具有抑菌作用的鏈球菌分離鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

陳心萍，胡春容，藍 夢，薛楚恩，張明歡，黃櫪嬌，何海燕，3，4，5，覃擁靈，3，4，5*

（1.河池學院 化學與生物工程學院，廣西 河池 546300；2.康泰生物制品股份有限公司，廣東 深圳 518000；3.河池學院 化學與生物工程學院 微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室，廣西 河池 546300；4.河池學院 化學與生物工程學院 廣西蠶桑生態(tài)學與智能化技術應用重點實驗室，廣西 河池 546300；5.河池學院 化學與生物工程學院 廣西現(xiàn)代蠶桑絲綢協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 河池 546300）

生物防治技術是減少真菌及其毒素污染的最有前途和最有效的方法[1]，其中利用具有抑菌活性的微生物來抑制食品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)原料生產和儲藏過程中微生物的污染，從源頭控制產毒微生物的增殖，是最大程度的減少真菌及毒素危害的有效途徑[2]。動物飼料中添加抗生素會給環(huán)境和人類健康帶來無法過量的危害，為了人類食品安全，我國《飼料和飼料添加劑管理條例》規(guī)定從2020年起飼料中全面禁止添加抗生素，尋找合適的抗生素替代品對飼料工業(yè)至關重要[3]。發(fā)酵飼料是指飼料原料中添加具有抑菌活性的微生物品種，飼料原料經過微生物發(fā)酵處理后，可有效增加營養(yǎng)價值，發(fā)酵飼料中添加具有抑菌活性的微生物可以抑制動物腸道內的有害微生物的繁殖與生產，起到替代抗生素的效果[4]。在飼料中添加具有抑菌活性的微生物菌種，可以提高動物免疫力，改善動物腸道菌群、促進動物生長[5-6]。

當前可用于發(fā)酵飼料的微生物種類主要包括真菌和細菌兩類[7]。細菌是重要的工業(yè)用菌種，其中發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentans）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）也可用于發(fā)酵飼料[8-9]。酵母菌（yeast）屬于真菌，廣泛添加在動物飼料劑中[10]。芽孢桿菌（Bacillus）通過發(fā)酵可產生纖維素酶、脂肪酶和淀粉酶等酶活較高的酶，也被用于發(fā)酵飼料[11-12]。放線菌是生產抗生素的主要菌種，在飼料、醫(yī)藥、食品等行業(yè)具有廣泛應用[13]。天然生物防腐劑在抑制食品微生物生長的同時，又不會影響食品的營養(yǎng)和品質特性，防止化學防腐劑的污染，安全有效的延長食品的保質期[14]。對天然生物防腐劑在食品中的應用，也成為了研究熱點[15]。因此菌種的合理選擇是提高發(fā)酵效率的關鍵，也是發(fā)酵飼料品質的前提與關鍵[16]。因此有必要篩選在飼料中添加的具有抑菌作用的菌株。

本研究開展對致病菌具有較好抑菌作用的菌株篩選工作，并通過形態(tài)特征及生理生化特征觀察，結合分子生物學對菌株進行鑒定。曲霉是飼料中常見的微生物污染物，本研究利用米曲霉（Aspergillus oryzae）作為指示菌種，利用單因素試驗及正交試驗設計優(yōu)化菌種產抑菌物質的發(fā)酵條件，旨在分離篩選出能在飼料中添加的具有抑菌作用的菌種，以替代抗生素在飼料中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 指示菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）：保存于河池學院微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基

高氏一號培養(yǎng)基[17]（用于放線菌培養(yǎng)）：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O0.01g、瓊脂20g，pH值7.4～7.6，蒸餾水1000mL。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[19]（用于真菌培養(yǎng)）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[17]（用于細菌培養(yǎng)）：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基[18]（用于大腸桿菌培養(yǎng)）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7。

發(fā)酵培養(yǎng)基[19]：NaCl0.2g，葡萄糖1.0g，可溶性淀粉5.0 g，MgSO40.5 g，K2HPO40.5 g，玉米粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

