葉多酚得率的4個(gè)因素的強(qiáng)弱順序?yàn)锽＞D＞C＞A，即料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度＞丙酮體積分?jǐn)?shù)。正交試驗(yàn)得到銀葉金合歡葉多酚提取工藝的最佳組合A2B3C2D2。即丙酮體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶25（g∶mL）、提取溫度為55 ℃和提取時(shí)間20 min。在此最佳提取工藝條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，獲得多酚得率為17.65%。

2.3 銀葉金合歡葉多酚的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 銀葉金合歡葉多酚對(duì)DPPH·的清除能力

由圖6可知，當(dāng)銀葉金合歡葉多酚和抗壞血酸（vitamin C，VC）溶液質(zhì)量濃度為0.2～0.4 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率逐漸增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)，多酚溶液對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到最高值，為91.06%，VC溶液對(duì)DPPH·的清除率為95.28%。結(jié)果表明，銀葉金合歡葉多酚對(duì)DPPH·具有一定清除能力。

圖6 銀葉金合歡葉多酚對(duì)DPPH·的清除能力Fig.6 Effect of polyphenols from Acacia podalyriifolia leaves on the scavenging capacity of DPPH·

2.3.2 銀葉金合歡葉多酚對(duì)·OH的清除能力

由圖7可知，當(dāng)VC溶液的質(zhì)量濃度為0.5～1.5 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除能力上升最快；當(dāng)VC溶液的質(zhì)量濃度＞1.5 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除能力的變化趨勢(shì)趨于平穩(wěn)；當(dāng)銀葉金合歡葉多酚質(zhì)量濃度為0.5～2.5 mg/mL時(shí)，其對(duì)·OH的清除率逐漸上升，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，其對(duì)·OH的清除率達(dá)到最高值，為89.27%。表明銀葉金合歡葉多酚對(duì)·OH具有一定的清除能力。

圖7 銀葉金合歡葉多酚對(duì)·OH的清除能力Fig.7 Effect of polyphenols from Acacia podalyriifolia leaves on the scavenging capacity of·OH

2.3.3 銀葉金合歡葉多酚對(duì)NO·的清除能力

由圖8可知，隨著兩種溶液的質(zhì)量濃度在0.25～1.25 mg/mL的范圍內(nèi)增加，其對(duì)NO·清除能力逐漸增加；當(dāng)兩種溶液質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時(shí)，其對(duì)NO·的清除能力均達(dá)到最大值，銀葉金合歡葉多酚對(duì)NO·的清除率達(dá)57.51%，VC溶液對(duì)NO·的清除率達(dá)73.33%。結(jié)果表明，銀葉金合歡葉多酚對(duì)NO·具有一定的清除能力。

圖8 銀葉金合歡葉多酚對(duì)NO·的清除能力Fig.8 Effect of polyphenols from Acacia podalyriifolia leaves on the scavenging capacity of NO·

3 結(jié)論

本研究采用超聲輔助提取法確定銀葉金合歡葉多酚的最佳提取工藝條件為丙酮體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶25（g∶mL）、提取溫度55 ℃、提取時(shí)間20 min。在此優(yōu)化條件下，銀葉金合歡葉多酚得率為17.65%。銀葉金合歡葉多酚具有較好的抗氧化性，其對(duì)DPPH·、·OH及NO·的清除率分別為91.06%、89.27%和57.51%，清除效果較好。因此，銀葉金合歡葉在抗氧化功能食品和藥品研發(fā)方面具備很好應(yīng)用價(jià)值。后續(xù)會(huì)對(duì)銀葉金合歡葉的其他活性成分進(jìn)行提取以及對(duì)多酚成分進(jìn)行分離鑒定，探究各有效成分與抗氧化活性的關(guān)系，為后續(xù)銀葉金合歡多酚作為天然食品及藥品添加劑的具體應(yīng)用提供基礎(chǔ)和依據(jù)。