發(fā)酵豆制品中氨肽酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

李冬琪，程江華，萬婭瓊，尤逢惠，徐雅芫*

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省食品微生物發(fā)酵與功能應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031）

豆制品富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分[1]，蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量較大，不利于人體的消化吸收[2]，蛋白質(zhì)水解生成的小肽與游離氨基酸的溶解性、營養(yǎng)特性都明顯優(yōu)于蛋白質(zhì)本身[3]，容易被人體腸道細(xì)胞吸收并進(jìn)入循環(huán)[4]。蛋白質(zhì)的水解液對滋味的貢獻(xiàn)可分為鮮味、甜味、苦味和無味[5]，而其中大多數(shù)呈現(xiàn)苦味，究其原因是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)大分子酶解時，肽鏈中含有的疏水性氨基酸暴露出來，接觸味蕾，產(chǎn)生苦味[6]。苦味的產(chǎn)生限制了蛋白質(zhì)水解物的應(yīng)用，因此減少、阻止和去除蛋白質(zhì)水解物的苦味，就顯得尤為重要。氨肽酶（Aminopeptidase）是一種肽鏈外切蛋白酶，能夠從多肽鏈的氨基末端由外向內(nèi)依次切斷肽鍵，使氨基酸逐個游離出來形成小肽和游離氨基酸，更利于人體吸收，增加了發(fā)酵食品的風(fēng)味[7]，且其可切除苦味肽氨端的疏水氨基酸從而去除苦味[8]。因此氨肽酶可以廣泛用于肉制品、豆制品等高蛋白食品加工工業(yè)等，減少苦味的同時也可以增加游離氨基酸，提高食品營養(yǎng)價值；并且氨肽酶還可用于蛋白序列測序的分子工具以及重組蛋白或融合產(chǎn)物的固化劑[9-11]。因此，氨肽酶在食品工業(yè)上可以與蛋白酶協(xié)同作用，增加發(fā)酵食品游離氨基酸含量，提高營養(yǎng)價值，改善食品風(fēng)味。

氨肽酶廣泛存在于不同物種的生物體中，包括哺乳動物、植物、微生物等。由于動植物體內(nèi)成分復(fù)雜、氨肽酶含量較低，導(dǎo)致提取成本較高[12]。微生物作為氨肽酶的重要來源，其種類多、繁殖快、易于培養(yǎng)管理等優(yōu)點(diǎn)適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[13]，同時還可以應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)對產(chǎn)氨肽酶微生物進(jìn)行改造，提高酶產(chǎn)量，改變酶學(xué)特性[14]。因此篩選到高產(chǎn)氨肽酶的菌種，特別是我國食品安全管理規(guī)定中可用于食品領(lǐng)域的微生物菌種尤為重要[15]。本研究以傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品為分離源，以高產(chǎn)氨肽酶為目標(biāo)分離篩選產(chǎn)酶菌株，研究固態(tài)發(fā)酵的適宜條件，通過檢測小肽及總游離氨基酸的含量評判其發(fā)酵效果，為該菌株在食品發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬：采自皖北民間作坊，放置于無菌取樣盒中于4 ℃保存；黃豆粉：由安徽合肥中黃901品種的大豆經(jīng)過研磨過100目篩所得，置于4 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

KH2PO4、Na2HPO4、L-亮氨酸-對硝基苯胺、水合茚三酮、乙二醇、三氯乙酸等（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；上海麥克林生化科技股份有限公司。

富集培養(yǎng)基：可溶性淀粉8 g/L，酵母膏2 g/L，干酪素10 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 7.0。