察氏培養(yǎng)基[20]：0.05% MgSO4·7H2O、0.2% NaNO3、2%瓊脂粉、0.05%KCl、0.1%K2HPO4、3%蔗糖、0.01%FeSO4·7H2O、蒸餾水1 000 mL。

淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基[21]：（NH4）2SO42.0 g，CaCO33.0 g，K2HPO41.0 g，可溶性淀粉10.0 g，MgSO47H2O 1.0 g，NaCl 1.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL。

Emerson培養(yǎng)基[22]：葡萄糖20 g，牛肉膏4.0 g，NaCl 2.5 g，酵母膏10.0 g，蛋白胨4.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

以上培養(yǎng)基均于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑

氯化鈉、磷酸二氫鉀、可溶性淀粉、硫酸鎂、七水硫酸鎂、葡萄糖（均為分析純）、蛋白胨（生化試劑）：天津光復精細化工研究所；酵母膏（生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂（生化試劑）：上海潤捷化學制劑有限公司；七水硫酸鐵、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；重鉻酸鉀（分析純）：汕頭市西隴化工有限公司；牛肉膏（生化試劑）：北京奧博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BX51顯微鏡：日本奧林巴斯公司；Infinite M200PRO全波長酶標儀、PHS-3B型pH儀：上海精密科學儀器有限公司；AvantiJE落地式離心機、Microfuge 20R高速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特公司；ZXSD-A1160生化培養(yǎng)箱、ZWY-2102雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-IF超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；HVE-50高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；JM-B5107電子天平：余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司；G100M25 MSL-W1格蘭仕微波爐：廣東格蘭仕微波生活電器制造公司。

1.3 方法

1.3.1 土樣采集及預處理

土樣采集[23-24]：在廣西宜州的流河寨、會仙山、楓樹林等不同地點，采集離地面下5～15 cm處的土壤，每個不同地點分別采集3份土樣，共9份土樣。

土樣預處理：采集的土壤放于通風處自然風干，每份各100 g左右，放進烘箱120 ℃烘2 h，除去大部分雜菌[23-25]。

1.3.2 菌株分離與純化

稱取經過預處理的土樣10 g放入三角瓶中，加90 mL無菌水，參照徐麓凱等[26]的方法，分別制成10-3～10-6的稀釋液。向高氏一號培養(yǎng)基中加入質量濃度為50 μg/mL的K2Cr2O7，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，取0.1 mL稀釋度為10-4、10-5、10-6的稀釋液，涂布高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度28 ℃，時間7 d，待長出菌后，對單菌落進行反復平板劃線純化得到單菌落。

1.3.3 菌株的篩選[26]

將指示菌金黃色葡萄球菌、米曲霉、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌分別涂布接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基上，28 ℃進行活化培養(yǎng)2 d。將純化好的菌株接在平板上，置于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)7 d，待其生長好后，挑取7 mm×7 mm菌塊，接到帶有指示菌的平板上。于28 ℃培養(yǎng)1～2 d，觀察有無抑菌圈出現(xiàn)，采用游標卡尺測量抑菌圈直徑大小，抑菌圈直徑越大說明抑菌效果越強。

1.3.4 菌株的鑒定

（1）菌株形態(tài)學觀察

配制高氏一號培養(yǎng)基，經過滅菌后，在無菌環(huán)境下倒平板，平板凝固后，每皿接種培養(yǎng)好的目的菌株，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d，觀察菌株生長情況、革蘭氏染色情況以及菌株顯微形態(tài)[24，27-29]。

（2）生理生化鑒定

依據(jù)參考文獻[25-26]，完成吲哚試驗、V.P試驗、甲基紅試驗硫化氫產生試驗、淀粉水解試驗、接觸酶反應、碳源利用試驗、明膠液化試驗。

（3）分子生物學鑒定[30]

