申 瑾,夏瑤瑤,梁 楷,周景麗,閆裕峰*,趙慧姿,李 杰
(1.食醋發(fā)酵科學(xué)與工程山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030400;2.山西紫林醋業(yè)股份有限公司,山西 太原 030400)
老陳醋手工醋酸發(fā)酵工藝采用陶缸發(fā)酵,產(chǎn)品風(fēng)味好、營(yíng)養(yǎng)豐富[1-2],但其生產(chǎn)過(guò)程的控制主要依靠老師傅多年的經(jīng)驗(yàn)和直觀感覺(jué),存在釀造過(guò)程難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、生產(chǎn)效率低、勞動(dòng)強(qiáng)度大等缺陷。在保證老陳醋優(yōu)良品質(zhì)的前提下,機(jī)械化固態(tài)醋酸發(fā)酵工藝可實(shí)現(xiàn)老陳醋的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)。老陳醋機(jī)械化固態(tài)醋酸發(fā)酵利用拌醅機(jī)將酒精發(fā)酵結(jié)束后的酒醪、麩皮、谷糠及稻殼混合,隨后接入含有大量生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期的醋酸菌的火醅進(jìn)行醋酸發(fā)酵,每日翻醅利用翻倒醅機(jī)代替手工翻醅和倒缸[3]。利用機(jī)械化設(shè)備對(duì)手工釀造工藝進(jìn)行升級(jí)可實(shí)現(xiàn)老陳醋的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),進(jìn)而提高山西食醋行業(yè)科技水平和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力,對(duì)于老陳醋手工釀造技藝非遺的傳承和弘揚(yáng)也具有重要意義。
食醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中內(nèi)在特性的研究集中于微生物菌群、理化指標(biāo)及風(fēng)味物質(zhì)的變化分析。于華等[4]對(duì)四川麩醋發(fā)酵過(guò)程中醋醅理化指標(biāo)及有機(jī)酸變化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),揮發(fā)酸、不揮發(fā)酸與總酸變化趨勢(shì)大致相同;氨基酸態(tài)氮含量呈先快后慢的上升趨勢(shì);還原糖含量先升高后降低。從醋醅樣品中共檢測(cè)出8種有機(jī)酸,其中乙酸和乳酸為主體有機(jī)酸。KOU R等[5]通過(guò)Illumina Hiseq測(cè)序發(fā)現(xiàn),山西老陳醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中,乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和醋酸桿菌屬(Acetobacter)是山西陳醋夏季發(fā)酵過(guò)程中的兩個(gè)主要類群,它們分別在乙酸發(fā)酵和酒精發(fā)酵階段占主導(dǎo)地位。鄭宇等[6]對(duì)中國(guó)手工固態(tài)發(fā)酵食醋主要特征風(fēng)味物質(zhì)組成進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)乙酸和乳酸是手工食醋中含量最高且風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的主體有機(jī)酸,其含量占總有機(jī)酸含量的80%以上。王超等[7]對(duì)鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),水分含量變化不顯著,還原糖呈先增后減趨勢(shì),pH值和蛋白質(zhì)呈下降趨勢(shì),總酸、氨基酸和銨鹽呈遞增趨勢(shì)。陳旭峰等[8]對(duì)山西老陳醋釀造過(guò)程中理化指標(biāo)及風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),醋酸發(fā)酵階段酸度和有機(jī)酸含量不斷增長(zhǎng),還原糖和氨基酸態(tài)氮的含量先上升后下降。目前,醋酸發(fā)酵不同翻醅方式對(duì)老陳醋品質(zhì)影響的研究報(bào)道尚鮮見(jiàn)。
本研究采用手工及機(jī)械翻醅方式,對(duì)老陳醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)、有機(jī)酸及香氣成分進(jìn)行跟蹤測(cè)定,比較兩種醋酸發(fā)酵翻醅方式對(duì)老陳醋品質(zhì)的影響,以期掌握老陳醋手工及機(jī)械翻醅方式下醋酸發(fā)酵的內(nèi)在特性和變化規(guī)律,為老陳醋醋酸發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供一定的技術(shù)參考。
1.1.1 醋醅樣品
