產(chǎn)幾丁質(zhì)酶高原菌的分離鑒定及酶學(xué)性質(zhì)初步研究

權(quán)淑靜，楊文玲，雷 高，王佰濤，刁文濤，梁 博，劉德海*

（1.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008；2.河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450008；3.河南省高新技術(shù)實(shí)業(yè)有限公司，河南 鄭州 450008）

幾丁質(zhì)（聚β-1,4-N-乙酰-D-葡糖胺）是一種β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖的聚合物，也稱(chēng)甲殼素，是自然界中僅次于纖維素存在的第二大多糖[1]，其主要來(lái)源于真菌細(xì)胞壁、昆蟲(chóng)外骨骼和甲殼類(lèi)動(dòng)物[2]。據(jù)估計(jì)，在自然界幾丁質(zhì)每年產(chǎn)量約為1 010～1 011 t，是地球上最豐富的未被充分開(kāi)發(fā)的生物質(zhì)資源之一[3]。在原生狀態(tài)下，幾丁質(zhì)以有序的晶體微纖維形式存在，不溶于水、稀酸、堿和其他有機(jī)溶劑，在濃酸中不穩(wěn)定，易發(fā)生糖苷鍵的斷裂[4]。采用適當(dāng)?shù)姆椒ń到鈳锥≠|(zhì)，可得到不同聚合度的水溶性幾丁寡糖（chitin oligosaccharides，NACOS）或殼寡糖（chitosan oligosaccharide，COS）及其衍生物。作為一種功能性生物聚合物，幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、保濕補(bǔ)水及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種生物活性，因其生物相容性、細(xì)胞膜滲透性和可生物降解等獨(dú)特特性，受到了廣泛的關(guān)注[5]，被應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、食品和農(nóng)業(yè)等多個(gè)行業(yè)[6-9]。

目前，制備幾丁寡糖的方法主要有化學(xué)法、物理法和生物法[10]，這些方法各有優(yōu)點(diǎn)和局限性。不同水解方法提供了不同分子質(zhì)量和脫乙酰程度的殼聚糖，影響其組成、收率和功能[11]?；瘜W(xué)法以酸水解為主，簡(jiǎn)單、高效，但是殼聚糖顆粒中的剛性結(jié)晶區(qū)域會(huì)抑制酸的滲透。因此，在大多數(shù)研究中使用的是5～12 mol/L的高濃度酸。過(guò)多的酸負(fù)荷會(huì)導(dǎo)致葡萄糖胺降解，從而顯著降低產(chǎn)量，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)不均、副產(chǎn)物多，另外還會(huì)造成嚴(yán)重的設(shè)備腐蝕和環(huán)境污染問(wèn)題[12]。物理法有超聲、微波[13]、伽馬輻射[14]等方式，缺點(diǎn)是能耗高。生物法主要是生物酶法，利用專(zhuān)一性幾丁質(zhì)酶或非專(zhuān)一性酶對(duì)幾丁質(zhì)進(jìn)行水解，其具有聚合程度可控、副產(chǎn)物少、反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[10]。

幾丁質(zhì)酶來(lái)源十分廣泛，多種產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株已被報(bào)道，主要包括曲霉屬（Aspergillus）[15]、鏈霉菌屬（Streptomyces）、沙雷菌屬（Serratia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和類(lèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus）[16-17]，還包括粘球菌屬（Mucococcus）[18]、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）和希瓦氏菌屬（Shewanella）[19]等，但這些菌株所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶存在酶活力不高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高等問(wèn)題。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的研究多集中在海洋微生物資源的發(fā)掘[20-23]，對(duì)于內(nèi)陸土壤尤其是高原菌開(kāi)展的研究較少。“世界屋脊”青藏高原地形及環(huán)境特殊，有大量特色微生物資源亟待挖掘。因此，本研究采用透明圈法及酶活力測(cè)定從日喀則地區(qū)采集的土壤樣品中分離、篩選高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株，并對(duì)所獲得的菌株進(jìn)行鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究，以期發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的特性，為后期利用其幾丁質(zhì)酶基因構(gòu)建工程菌并在生產(chǎn)上應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