菌體總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提?。盒迈r培養(yǎng)的菌絲加入液氮，在研缽中充分研磨變成粉末，總DNA的提取參照MICHAELSON L V等[31]的方法進行。以菌株Ls2的基因組總DNA為模板，使用通用引物進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增內源轉錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）序列。PCR引物按WHITE T J等[32]報道設計，引物ITS1的序列：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，引物ITS4的序列：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR擴增體系為：10×ExTaqbuffer（TaKaRa Bio）5 μL，菌體總DNA2 ng，10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）1 μL，20 μmol/L的ITS1引物和ITS4引物各0.5 μL，ExTaqTM聚合酶（TaKaRa Bio）2 μL，加去離子水補足至50 μL。PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性50 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，回收純化PCR產物，對ITS基因片段測序，將測序結果登錄美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站用GenBank數(shù)據(jù)庫基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比較。檢索得到的同源性較高的序列，使用MEGA 5.0軟件鄰位連接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化[35]

（1）單因素試驗

設置基礎培養(yǎng)條件為2.0%玉米粉、發(fā)酵溫度27 ℃、發(fā)酵時間8 d、初始pH 7、裝液量100 mL/250 mL、培養(yǎng)轉速200 r/min，通過改變單一變量在不同發(fā)酵條件下培養(yǎng)，考察2.0%氮源（酵母膏、玉米粉、黃豆餅粉、蛋白胨）、發(fā)酵時間（2d、5d、8d、11 d、14d）、發(fā)酵溫度（21℃、24℃、27℃、30℃、33 ℃）、初始pH（5、6、7、8、9）、裝液量（50 mL/250 mL、75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL、150 mL/250 mL）、轉速（160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min、240 r/min）等不同發(fā)酵條件下對米曲霉的抑菌圈直徑大小的影響。

（2）正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇對試驗結果影響較大的因素，利用正交設計助手Ⅱv3.1，設計3因素3水平的正交試驗L9（34）并進行數(shù)據(jù)分析，對菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，正交試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.6 數(shù)據(jù)與分析

單因素試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016繪圖，正交試驗利用正交設計助手Ⅱv3.1進行直觀分析和方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株分離篩選結果

從廣西宜州的流河寨、會仙山、楓樹林等地方共采集9份土樣，通過平板法篩選出對4種指示菌具有明顯抑菌作用的3株菌，分別命名為Ls2、Hw3、Fh7，對這3株菌的抑菌作用進行測定，結果見表2。

由表2可知，3株菌對金黃色葡萄球菌的抑制效果最弱，而對其他3種病原菌的抑制效果較強。其中菌株Ls2對4種指示菌的抑菌圈較大，其發(fā)酵上清液對米曲霉生成的抑菌圈直徑為30.12 mm，是3株菌中抑菌效果最好的，對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌也有抑菌作用，抑菌直徑分別為23.92 mm，22.68 mm和18.13 mm，因此選擇菌株Ls2開展試驗，該菌株對金黃色葡萄球菌的抑制效果最弱，對米曲霉的抑菌圈的直徑最大，因此后續(xù)選擇對米曲霉的抑菌圈直徑為評價指標。

2.2 菌株Ls2鑒定結果

2.2.1 形態(tài)學觀察結果

菌株Ls2在高氏一號培養(yǎng)基上觀察結果見圖1。由圖1可知，表面生長緊密，呈乳白色、菌落比較干燥、表面粗糙、邊緣整齊、微隆起，有色素產生。經革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽性菌。在光學顯微鏡下，菌體呈菌絲狀，氣生菌絲豐富，且不易斷裂。

圖1 菌株Ls2的菌落（a）和菌絲（b）形態(tài)Fig.1 Colony (a) and mycelium (b) morphology of strain Ls2

2.2.2 菌株Ls2的生理生化試驗結果

菌株Ls2的生理生化試驗結果見表3。由表3可知，甲基紅試驗接觸酶實驗、明膠液化試驗結果為陽性，能夠利用麥芽糖、甘露醇、葡萄糖、可溶性淀粉。吲哚試驗無紅色現(xiàn)象出現(xiàn)，菌株不能產生硫化氫和淀粉酶。根據(jù)培養(yǎng)特征、形態(tài)特征、生理生化試驗判斷該菌為鏈霉菌類的球孢類群[36]。