醋醅樣品:采集山西紫林醋業(yè)股份有限公司。老陳醋醋酸發(fā)酵手工翻醅方式采樣點(diǎn)(0、2 d、6 d、10 d)與機(jī)械翻醅方式采樣點(diǎn)(0、2 d、8 d、12 d、14 d)。機(jī)械翻醅發(fā)酵時(shí)間為14 d結(jié)束,手工翻醅為10 d結(jié)束。
1.1.2 化學(xué)試劑
硫酸銅、亞甲基藍(lán)(均為分析純):天津歐博凱化工有限公司;亞鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、氨水、亞硝酸鈉、硝酸鋁(均為分析純):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;蘆?。兌龋?8%):上海源葉生物科技有限公司;酒石酸、乳酸、草酸、檸檬酸、丙酮酸、蘋(píng)果酸、乙酸、琥珀酸(均為色譜純):天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。
1.1.3 培養(yǎng)基
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
STARTER 3100 pH計(jì)、AR124CN電子天平:上海奧豪斯儀器有限公司;202型電熱恒溫干燥箱:天津泰斯特儀器有限公司;HH-4型水浴鍋:常州榮華儀器制造有限公司;T3202分光光度計(jì):太原市瑞佳科學(xué)器材有限公司;WGZ-800濁度計(jì):上海昕瑞儀器儀表有限公司;1260高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀(配紫外檢測(cè)器)、7890B氣相色譜(gas chromatography,GC)儀、7000D型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)儀:美國(guó)安捷倫公司;FPJ1500翻醅機(jī):溫州市伯泰機(jī)械科技有限公司。
1.3.1 老陳醋醋酸發(fā)酵翻醅方式
手工翻醅:老陳醋固態(tài)醋酸發(fā)酵利用拌醅機(jī)將酒精發(fā)酵結(jié)束后的酒醪、麩皮、谷糠及稻殼混合,隨后接入含有大量生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期的醋酸菌的火醅進(jìn)行醋酸發(fā)酵,每日翻醅工人進(jìn)行手工翻醅和倒缸。
機(jī)械翻醅:老陳醋機(jī)械化固態(tài)醋酸發(fā)酵利用拌醅機(jī)將酒精發(fā)酵結(jié)束后的酒醪、麩皮、谷糠及稻殼混合,隨后接入含有大量生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期的醋酸菌的火醅進(jìn)行醋酸發(fā)酵,每日翻醅利用翻醅機(jī)代替手工翻醅和倒缸。
1.3.2 理化指標(biāo)的測(cè)定
總酸、不揮發(fā)酸、還原糖、氨基酸態(tài)氮、pH值:參照國(guó)標(biāo)GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋》中的方法進(jìn)行測(cè)定[9]。
1.3.3 有機(jī)酸含量的測(cè)定
有機(jī)酸含量的測(cè)定采用高效液相色譜法[10]。
前處理方法:取2 mL待測(cè)樣品,加2 mL 10.6%亞鐵氰化鉀和2 mL 30%硫酸鋅溶液,用蒸餾水稀釋定容到25 mL,10 000 r/min離心10 min,上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾,備用。
高效液相色譜條件:SinochromODS-BP色譜柱(4.6mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:0.01 mmol/L KH2PO4(用磷酸調(diào)pH=2.7)∶甲醇=97∶3(V/V);流速0.6mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;進(jìn)樣量10 μL。
定性與定量分析:將乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、α-酮戊二酸7種標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稀釋成不同濃度混合溶液后進(jìn)行色譜分離,各有機(jī)酸的出峰保留時(shí)間用于有機(jī)酸的定性分析。以色譜峰面積對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸分析,各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)為0.997 2~0.999 3,按照各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算醋樣中有機(jī)酸的含量。
1.3.4 香氣成分的測(cè)定
香氣成分的測(cè)定采用頂空固相微萃取(headspace solidphase microextraction,HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-13]。
