多菌混合發(fā)酵豆豉后發(fā)酵工藝優(yōu)化及品質(zhì)分析

牛 剛，朱仁萍，陳中愛，3，魏美娟，朱仁俊，胡永金，薛橋麗*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省昭通市食品藥品檢驗(yàn)所，云南 昭通 657000；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品加工研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 編輯部，云南 昆明 650201）

豆豉是以黃豆或黑豆為原料，經(jīng)各種微生物的發(fā)酵形成的具有特殊色、香、味的傳統(tǒng)調(diào)味副食品，因其獨(dú)特的香氣和味道以及其兼具功能性和營(yíng)養(yǎng)性而深受消費(fèi)者喜愛[1]。根據(jù)發(fā)酵時(shí)主導(dǎo)微生物的不同可分為曲霉型豆豉、毛霉型豆豉、細(xì)菌型豆豉和根霉型豆豉四大類[2]。

傳統(tǒng)的發(fā)酵豆豉主要是利用天然存在于生大豆或空氣中的微生物制作的，如霉菌、酵母和細(xì)菌。廣泛的微生物參與發(fā)酵，有助于在豆豉發(fā)酵過程中形成代謝物。自然發(fā)酵或是采用半開放式制曲發(fā)酵受外界環(huán)境因素影響較大，易受雜菌污染，使豆豉品質(zhì)難以控制，并且存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)程度底等問題[3]。在豆豉發(fā)酵過程中微生物群落是豆豉品質(zhì)形成的關(guān)鍵。研究表明，控制發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌種可以明顯縮短周期，提高品質(zhì)[4-5]。目前，人工可控共存微生物發(fā)酵已被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化豆豉產(chǎn)品的方法之一[6]。純種發(fā)酵的豆豉風(fēng)味遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如傳統(tǒng)豆豉，李響等[7]研究表明，使用細(xì)菌和霉菌混合發(fā)酵可有效提高大豆發(fā)酵制品的品質(zhì)特性?；炀l(fā)酵可以模擬傳統(tǒng)自然發(fā)酵過程中多菌協(xié)同作用的特點(diǎn)，有助于提升風(fēng)味物質(zhì)豐度及降低發(fā)酵過程控制難度，是提高豆豉風(fēng)味品質(zhì)和實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)的重要途徑[8]。

在發(fā)酵過程中，微生物通過不同的酶活性降解大豆中大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類，提供氨基酸、糖和脂肪酸的底物池，這些底物可以參與進(jìn)一步的生物和化學(xué)反應(yīng)，從而產(chǎn)生特有的味道和氣味[9]。制曲當(dāng)中產(chǎn)生的蛋白酶在發(fā)酵過程中能分解大豆中的蛋白質(zhì)，形成氨基酸，賦予豆豉固有的鮮味[10]。本研究從自然發(fā)酵豆豉中篩選出的3株高產(chǎn)蛋白酶菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、卡利比克邁耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）、溜曲霉（Aspergillus tamarii）混合發(fā)酵豆豉，采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其后發(fā)酵階段工藝條件，并對(duì)其理化、微生物指標(biāo)及酶活力進(jìn)行分析。以期為闡明混菌發(fā)酵豆豉發(fā)酵工藝條件及品質(zhì)形成機(jī)理提供一定的參考，為進(jìn)一步縮短豆豉發(fā)酵周期和提高豆豉品質(zhì)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、卡利比克邁耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）、溜曲霉（Aspergillus tamarii）：分離自楚雄傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉；黃豆、香辛料：市售；小麥粉：云南裕隆盛農(nóng)業(yè)科技有限公司；食鹽：云南省鹽業(yè)有限公司；福林酚：上海如吉生物科技有限公司；無(wú)水碳酸鈉：濟(jì)寧博誠(chéng)化工有限公司；氯化鈉、葡萄糖、三氯乙酸、氫氧化鈉：四川西隴科學(xué)有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖水、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；YXQLS-70A高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；V-5600紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；DHP-9082B恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ST3100 pH計(jì)：奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；SHA-F振蕩器：常州中貝儀器制造有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MLKRO200R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Heidolph公司；HS153鹵素水分測(cè)定儀：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 豆豉加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：挑選顆粒飽滿的大豆以豆水比為1∶8加入飲用水于室溫條件下浸泡6 h，瀝干水分后得到吸水后呈現(xiàn)脆性狀態(tài)的浸泡大豆，隨后將其裝入高溫高壓蒸煮袋密封并置于高溫高壓蒸煮鍋中，調(diào)整溫度為121 ℃蒸煮30 min，即可得到蒸熟大豆。將蒸熟大豆于無(wú)菌條件下冷卻，隨后按蒸熟大豆質(zhì)量6.0%比例加入小麥粉并混勻。以Aspergillus tamarii（1×106CFU/mL）：Bacillus subtilis（1×107CFU/mL）：Meyerozyma caribbica（1×107CFU/mL）菌懸液的體積比為3∶1∶2，按0.60%接種量接種于蒸熟大豆及小麥粉混合物中進(jìn)行制曲，制曲階段溫度為33 ℃，相對(duì)濕度為86%，時(shí)間為3 d，在制曲過程中每12 h取出于無(wú)菌操作臺(tái)進(jìn)行翻曲，將結(jié)塊豉曲分散以使得制曲更均勻，制曲完成用80 ℃熱水冷卻后洗曲，入缸進(jìn)行后發(fā)酵階段，后發(fā)酵過程以物料及食鹽水比為1∶1加入鹽水（7%）置于恒溫恒濕發(fā)酵箱進(jìn)行固液發(fā)酵，缸口用無(wú)菌紗布覆蓋，發(fā)酵11 d后以豆豉質(zhì)量5.0%比例添加辣椒粉、花椒粉4.0%、茴香粉1.0%、大蒜油2.0%拌勻即可制得豆豉成品。