土壤樣品：采自西藏日喀則地區(qū)（北緯29°14′11″，東經(jīng)88°53′59″，海拔3 685 m）。

1.1.2 溶液及培養(yǎng)基

5%的膠體幾丁質(zhì)溶液：稱(chēng)取10 g粉末幾丁質(zhì)加入到200 mL濃鹽酸中，蓋保鮮膜，于磁力攪拌器攪拌過(guò)夜；將酸解后的液體倒入預(yù)冷的2.5 L蒸餾水中，攪拌均勻，4 ℃靜置過(guò)夜；8 000 r/min離心10 min，將上清液倒出，加入預(yù)冷的蒸餾水重懸，再靜置，多次反復(fù)，直到懸濁液pH為5.0；最后將離心后的膠體加入200 mL去離子水。

初篩培養(yǎng)基[22]：膠體幾丁質(zhì)1%，K2HPO40.07%，KH2PO40.03%，MgSO4·7H2O 0.05%，ZnSO40.001%，瓊脂2%，pH自然。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

復(fù)篩培養(yǎng)基（發(fā)酵培養(yǎng)基）[22]：膠體幾丁質(zhì)1%，K2HPO40.07%，KH2PO40.03%，MgSO4·7H2O 0.05%，ZnSO40.001%，pH自然。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑

革蘭氏染色試劑盒、幾丁質(zhì)、幾丁質(zhì)酶活檢測(cè)試劑盒（微量法）：北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國(guó)Omega Bio-Tek公司；2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）StarMix：北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司；菌株16S rDNA基因PCR擴(kuò)增通用引物27F、1492R、D2000 Plus DNALadder：北京六合華大基因科技有限公司；GF254薄層層析（thin layer chromatography，TLC）板：德國(guó)Merck公司；幾丁寡糖（≥98%）：青島和海生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DRP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；QYC-2012C恒溫?fù)u床：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Multifuge X1R離心機(jī)：德國(guó)Thermo公司；Thermoblock PCR擴(kuò)增儀：德國(guó)Biometra公司；System蛋白質(zhì)雙向電泳系統(tǒng)、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；Axio Image M2全電動(dòng)正置熒光顯微鏡：德國(guó)Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選

初篩：采用梯度稀釋法分離菌株。稱(chēng)取10 g土樣加入90 mL放有玻璃珠的蒸餾水中，打散后涂布于初篩培養(yǎng)基平板，28 ℃培養(yǎng)至透明圈產(chǎn)生，挑選透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值大的菌株作為初篩菌株。

復(fù)篩：將初篩獲得的菌株接種于復(fù)篩培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)36～48 h，8 000 r/min離心10 min后取上清獲得粗酶液，37 ℃測(cè)定粗酶液中幾丁質(zhì)酶活性，比較酶活力大小，選取酶活最高的菌株。

1.3.2 幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定

參照幾丁質(zhì)酶活檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定幾丁質(zhì)酶活性。幾丁質(zhì)酶活力定義為：在一定的反應(yīng)條件下，每毫升液體每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活性單位（U/mL）。

1.3.3 高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：將分離純化的單菌落接種到NA培養(yǎng)基平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落特征；對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)。

生理生化鑒定：參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[24]對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：使用Omega細(xì)菌基因組提取試劑盒獲得篩選菌株的基因組DNA，以其為模板，采取通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）PCR擴(kuò)增16S rDNA基因序列片段。PCR擴(kuò)增體系：2×TaqPCR StarMix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，超純水9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在ezbiocloud網(wǎng)站中進(jìn)行比對(duì)分析，利用MEGA6.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 粗酶液酶學(xué)性質(zhì)初步研究

最適溫度以及溫度穩(wěn)定性：在不同溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃）下測(cè)定粗酶液的酶活力，確定最適反應(yīng)溫度。將粗酶液在不同溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃）下保溫2 h后測(cè)定剩余酶活。以最大酶活力值計(jì)為100%，計(jì)算出其余處理的相對(duì)酶活。

最適pH以及pH穩(wěn)定性：在不同pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）條件，最適反應(yīng)溫度下測(cè)定酶活力，確定最適反應(yīng)pH。將粗酶液在不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）緩沖液體系中4 ℃放置2 h，最適反應(yīng)溫度條件下測(cè)定剩余酶活。以最大酶活力值計(jì)為100%，計(jì)算出其余處理的相對(duì)酶活。