篩選培養(yǎng)基：乳糖10 g/L，酪蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂18 g/L，調(diào)節(jié)pH 7.0。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：牛肉膏10g/L，酵母膏10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨10 g/L，K2HPO42 g/L，醋酸鈉5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.5 g/L，吐溫80 1 g/L，檸檬酸三鈉2 g/L，瓊脂18 g/L，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基均在115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BCC-2000生化培養(yǎng)箱：福建九圃生物科技有限公司；ZQZY-CS8振蕩培養(yǎng)箱：北京經(jīng)日今典科技有限公司；UV-752紫外可見分光光度計(jì)：東菀市譜標(biāo)試驗(yàn)器材科技有限公司；HH-WO-20L電熱恒溫水浴鍋：上海壹茗實(shí)業(yè)有限公司；LC-LX-H165A臺式高速離心機(jī)：深圳市益百順科技有限公司；BF-1000-2C電子分析天平：北京賽歐華創(chuàng)科技有限公司；BPH-9140AS高溫烘干箱：武漢森蘇科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)氨肽酶菌株的篩選

稱取1 g傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品于10 mL無菌水中，振蕩混合均勻后取2.0 mL接入富集培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)48 h，取富集培養(yǎng)菌液倍比稀釋后均勻涂布到篩選培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)。觀察菌落形態(tài)，挑取長勢較好的菌落平板劃線形成單菌落，測量水解透明圈（D）與菌落直徑（d）比值（D/d），選擇比值較大的菌落，傳代純化，并分別適量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)48 h，采用LNA法測定氨肽酶活力[16]，選取氨肽酶活力最高的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 高產(chǎn)氨肽酶菌的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：通過裸眼觀察單菌落形態(tài)特征（顏色、形狀、質(zhì)地等）。用革蘭氏染色[17]，掃描電鏡觀測菌體[18-19]。

生理生化檢測：將菌株接種于固體斜面培養(yǎng)基上，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h送上海復(fù)達(dá)檢測技術(shù)集團(tuán)有限公司采用API Plus自動判讀系統(tǒng)、CHL微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌株生理生化特性分析[20]。

分子生物學(xué)鑒定：菌株MRS平板送至上海生工生物有限公司測試，并在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源關(guān)系序列比對，最后使用程序MEGA 6構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行菌種鑒定[21-22]。

1.3.3 高產(chǎn)氨肽酶菌固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

以篩選菌株對數(shù)生長期菌液為種子液接種于裝有100 g黃豆粉的分裝袋中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，通過單因素試驗(yàn)，對固態(tài)發(fā)酵原料的初始含水量（50%、55%、60%、65%、70%），發(fā)酵時間（3 d、6 d、9 d、12 d、15 d），發(fā)酵溫度（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃），接種量（2%、4%、6%、8%、10%），起始pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）5個因素進(jìn)行優(yōu)化，分析發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與總游離氨基酸含量，以確定固態(tài)發(fā)酵顯著影響因子及水平范圍，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

（2）正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對小肽含量與總游離氨基酸有顯著影響的3個因素：含水量（A）、培養(yǎng)時間（B）、接種量（C），設(shè)計(jì)3因子3水平L9（33）正交試驗(yàn)[23-25]，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 菌株IFJ1固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for solid-state fermentation conditions optimization of strain IFJ1

1.3.4 總游離氨基酸和小肽含量的測定

總游離氨基酸的測定：茚三酮法[26]，以精氨酸作為對照品，在波長570 nm處測定總游離氨基酸的吸光度值，根據(jù)下面公式計(jì)算總游離氨基酸含量：

1.3.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

單因素方差（analysis of variance，ANOVA）分析和差異顯著性分析均由WPS office 2018、IBM SPSS Statistics 25和GraphPad Prism 8.0.2完成，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用正交設(shè)計(jì)助手；繪圖由GraphPad Prism 8.0.2完成。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)氨肽酶菌株的篩選

從初篩平板上挑取10個周邊有透明圈的菌落，其D/d值如表2所示。

表2 初篩菌株的D/d值Table 2 D/d value of primary screened strain

由表2可知，D/d值較大的5株菌為IFJ1、IFJ7、IFJ9、IFJ18、IFJ20，對其氨肽酶活力進(jìn)行測定，產(chǎn)酶情況見圖1。由圖1可知，菌株IFJ1發(fā)酵液酶活力最高，發(fā)酵24 h的氨肽酶活力達(dá)到（1 853.98±11.37）U/mL，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的德氏乳桿菌、蠟樣芽孢桿菌、乳酸乳球菌等菌株相比[30-31]，屬于產(chǎn)氨肽酶能力較強(qiáng)的菌，故優(yōu)選菌株IFJ1進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 復(fù)篩菌株的氨肽酶活力Fig.1 Aminopeptidase activity of re-screened strains