取樣方法：其中樣品編號(hào)S0為蒸熟大豆，S1為制曲1 d的樣品，S2為制曲完成的樣品，S3為洗曲并添加食鹽水進(jìn)入后發(fā)酵2 d的樣品（總發(fā)酵時(shí)間5 d），S4為后發(fā)酵5 d的樣品（總發(fā)酵時(shí)間8 d），S5為后發(fā)酵8 d的樣品（總發(fā)酵時(shí)間11 d），取這6個(gè)階段樣品進(jìn)行分析。

1.3.2 豆豉后發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

在豆豉加工工藝的基礎(chǔ)上，分別考察發(fā)酵溫度（24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃）、食鹽添加量（3%、6%、9%、12%、15%）、發(fā)酵時(shí)間（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d）對(duì)感官評(píng)分和氨基酸態(tài)氮含量的影響，對(duì)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3 豆豉后發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以食鹽添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為自變量，以感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)分析，豆豉后發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 豆豉后發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for process optimization of Douchi post-fermentation

1.3.4 分析檢測(cè)

水分含量的測(cè)定：采用HS153鹵素水分測(cè)定儀；pH值的測(cè)定：采用pH計(jì)；總糖和還原糖的測(cè)定：采用3,5-二硝基水楊酸比色法[11]；蛋白酶活力的測(cè)定：參照GB/T 23527.1—2023《酶制劑質(zhì)量要求第1部分：蛋白酶制劑》；淀粉酶活力：參照GB/T 24401—2009《α-淀粉酶制劑》；總酸和氨基酸態(tài)氮：參照GB 5009.235—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》；L*值、a*值、b*值的測(cè)定：采用色差儀[12]；游離氨基酸的測(cè)定：采用全自動(dòng)氨基酸分析儀；菌落總數(shù)測(cè)定：參照GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》；霉菌、酵母菌總數(shù)測(cè)定：參照GB 4789.15—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》；乳酸菌總數(shù)的測(cè)定：參照GB 4789.35—2023《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》。

1.3.4 感官評(píng)價(jià)

依據(jù)GB/T 29605—2013《感官分析食品感官質(zhì)量控制導(dǎo)則》結(jié)合參考文獻(xiàn)制作豆豉感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，邀請(qǐng)10名經(jīng)過感官培訓(xùn)人員從形態(tài)、滋味、色澤和香氣4個(gè)方面對(duì)豆豉進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，滿分為100分，豆豉感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 豆豉感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory score standards of Douchi

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019、Origin 2022、GraphPad Prism 8等統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及顯著性分析并作圖；采用Design-Expert 10.0.3設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 后發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對(duì)氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響見圖1。由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為24～36 ℃時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵溫度為36 ℃時(shí)，感官評(píng)分及氨基酸態(tài)氮含量均達(dá)到最高值，分別為78.30分、0.764 g/100 g；當(dāng)發(fā)酵溫度高于36 ℃后，氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分逐漸降低。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為36 ℃。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)豆豉氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on amino acid nitrogen contents and sensory score of Douchi

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間的確定

由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為2～10 d時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量增加；隨著發(fā)酵時(shí)間在2～6 d的增加，感官評(píng)分逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為6 d時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值，為76.70分，此時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量為0.777 g/100 g；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞6 d時(shí)，感官評(píng)分逐漸下降。因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為6 d。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)豆豉氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of fermentation time on amino acid nitrogen contents and sensory score of Douchi