前處理方法:先將萃取頭在氣相色譜的進(jìn)樣口于250 ℃老化至無(wú)雜峰,將6 mL醋樣放入15 mL固相微萃取樣品瓶中,加入1.5 g固體氯化鈉,加蓋。放入40 ℃恒溫水浴中,將SPME萃取頭通過(guò)瓶蓋插入到樣品中的頂空部分,推出纖維頭,頂空吸附40 min,隨后抽回纖維頭,從樣品瓶中拔出萃取頭,再將萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜儀的氣相色譜進(jìn)樣口,推出纖維頭,于250 ℃解吸3 min,抽回纖維頭后拔出萃取頭,同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。
氣相色譜條件:HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為高純氦氣(He),流量0.9 mL/min;進(jìn)樣口溫度250 ℃,不分流;升溫程序:起始溫度40 ℃,保持6 min,以3 ℃/min升溫至90 ℃,保持2.5 min,以10 ℃/min升溫至100 ℃,保持4 min,以3 ℃/min升溫至220 ℃,再以40 ℃/min升溫至270 ℃,保持10 min。
質(zhì)譜條件:電子電離(electronic ionization,EI)源,電子能量70 eV,接口溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,掃描質(zhì)量范圍33~450 amu。
定性與定量分析:香氣成分的定性以美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(national institute of standards and technology,NIST)17譜庫(kù)和人工圖譜解析共同確定,選取匹配度>70%的化合物為有效香氣成分。各香氣成分的定量采用峰面積歸一化法。
2.1.1 總酸含量和pH值
醋醅總酸的變化主要是醋醅中乙酸、乳酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、丁酸、己酸等含量的改變引起的,是評(píng)價(jià)醋酸發(fā)酵過(guò)程的決定性指標(biāo)[14]。手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程總酸含量和pH的變化見(jiàn)圖1。
圖1 手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程總酸含量和pH的變化Fig.1 Changes of total acid contents and pH during acetic acid fermentation process by manual and mechanical turning fermented grains
由圖1可知,手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程醋醅的總酸均呈上升趨勢(shì),手工翻醅總酸上升更快,但前2 d平均增長(zhǎng)速度最快,這可能是前期的醋醅適宜產(chǎn)酸微生物的生長(zhǎng)繁殖及代謝,進(jìn)而有機(jī)酸大量生成,使總酸含量迅速升高;醋酸發(fā)酵2 d之后,手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵總酸繼續(xù)上升,而機(jī)械翻醅總酸上升速度較手工翻醅慢;到發(fā)酵后期,由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有機(jī)酸的積累,使釀造環(huán)境處于高酸度、低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài),導(dǎo)致醋酸菌、乳酸菌等產(chǎn)酸菌代謝緩慢,總酸含量增長(zhǎng)速度減緩。隨著總酸含量的增加,pH值逐漸降低,但變化幅度很小,pH均只下降了0.3。手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程pH值始終維持在3.7~4.0之間,說(shuō)明兩種工藝在醋酸發(fā)酵過(guò)程中形成了一個(gè)緩沖體系,pH值始終處于動(dòng)態(tài)平衡,這與于華等[4]的研究結(jié)果一致。整體來(lái)看,與手工相比,機(jī)械翻醅降低了人力勞動(dòng),總酸含量較低于手工翻醅,pH值變化不大。
2.1.2 不揮發(fā)酸含量的變化