2.2 高產(chǎn)氨肽酶菌株的鑒定

菌株IFJ1的菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色結(jié)果、掃描電鏡圖見圖2。

圖2 菌株IFJ1的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain IFJ1

由圖2可知，菌株IFJ1在MRS固體培養(yǎng)基上的菌落特征為圓形、微白色、濕潤、表面凸起，邊緣光滑整齊；經(jīng)革蘭氏染色與顯微鏡觀察，菌種IFJ1的菌體形態(tài)呈球形，為革蘭氏陽性菌。在掃描電鏡下觀察，菌體的呈現(xiàn)形式主要是單個卵圓形，長度約為1.0～1.4 μm，無芽孢，無鞭毛。

菌株IFJ1的生理生化鑒定結(jié)果見表3。由表3可知，菌株IFJ1可發(fā)酵核糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉籽糖、D-阿拉伯糖醇、苦杏仁苷等，不發(fā)酵多糖，過氧化氫酶陰性。

表3 菌株IFJ1生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical identification results of strain IFJ1

對菌株IFJ1的16S rDNA基因進(jìn)行測序，在GenBank中獲得序列登錄號為OK310791。菌株IFJ1的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株IFJ1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain IFJ1 based on 16S rDNA gene sequences

由圖3可知，菌株IFJ1與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）LMG 17680、Pediococcus acidilacticiDSM20284、Pediococcus loliigenes等菌株聚類在同一分枝上，因此鑒定該菌株為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），菌株IFJ1專利保存編號為M2022828。研究表明，乳酸菌可產(chǎn)生包括氨肽酶、二肽酶、三肽酶和脯氨酸特異性肽酶等特異性肽酶[32-33]，這與菌株IFJ1具有氨肽酶產(chǎn)生能力的性質(zhì)一致。

2.3 菌株IFJ1固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

由圖4A可知，隨含水量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量和總游離氨基酸含量均呈先升高后降低的趨勢；含水量為55%時，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量最高，為（11.87±0.45）%；含水量為60%時，發(fā)酵產(chǎn)物中總游離氨基酸含量最高，為（13.13±0.12）%，但含水量為65%時，總游離氨基酸的含量為（11.84±0.11）%，較含水量為55%時（10.80%）高。推測初始含水量較低時，后期發(fā)酵底物會較干燥，不利于微生物的生長繁殖及產(chǎn)酶；而隨著含水量達(dá)到最適值，此時菌株生長狀態(tài)最佳，發(fā)酵效果達(dá)到最佳；發(fā)酵底物水分含量過高容易產(chǎn)生粘黏現(xiàn)象，無法充分散熱，不利于菌體的生長及酶產(chǎn)生，同時過于粘黏物料也不利微生物所產(chǎn)酶的分散，從而影響發(fā)酵效果[34-35]。因此，菌株IFJ1發(fā)酵的適宜含水量為55%～65%。

圖4 不同發(fā)酵條件對小肽含量與總游離氨基酸含量的影響Fig.4 Effect of different fermentation conditions on small peptide and total free amino acid contents

由圖4B可知，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量和總游離氨基酸含量均隨著發(fā)酵時間的增加呈先升高后降低的趨勢；當(dāng)發(fā)酵時間為12 d時，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與總游離氨基酸含量最高，分別為（11.38±0.08）%與（13.34±0.22）%；發(fā)酵前期發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與總游離氨基酸含量逐漸上升，推測其可能原因隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物的生長代謝產(chǎn)生更多的氨肽酶，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)酶解程度[36]；當(dāng)發(fā)酵時間＞12 d后，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量開始降低，推測可能是由于氮源逐漸被消耗，在發(fā)酵后期小肽進(jìn)入代謝循環(huán)，導(dǎo)致肽得率降低。發(fā)酵時間過長，菌株進(jìn)入衰亡期，產(chǎn)酶量逐漸減少，且部分酶開始失活，酶活力下降，發(fā)酵效率降低[37]。因此菌株IFJ1的適宜發(fā)酵時間范圍為9～15 d。