2.1.3 食鹽添加量的確定

食鹽添加量對(duì)感官評(píng)分的影響見圖3。由圖3可知，食鹽添加量為3%～6%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分均逐漸增加；當(dāng)食鹽添加量為6%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分均為最高值，分別為0.718 g/100 g、80.70分；當(dāng)食鹽添加量＞6%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分均逐漸降低。因此，確定最佳食鹽添加量為6%。

圖3 食鹽添加量對(duì)豆豉氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of salt addition on amino acid nitrogen contents and sensory score of Douchi

2.2 后發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以食鹽添加量（A），發(fā)酵溫度（B），發(fā)酵時(shí)間（C）為自變量，以感官評(píng)分（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Design-Expert 10.0.3軟件進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定豆豉后發(fā)酵工藝的最佳工藝參數(shù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，回歸模型方差分析結(jié)果見表4。

表3 豆豉后發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for process optimization of Douchi post-fermentation

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

通過響應(yīng)面分析法分析后，得到感官評(píng)分與各因素變量的二次方程模型為：

由表4可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)P值為0.484 1，不顯著（P＞0.05），回歸方程的決定系數(shù)R2=0.957 2，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.902 1，說明該模型擬合程度良好；由P值可知，一次項(xiàng)B、二次項(xiàng)A2和B2對(duì)結(jié)果影響均為極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)A、交互項(xiàng)AB、二次項(xiàng)C2對(duì)結(jié)果影響均顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)不顯著（P＞0.05）。由F值可知，3個(gè)因素對(duì)感官評(píng)分的影響次序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞食鹽添加量＞發(fā)酵時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

在響應(yīng)面圖中響應(yīng)曲線越陡峭，等高線呈橢圓形說明研究因素之間的交互作用顯著（P＜0.05），響應(yīng)曲線越平緩，等高線呈圓形則說明交互作用不顯著（P＞0.05）。各因素間交互作用對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面及等高線見圖4。由圖4可知，3個(gè)響應(yīng)因素在相對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)范圍內(nèi)都有響應(yīng)極值，其中，食鹽添加量（A）與發(fā)酵溫度（B）兩兩交互時(shí)，響應(yīng)曲面陡峭，等高線圖呈橢圓形，對(duì)感官評(píng)分影響顯著（P＜0.05），這與方差分析結(jié)果一致。

圖4 各因素間交互作用對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on sensory score

通過響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析，當(dāng)食鹽添加量為7.26%、發(fā)酵溫度為33 ℃、發(fā)酵時(shí)間為8.24 d時(shí)，感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為89.38分。考慮到實(shí)際情況，將后發(fā)酵工藝條件修正為食鹽添加量7%，發(fā)酵溫度33 ℃，發(fā)酵時(shí)間8 d。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)試驗(yàn)3次，感官評(píng)分實(shí)際值為86.33分，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差較小，說明該模型準(zhǔn)確可靠。

2.3 豆豉發(fā)酵過程中理化成分分析

2.3.1 豆豉發(fā)酵過程中水分、總酸、pH、還原糖、總糖含量變化

豆豉發(fā)酵過程中水分、總酸和pH、還原糖和總糖含量的變化見圖5。

圖5 發(fā)酵過程中水分（A）、總酸和pH（B）、還原糖和總糖含量（C）變化Fig.5 Changes in moisture (A), total acid and pH (B), reducing sugar and total sugar contents (C) during fermentation process

由圖5A可知，S0～S2階段的水分含量逐漸下降；樣品S2的水分含量為45.28%，該時(shí)期可能由于微生物急劇生長(zhǎng)需要吸收利用水分導(dǎo)致水分含量下降；S2～S3階段，水分含量上升至63.35%，洗曲明顯增加了豆豉的水分含量；S3～S5階段，樣品的水分含量下降；發(fā)酵完成時(shí)，樣品S5的水分含量為23.76%。

由圖5B可知，發(fā)酵過程中，pH值與總酸含量（以乳酸計(jì)）變化恰好相反，S0～S1階段，樣品的pH值下降，總酸含量上升；S1～S4階段，樣品的pH值上升，總酸含量下降；S4～S5階段，樣品的pH值有所下降，總酸含量有所上升；樣品S5的pH值為7.48，總酸含量為0.22 g/100 g。