不揮發(fā)酸是形成老陳醋風(fēng)味的基本骨架[15]。老陳醋中含有豐富的不揮發(fā)酸,如乳酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、草酸、琥珀酸等,不揮發(fā)酸可緩沖乙酸的刺激性,使食醋酸味柔和醇厚[16-17]。手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程不揮發(fā)酸含量的變化見(jiàn)圖2。由圖2可知,手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程醋醅的不揮發(fā)酸均呈現(xiàn)先增加再趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)。發(fā)酵前2 d醋醅的不揮發(fā)酸急劇增加,可能是發(fā)酵初期醋醅接火后醋醅并未整體翻動(dòng),大部分醋醅處于厭氧狀態(tài),乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。醋酸發(fā)酵2 d之后,不揮發(fā)酸基本趨于穩(wěn)定,而機(jī)械翻醅不揮發(fā)酸含量有下降趨勢(shì),到發(fā)酵結(jié)束手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程醋醅的不揮發(fā)酸基本一致。不揮發(fā)酸含量的下降可能是由于有機(jī)酸與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)造成的,也可能是由于醋酸菌大量繁殖,乳酸被分解所致。
圖2 手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程不揮發(fā)酸含量的變化Fig.2 Changes of non-volatile acid contents during acetic acid fermentation process by manual and mechanical turning fermented grains
2.1.3 氨基酸態(tài)氮含量的變化
氨基酸態(tài)氮是食醋重要的組成部分,反映食醋中氨基酸及小肽總體水平,其含量的高低影響著食醋的質(zhì)量等級(jí)和整體風(fēng)味[18-19]。手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程氨基酸態(tài)氮含量的變化見(jiàn)圖3。由圖3可知,手工和機(jī)械工藝醋酸發(fā)酵過(guò)程中醋醅的氨基酸態(tài)氮含量均呈上升趨勢(shì),發(fā)酵前期增長(zhǎng)速度快,發(fā)酵后期氨基酸態(tài)氮的增長(zhǎng)幅度變緩。發(fā)酵前2 d氨基酸態(tài)氮的含量急劇增加,機(jī)械翻醅速度高于手工翻醅速度,可能是發(fā)酵前期微生物代謝產(chǎn)生大量酶類,原料中的蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下分解成多肽,多肽又經(jīng)肽酶作用形成氨基酸,也可能與酒精發(fā)酵結(jié)束酒醪中酵母的自溶及酒醪中酸性蛋白酶的水解有關(guān)[20]。醋酸發(fā)酵2 d之后,氨基酸態(tài)氮含量呈上升趨勢(shì)。發(fā)酵后期氨基酸態(tài)氮增長(zhǎng)幅度變緩,可能是醋酸發(fā)酵后期醋醅總酸的增加影響了蛋白酶的活性。
圖3 手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.3 Changes of amino acid nitrogen contents during acetic acid fermentation process by manual and mechanical turning fermented grains
2.1.4 還原糖含量的變化
食醋中的還原糖主要是葡萄糖和麥芽糖,原料糖化、酒化后,殘余的糖大部分被醋酸菌所利用,余下的小部分保留在最后的食醋產(chǎn)品中,起到調(diào)節(jié)食醋風(fēng)味的作用[21-22]。手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程還原糖含量的變化見(jiàn)圖4。由圖4可知,手工和機(jī)械工藝醋酸發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。醋酸發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)以醋酸菌發(fā)酵為主,多菌種共同參與的過(guò)程,發(fā)酵前期醋酸菌還未成為優(yōu)勢(shì)菌,麩皮等輔料中的淀粉被分解為還原糖,因此發(fā)酵初期前2 d還原糖含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì);醋酸發(fā)酵2 d之后,還原糖含量整體呈下降趨勢(shì)。當(dāng)醋酸菌成為發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)菌種后,醋酸菌大量繁殖,葡萄糖作為醋酸菌的碳源而被利用,因此后期還原糖呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
圖4 手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程還原糖含量的變化Fig.4 Changes of reducing sugar contents during acetic acid fermentation process by manual and mechanical turning fermented grains
兩種翻醅方式下7種有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果分別見(jiàn)表1與表2。