不同金屬離子及化合物對(duì)酶活力的影響：在不同處理中加入Mg2+、Ba2、Zn2+、Mn2+、Fe2+、K+、Ca2+、Cr2+、Ag+、Co2+、Na+、Tween-80、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF），使其在反應(yīng)體系中終濃度為2 mmol/mL，在最適反應(yīng)溫度、pH條件下測(cè)定酶活力。以未加金屬離子及化合物的酶活力為100%，計(jì)算出其余處理的相對(duì)酶活。

1.3.5 粗酶液對(duì)幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物分析

將粗酶液與底物膠體幾丁質(zhì)以1∶1比例混合，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃條件下反應(yīng)12 h，沸水浴5 min終止反應(yīng)，離心，取上清液進(jìn)行薄層層析[25]，上樣量5 μL，以幾丁單糖和幾丁寡糖（N-乙酰氨基葡萄糖、幾丁二糖、幾丁三糖、幾丁四糖）含量分別為10 mg/mL的混合溶液為標(biāo)樣，陰性對(duì)照為緩沖液代替底物反應(yīng)的上清液。展層劑為正丁醇-乙酸-水（2∶1∶1，V/V），展層結(jié)束后吹干，均勻噴灑顯色劑（二苯胺1 g、苯胺1 mL、丙酮50 mL、磷酸5 mL），85 ℃條件下顯色10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選

采用透明圈法從日喀則地區(qū)土壤中分離篩選到16株產(chǎn)透明圈的菌株，進(jìn)一步經(jīng)酶活測(cè)定復(fù)篩，最終獲得5株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株，其幾丁質(zhì)酶活力見(jiàn)圖1。由圖1可知，5株菌株的幾丁質(zhì)酶活力為49.77～242.36 U/mL，其中菌株RGZ2-4-5的幾丁質(zhì)酶活力最高，為242.36 U/mL。因此，選擇菌株RGZ2-4-5為高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株。

圖1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株篩選結(jié)果Fig.1 Screening results of chitinase-producing strains

2.2 菌株RGZ2-4-5的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株RGZ2-4-5的菌落及細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株RGZ2-4-5的菌落呈乳白色，半透明狀，為邊緣規(guī)則的圓形，表面光滑、濕潤(rùn)，革蘭氏染色為陰性，細(xì)胞呈棒狀。

圖2 菌株RGZ2-4-5的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)特征Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphological characteristics of strain RGZ2-4-5

2.2.2 生理生化試驗(yàn)

菌株RGZ2-4-5的生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，菌株RGZ2-4-5的氧化酶、接觸酶試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性，能使明膠液化、Tween-80水解。結(jié)合形態(tài)觀察，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》初步鑒定菌株RGZ2-4-5為馬賽菌屬（Massiliasp.）。

表1 菌株RGZ2-4-5的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical test results of strain RGZ2-4-5

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

基于16S rDNA基因序列構(gòu)建菌株RGZ2-4-5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株RGZ2-4-5的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain RGZ2-4-5 based on 16S rDNA gene sequences

由圖3可知，菌株RGZ2-4-5的16S rDNA基因序列與Massilia aquaticaFT 127WT聚于同一分支，親緣關(guān)系最近?；谛螒B(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，最終鑒定菌株RGZ2-4-5為Massilia aquatica。

2.3 菌株RGZ2-4-5產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)初步研究

2.3.1 溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響及溫度穩(wěn)定性

由圖4可知，在30～60 ℃之間，幾丁質(zhì)酶活力隨反應(yīng)溫度的升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)，酶活力最高，為223.06 U/mL。因此，確定最適反應(yīng)溫度為50 ℃。由圖4亦可知，溫度越低，幾丁質(zhì)酶越穩(wěn)定，40 ℃以下保溫處理2 h，酶活力能保持在60%以上，高于40 ℃后迅速失活，50 ℃保溫2 h后相對(duì)酶活力僅為24.21%。結(jié)果表明，菌株RGZ2-4-5所產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶不耐高溫，屬于中低溫幾丁質(zhì)酶。

圖4 溫度對(duì)菌株RGZ2-4-5所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of chitinase produced by strain RGZ2-4-5