由圖5C可知，S0～S5階段，還原糖含量和總糖含量下降；樣品S5總糖含量為5.40 g/100 g，還原糖含量為2.17 g/100 g。制曲及發(fā)酵階段顯著降低還原糖和總糖含量（P＜0.05）。研究結(jié)果表明，豆豉還原糖和總糖含量隨著發(fā)酵進(jìn)行降低，本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果一致[15-16]。

2.3.2 發(fā)酵過程中顏色參數(shù)的變化

豆豉發(fā)酵過程中顏色參數(shù)的變化見圖6。由圖6可知，S0～S2階段，樣品的的L*值、a*值、b*值均呈下降趨勢(shì)，即亮度、紅度值和黃度值下降，而在S2～S3階段，豆豉的L*值、a*值、b*值均增加，即亮度、紅度值和黃度值上升；S3～S5階段，樣品的L*值、a*值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，而b*值呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵完成時(shí)，L*值、a*值、b*值分別為65.03、6.10、19.83。結(jié)果表明，發(fā)酵能明顯改變大豆色澤，索化夷等[12]對(duì)發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)達(dá)200 d左右的永川豆豉進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其顏色向黑色轉(zhuǎn)化，最終呈現(xiàn)黑色，并且分析發(fā)現(xiàn)豆豉L*值變化與其氨基酸態(tài)氮含量呈負(fù)相關(guān)。

圖6 發(fā)酵過程中顏色參數(shù)的變化Fig.6 Changes in color parameters

2.3.3 發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化

發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化見圖7。由圖7可知，S0～S2階段，氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加；S2～S3階段，氨基酸態(tài)氮含量逐漸下降，可能是由于洗曲后大量小分子物質(zhì)流失溶于水流失而導(dǎo)致的[18-19]。S3～S5階段，氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量為0.77 g/100 g，與周鑫等[17]對(duì)不同廠家豆豉測(cè)定的氨基酸態(tài)氮含量相比，其含量較高。因此，在發(fā)酵過程中應(yīng)優(yōu)化洗曲這一過程，從而保證發(fā)酵對(duì)原料營(yíng)養(yǎng)成分最大限度的保留，從而提高豆豉品質(zhì)。

圖7 發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化Fig.7 Changes in amino acid nitrogen content during fermentation process

2.3.4 發(fā)酵過程中游離氨基酸含量變化

游離氨基酸是豆豉發(fā)酵過程中滋味和風(fēng)味的重要前體物質(zhì)，是衡量豆豉風(fēng)味的一個(gè)重要指標(biāo)[20]。豆豉發(fā)酵過程中17種游離氨基酸的含量變化見表5。

表5 發(fā)酵過程中17種游離氨基酸的含量變化Table 5 Changes in the 17 free amino acids content during fermentation process

由表5可知，在發(fā)酵的不同階段，豆豉中的游離氨基酸種類沒有變化，均為17種。蒸熟大豆（S0）中17種游離氨基酸總含量為0.274 mg/g，其中精氨酸含量最高，為0.094 mg/g，其次為谷氨酸和組氨酸，其含量分別為0.031 mg/g、0.023 mg/g，其他氨基酸雖然都有檢出，但含量較少。樣品S1谷氨酸含量由0.031 mg/g升高至1.053 mg/g，而精氨酸含量則增長(zhǎng)至0.554 mg/g，亮氨酸含量由0.007 mg/g增長(zhǎng)至0.465 mg/g，這3種氨基酸含量增長(zhǎng)幅度較大，并且在該階段其余的氨基酸含量均出現(xiàn)不同程度的增加，此階段17種游離氨基酸總含量增長(zhǎng)最快，由0.274 mg/g增長(zhǎng)至4.978 mg/g。制曲完成（S2）17種游離氨基酸含量都達(dá)到最大值，其中，谷氨酸含量最高，為1.944 mg/g。由此可見制曲階段是游離氨基酸產(chǎn)生的關(guān)鍵時(shí)間，含量提升最多。在S2～S3階段，游離氨基酸出現(xiàn)了明顯的下降，總游離氨基酸降低至0.578 mg/g，并且在S3～S4階段依舊持續(xù)下降，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)（S5）出現(xiàn)小幅度的上升，最終總游離氨基酸含量為0.319 mg/g，相比較蒸熟大豆含量有所提高，分析其原因可能是因?yàn)橛写罅克苄杂坞x氨基酸在洗曲后溶于水而流失，并且有研究表明，食鹽的加入會(huì)導(dǎo)致微生物對(duì)蛋白質(zhì)的降解能力減弱，對(duì)蛋白酶產(chǎn)生抑制作用，從而導(dǎo)致游離氨基酸的含量降低[21]。在豆豉發(fā)酵過程中17種游離氨基酸含量變化趨勢(shì)與梁如等[22]的研究一致，但含量存在一定差異，分析原因可能為發(fā)酵所用菌種及工藝條件不同所致。后發(fā)酵過程中游離氨基酸含量相比較制曲完成時(shí)出現(xiàn)較大程度下降，但豆豉的氣味、質(zhì)地和色澤都得到了較大的提升。