由圖4C可知，隨著隨接種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量和總游離氨基酸含量均呈先升高后降低的趨勢；當(dāng)接種量為6%時，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量達(dá)到最大為（10.21±0.06）%，總游離氨基酸含量升至最大為（12.83±0.12）%，較接種量4%和8%時分別提高了223.87%和317.69%（P＜0.05）；接種量為2%～6%時，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與總游離氨基酸含量逐漸上升，隨著接種量增大，可縮短菌株延滯期的時間，促使氨肽酶的形成分泌提早出現(xiàn)[38]；當(dāng)接種量在6%～10%時，發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量與總游離氨基酸含量開始降低，可能是因?yàn)榻臃N量過大，菌體初期生長迅速，過早達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，不利于氨肽酶形成和積累，除此之外還會產(chǎn)生大量代謝廢物[39]。因此菌株IFJ1發(fā)酵的適宜接種量范圍為4%～8%。

由圖4D和4E可知，起始pH與發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量和總游離氨基酸含量的影響不顯著（P＞0.05）。

2.4 菌株IFJ1固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表4，試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表5。

表4 菌株IFJ1固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of L9(33)orthogonal experiments for solidstate fermentation conditions optimization of strain IFJ1

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal tests results

根據(jù)表4中的R值能夠發(fā)現(xiàn)，影響小肽含量的主要因素次序?yàn)锳＞B＞C，對總游離氨基酸含量影響的主要因素次序?yàn)镃＞A＞B。考慮到各因素的極差R值，分別確定影響兩個指標(biāo)因素的主次順序，同時結(jié)合水平結(jié)果k值確定兩個指標(biāo)下的最適因素組合[19]。發(fā)酵產(chǎn)小肽的最適組合為A3B3C3，在此條件下發(fā)酵產(chǎn)物小肽含量為10.58%，總氨基酸含量達(dá)10.24%；而發(fā)酵產(chǎn)總游離氨基酸的最適組合為A3B3C2，在此條件下發(fā)酵產(chǎn)物總氨基酸含量高達(dá)13.88%，小肽含量也達(dá)到10.30%。故綜合平衡試驗(yàn)?zāi)康呐c實(shí)際情況，選擇發(fā)酵的最佳組合為A3B3C2，即含水量為65%、發(fā)酵時間為15 d、接種量為6%。在最佳試驗(yàn)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵產(chǎn)物成品小肽含量平均值為10.57%；總游離氨基酸含量平均值為14.05%。

根據(jù)表5中的F值能夠發(fā)現(xiàn)，A、B、C三個因素對小肽及總游離氨基酸含量的影響都具有顯著性，其中含水量對發(fā)酵產(chǎn)小肽含量有著極顯著影響，接種量對發(fā)酵產(chǎn)總游離氨基酸含量有著極顯著影響。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從皖北豆醬中分離得到一株產(chǎn)氨肽酶能力強(qiáng)的菌株IFJ1，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)試驗(yàn)鑒定該菌株為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化確定IFJ1菌株固態(tài)發(fā)酵條件：發(fā)酵時間為15 d、接種量為6%、含水量為65%，在此優(yōu)化條件下，菌株IFJ1發(fā)酵產(chǎn)物中小肽含量達(dá)到10.57%、總游離氨基酸含量可達(dá)14.05%。利用乳酸片球菌IFJ1的高產(chǎn)氨肽酶特性進(jìn)行發(fā)酵，不僅為氨肽酶的生產(chǎn)提供了菌種來源，也可以作為優(yōu)良的氨肽酶產(chǎn)生菌應(yīng)用于發(fā)酵豆制品，以期得到風(fēng)味品質(zhì)更好的發(fā)酵食品。