2.3.2 pH對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響及pH穩(wěn)定性

由圖5可知，菌株RGZ2-4-5所產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶粗酶液在pH為4.0～10.0范圍內(nèi)酶活力較高，且隨著pH的升高，酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH為5.0時(shí)，酶活達(dá)到最高，為259.69 U/mL，說(shuō)明該酶的最適反應(yīng)pH為5.0。由圖5亦可知，粗酶液在pH5.0～7.0條件下處理后仍保持70%以上酶活；pH＞7.0以后酶活下降迅速，pH為8.0時(shí)相對(duì)酶活為36.41%，pH為10.0時(shí)相對(duì)酶活僅為5.15%。結(jié)果表明，該酶pH適應(yīng)范圍廣，在酸性條件下比較穩(wěn)定。

圖5 pH對(duì)菌株RGZ2-4-5所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力及穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of chitinase produced by strain RGZ2-4-5

2.3.3 金屬離子及化合物對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

由圖6可知，與CK相比，Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cr2+、Ag+、Co2+及PMSF處理的相對(duì)酶活顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明這幾種金屬離子對(duì)該酶有顯著的抑制作用，其中，Zn2+、Mn2+、Fe2+、Ag+處理的相對(duì)酶活＜80%，而其他金屬離子對(duì)酶活無(wú)顯著的促進(jìn)或抑制作用（P＞0.05）。

圖6 金屬離子及化合物對(duì)菌株RGZ2-4-5所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力的影響Fig.6 Effect of metal ions on the activity and stability of chitinase produced by strain RGZ2-4-5

本研究菌株RGZ2-4-5產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度為50 ℃，低于RAY L等[3，15]報(bào)道的耐熱幾丁質(zhì)酶，高于國(guó)內(nèi)報(bào)道的海洋菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的結(jié)果[21-22]。幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)pH多為7.0左右[3，10，22]，菌株RGZ2-4-5所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最適pH為5.0，在pH5.0～7.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定性均在70%以上，寬泛的反應(yīng)溫度范圍和酸堿適應(yīng)范圍使其有利于在工業(yè)發(fā)酵中應(yīng)用。

2.4 菌株RGZ2-4-5所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶對(duì)幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物分析

采用TLC分析菌株RGZ2-4-5所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶對(duì)幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 菌株RGZ2-4-5所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶對(duì)幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物的分析結(jié)果Fig.7 Analysis results of chitin degradation products by chitinase produced by strain RGZ2-4-5

由圖7可知，該菌株所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶可水解幾丁質(zhì)，主要產(chǎn)物為幾丁二糖[（GlcNAc）2]，還有少量的幾丁單糖（GlcNAc）和幾丁三糖。不同溫度處理的產(chǎn)物量有所不同，在30～50 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，幾丁三糖含量從少量到幾乎不產(chǎn)，然而幾丁單糖和幾丁二糖含量有所增加，在50 ℃時(shí)達(dá)到最高。分析原因可能是在最適反應(yīng)溫度下，底物充分水解，因此單糖和二糖產(chǎn)量高，60 ℃酶活力迅速減弱，反應(yīng)最終產(chǎn)物只有少量的幾丁二糖。

內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（EC 3.2.1.14）從幾丁質(zhì)多糖鏈的內(nèi)部隨機(jī)水解幾丁質(zhì)，生成幾丁寡糖（（GlcNAc）n，n＞2），幾丁質(zhì)先是被降解成分子質(zhì)量不一的寡糖，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，最終被水解成（G1cNAc）2及少量的GlcNAc[12，26]。根據(jù)水解產(chǎn)物判斷菌株RGZ2-4-5所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶。在最適反應(yīng)溫度下，酶能更充分的分解底物，最終產(chǎn)物為（GlcNAc）2和少量的GlcNAc。

3 結(jié)論

本研究采用透明圈法和酶活力測(cè)定從西藏日喀則土壤樣品中篩選獲得的一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株RGZ2-4-5，其在以1%膠體幾丁質(zhì)作為唯一碳、氮源條件下發(fā)酵，幾丁質(zhì)酶活力達(dá)到242.36 U/mL。通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化特征及16S rDNA序列分析鑒定該菌株為Massilia aquatica。菌株RGZ2-4-5所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適反應(yīng)pH為5.0，在溫度30～40 ℃，pH 5.0～7.0的條件下粗酶液具有較好的穩(wěn)定性，金屬離子Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cr2+、Ag+、Co2+、PMSF對(duì)幾丁質(zhì)酶活具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。TLC結(jié)果顯示，該酶水解幾丁質(zhì)的最終產(chǎn)物為（GlcNAc）2和GlcNAc。