表3 菌株Ls2的生理生化鑒定及碳源利用結果Table 3 Results of physiological and biochemical identification and carbon source utilization of strain Ls2

2.2.3 菌株Ls2的分子生物學鑒定

以菌株Ls2的基因組總DNA為模板，使用通用引物進行PCR擴增，得到約1 388 bp的PCR產物片段。將測序結果結果提交至NCBI網(wǎng)站BLAST比對，下載序列相近的菌種，通過Mega7軟件采用鄰近法構建菌株Ls2的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。由圖2系統(tǒng)進化樹表明，菌株Ls2和青藍鏈霉菌（Streptomyces caeruleus）在處于同一分支，同源性為92%。依據(jù)培養(yǎng)特征、形態(tài)特征、生理生化試驗及分子生物學鑒定，確定菌株Ls2為青藍鏈霉菌（Streptomyces caeruleus）。

圖2 基于ITS基因序列菌株Ls2的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain Ls2 based on ITS gene sequence

2.3 菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.3.1 不同氮源對菌株Ls2發(fā)酵產抑菌物質的影響

考察2%添加量的不同氮源對發(fā)酵液抑菌作用的影響，結果見圖3。由圖3可知，以黃豆餅粉作為氮源時，菌株產對米曲霉的抑菌活性物質最多，發(fā)酵效果最好，對米曲霉的抑菌圈直徑達到最大，為32.56 mm，玉米粉次之，蛋白胨和酵母膏抑菌作用較差。因此選擇最佳氮源為2%黃豆餅粉。

圖3 不同的氮源對發(fā)酵液抑菌作用的影響Fig.3 Effect of different nitrogen source on bacteriostasis of fermentation broth

2.3.2 不同發(fā)酵時間對菌株Ls2發(fā)酵產抑菌物質的影響

發(fā)酵時間對菌株產抑菌物質的影響見圖4。由圖4可知，菌株Ls2第1天沒有抑菌活力，在發(fā)酵第2天開始具有抑菌活力，隨著發(fā)酵時間增加，抑菌能力逐步加強，發(fā)酵到第5天菌株抑菌能力最強，對米曲霉的抑菌圈直徑為33.12 mm。5 d后抑菌能力開始有較明顯的下降趨勢，在11 d后趨于平緩。培養(yǎng)時間長碳源、氮源等營養(yǎng)物質消耗多，營養(yǎng)物質缺乏影響菌體生長，導致抑菌活性物質減少。因此，最佳發(fā)酵時間為5 d。

圖4 發(fā)酵時間對發(fā)酵液抑菌作用的影響Fig.4 Effect of fermentation time on bacteriostasis of fermentation broth

2.3.3 不同發(fā)酵溫度對菌株Ls2發(fā)酵產抑菌物質的影響

發(fā)酵溫度對菌株Ls2產抑菌物質的影響結果見圖5。由圖5可知，發(fā)酵溫度21～27 ℃時，會延長菌體發(fā)酵時間，菌種生長受到影響，嚴重影響到發(fā)酵的效率，從而對抑菌物質的合成有一定的影響；隨發(fā)酵溫度增高，菌種生長逐漸變好，發(fā)酵溫度為30 ℃時，菌種生長良好，抑菌能力最強，抑菌圈直徑為31.08 mm；發(fā)酵溫度超過30 ℃時，會導致微生物體內的酶失活，對菌種生長有不良影響，導致抑菌物質合成的產量降低或改變其抑菌性能，隨著溫度的升高，抑菌能力明顯降低[37]。因此，最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液抑菌作用的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on bacteriostasis of fermentation broth

2.3.4 不同初始pH值對菌株Ls2發(fā)酵產抑菌物質的影響

初始pH值對菌株Ls2產抑菌物質的影響結果見圖6。由圖6可知，如果發(fā)酵液初始pH值＞7，發(fā)酵液整體的內環(huán)境呈堿性，降低了菌株Ls2對營養(yǎng)物質的吸收及利用率，pH值過大或過小，生產的抑菌物質越少，導致菌體多種酶的活性降低，從而影響菌體的生長狀況，導致產生的抑菌物質降低[37]。當pH為7時菌種生長良好，所產發(fā)酵液抑菌能力最好，抑菌圈直徑最大，達到32.13 mm。因此，發(fā)酵液最佳初始pH值為7。