2.4 發(fā)酵過程中豆豉微生物動(dòng)態(tài)變化

發(fā)酵本就是利用微生物將大分子物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為更利于人體消化吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)過微生物的分解利用，進(jìn)一步提高原料的營(yíng)養(yǎng)性與功能性[23]。所以在發(fā)酵過程中微生物具有主導(dǎo)作用，分析發(fā)酵過程中微生物指標(biāo)的變化，結(jié)果見圖8。

圖8 發(fā)酵過程中微生物總數(shù)變化Fig.8 Changes in total number of microorganisms during fermentation process

由圖8可知，S0～S2階段，細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌總數(shù)、霉菌總數(shù)及酵母菌總數(shù)對(duì)數(shù)值均增加；樣品S2微生物數(shù)量均達(dá)到最大值，此時(shí)，細(xì)菌總數(shù)對(duì)數(shù)值為7.69，乳酸菌總數(shù)對(duì)數(shù)值為2.47，霉菌總數(shù)對(duì)數(shù)值為8.29，酵母菌總數(shù)對(duì)數(shù)值為7.81。S2～S3階段，細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌總數(shù)、霉菌總數(shù)及酵母菌總數(shù)對(duì)數(shù)值都急速降低，一般而言，霉菌型豆豉都需要經(jīng)過洗曲這一步驟，洗曲是用溫度高于85 ℃的熱水冷卻后用來(lái)沖洗制曲完成的豆粒表面的菌絲，可以使發(fā)酵豆豉呈現(xiàn)更好的色澤，并且減少霉菌發(fā)酵具有的苦味[24]。S3～S5階段，除乳酸菌總數(shù)對(duì)數(shù)值逐漸下降，其他微生物菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值下降至最低，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌總數(shù)、霉菌總數(shù)及酵母菌總數(shù)對(duì)數(shù)值分別為3.13、0.97、3.44、2.12。其原因可能是，該階段豆豉已經(jīng)成熟，水分含量較低，大多數(shù)微生物因?yàn)槿彼罅克劳鰪亩咕淇倲?shù)出現(xiàn)下降[25]。

2.5 不同發(fā)酵階段酶活力變化

發(fā)酵過程中蛋白酶和淀粉酶活力變化見圖9。由圖9可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中，蛋白酶與淀粉酶活力變化情況一致。蛋白酶與淀粉酶活力均在制曲階段（S0～S2）出現(xiàn)較快增長(zhǎng)，與微生物總數(shù)的急劇升高趨勢(shì)一致，酶活力的升高可加快對(duì)原料大分子物質(zhì)的分解，為后發(fā)酵過程提供反應(yīng)底物[26-27]；樣品S2的蛋白酶與淀粉酶活力均達(dá)到最大值，分別為590 U/100g，24 U/100 g；在S3～S4階段，蛋白酶與淀粉酶活力均呈下降趨勢(shì)；在S4～S5階段，蛋白酶與淀粉酶活力有所提高，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，蛋白酶與淀粉酶活力分別為322 U/100 g、13 U/100 g。與蘭光群[28]采用兩株菌混合發(fā)酵納豆所產(chǎn)生的中性蛋白酶活力相比（其蛋白酶活力為88.78 U/g）較高。

圖9 發(fā)酵過程中蛋白酶和淀粉酶活力變化Fig.9 Changes in protease and amylase activities during fermentation process

3 結(jié)論

豆豉后發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝條件為：食鹽添加量7%，發(fā)酵溫度33 ℃，發(fā)酵時(shí)間8 d。在該優(yōu)化條件下，發(fā)酵所得豆豉感官評(píng)分為86.33分。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，豆豉水分含量為23.76%；還原糖、總糖以及總酸含量也出現(xiàn)了降低，分別為2.13 g/100 g、5.40 g/100 g、0.22 g/100 g；總游離氨基酸含量為0.319 g/100 g，氨基酸態(tài)氮含量為0.77 g/100 g。本研究對(duì)混合菌株接種發(fā)酵制備快速發(fā)酵豆豉具有一定意義，有助于解決傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉半開放式制曲帶來(lái)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，未來(lái)還可以進(jìn)行多菌種發(fā)酵劑研制，提高發(fā)酵豆豉的品質(zhì)。