圖6 初始pH值對發(fā)酵液抑菌作用的影響Fig.6 Effect of initial pH on bacteriostasis of fermentation broth

2.3.5 不同裝液量對Ls2菌株發(fā)酵產抑菌物質的影響

不同裝液量對菌株Ls2發(fā)酵產抑菌物質的影響見圖7。由圖7可知，隨著裝液量的增加，抑菌圈直徑呈先上升后下降的趨勢，裝液量少時營養(yǎng)物質不足，將影響菌種生長及抑菌物質合成。當裝液量為125 mL/250 mL時，菌種將獲得較充足氧氣及生長飼料，菌種生長良好，所產發(fā)酵液抑菌能力最好，抑菌圈直徑為32.74 mm，如果裝液量超過125 mL/250 mL，導致氧氣供給不足，將影響菌種生長及抑菌物質合成。因此，最佳裝液量為125 mL/250 mL。

圖7 裝液量對發(fā)酵液抑菌作用的影響Fig.7 Effect of liquid loading volume on bacteriostasis of fermentation broth

2.3.6 不同轉速對菌株Ls2發(fā)酵產抑菌物質的影響

不同轉速對菌株Ls2發(fā)酵產抑菌抑菌物質的影響見圖8。由圖8可知，抑菌圈隨著轉速的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，轉速為220r/min時，提供氧氣較充足，菌株Ls2生長良好，發(fā)酵液抑菌能力最好，抑菌圈直徑為32.65 mm。如果轉速低于220 r/min，轉速慢，供氧不足，將影響菌種生長及抑菌物質合成。如果轉速高于220 r/min，過快轉速導致菌種破裂死亡，將影響菌種生長及抑菌物質合成。因此，菌株Ls2培養(yǎng)的最佳轉速為220 r/min。

圖8 轉速對發(fā)酵液抑菌作用的影響Fig.8 Effect of rotating speed on bacteriostasis of fermentation broth

2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，選擇影響結果比較大的發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始pH（C）為試驗因素，設置（D）為空白，以抑菌圈直徑為評價指標開展正交試驗，試驗結果及方差分析分別見表4和表5。

表4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表5 正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表4可知，RA＞RC＞RB，可以看出影響菌株發(fā)酵的3個因素中，對發(fā)酵影響的順序為發(fā)酵時間＞初始pH＞發(fā)酵溫度。A3B3C2為最優(yōu)發(fā)酵組合，即發(fā)酵時間為8 d，發(fā)酵溫度為33 ℃，初始pH為7在此條件下，發(fā)酵液抑菌圈直徑由優(yōu)化前的30.12 mm擴大到38.82 mm。

由表5可知，3個因素中發(fā)酵時間對抑菌效果的影響顯著（P＜0.05）。其余兩個因素對抑菌效果的影響未達到顯著水平（P＞0.05）。

3 結論

本文對宜州的流河寨采集的9份土樣進行篩選分離，分離篩選得到3株對4種病原菌的有抑制效果的菌株，分別命名為Ls2、Hw3、Fh7，3株菌對金黃色葡萄球菌的抑制效果最弱，而對其他3種病原菌的抑制效果較強，其中菌株Ls2對4種指示菌的抑菌圈較大。經過形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性觀察以及分子生物學鑒定，鑒定菌株Ls2為青藍鏈霉菌（Streptomyces caeruleus）。確定最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵培養(yǎng)基添加2%黃豆餅粉，發(fā)酵時間8 d，初始pH7，發(fā)酵溫度33 ℃，裝液量125 mL/250 mL，搖床轉速220 r/min。在此發(fā)酵條件下，菌株Ls2對米曲霉的抑菌圈直徑為38.82 mm，青藍鏈霉菌Ls2對一些致病菌具有較好抑菌效果，具有添加生產發(fā)酵飼料的潛能。