表1 手工翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程有機(jī)酸含量的變化Table 1 Changes of organic acid contents during acetic acid fermentation process by manual turning fermented grains
表2 機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程有機(jī)酸含量的變化Table 2 Changes of organic acid contents during acetic acid fermentation process by mechanical turning fermented grains
由表1和表2可知,兩種翻醅方式醋酸發(fā)酵過(guò)程中的主體有機(jī)酸均為乙酸和乳酸,其含量在總有機(jī)酸中所占比例高達(dá)85%以上。乳酸是主要的非揮發(fā)性酸,可以減輕醋的刺激性味道并改善風(fēng)味[23-24],所以醋酸和乳酸的比例對(duì)食醋風(fēng)味品質(zhì)很重要[25]。隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行,兩種操作方式醋醅中的乙酸均呈上升趨勢(shì),乳酸均呈下降趨勢(shì),醋酸發(fā)酵結(jié)束后兩種操作方式醋醅中,手工翻醅乙酸和乳酸含量在總有機(jī)酸中所占比例為93%,機(jī)械翻醅乙酸和乳酸含量在總有機(jī)酸中所占比例約為92%;兩種操作方式醋酸發(fā)酵過(guò)程琥珀酸呈下降趨勢(shì)。手工翻醅過(guò)程中,甲酸基本呈上升趨勢(shì)而機(jī)械翻醅變化趨勢(shì)正好相反,α-酮戊二酸呈下降趨勢(shì),檸檬酸呈上升趨勢(shì)而機(jī)械翻醅變化趨勢(shì)正好相反。
采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù),對(duì)手工和機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程中的香氣成分進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果分別見(jiàn)表3與表4。由表3可知,手工翻醅醋酸發(fā)酵階段共檢出33種香氣成分,包括4種醇類、4種酸類、8種酯類、6種醛類、4種雜環(huán)類和7種其他類。由表4可知,機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵階段共檢出35種香氣成分,包括7種醇類、4種酸類、8種酯類、1種酮類、5種醛類、2種雜環(huán)類和8種其他類。兩種操作方式醋酸發(fā)酵階段的香氣成分均以醇類、酸類、酯類為主。兩種操作方式醋酸發(fā)酵初期醇類均為主體香氣成分,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,醇類物質(zhì)的含量大幅降低;兩種操作方式的酸類物質(zhì)在醋酸發(fā)酵過(guò)程中均呈現(xiàn)上升趨勢(shì),醋酸發(fā)酵結(jié)束后酸類物質(zhì)成為主體香氣成分,手工翻醅的酸類物質(zhì)相對(duì)占比高于機(jī)械翻醅。兩種操作方式的酯類物質(zhì)在醋酸發(fā)酵過(guò)程中均呈現(xiàn)上升趨勢(shì),醋酸發(fā)酵結(jié)束后手工操作方式的酯類物質(zhì)相對(duì)占比低于機(jī)械操作方式。
表3 手工翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程香氣成分的變化Table 3 Changes of aroma components during acetic acid fermentation process by manual turning fermented grains
表4 機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程香氣成分的變化Table 4 Change of aroma components during acetic acid fermentation process by manual turning fermented grains
本研究對(duì)老陳醋手工與機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵過(guò)程中的理化指標(biāo)、有機(jī)酸及香氣成分進(jìn)行檢測(cè)分析,結(jié)果表明,兩種操作方式在醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸、不揮發(fā)酸、氨基酸態(tài)氮含量均呈上升趨勢(shì),pH值的變化幅度很小,始終維持在3.7~4.0之間,還原糖呈先上升后下降的趨勢(shì);乳酸和乙酸為醋酸發(fā)酵過(guò)程中的主體有機(jī)酸,二者占有機(jī)酸總量的85%以上,在醋酸發(fā)酵過(guò)程中兩種操作方式的乙酸均呈上升趨勢(shì),乳酸均呈下降趨勢(shì),其他5種有機(jī)酸的變化趨勢(shì)有一定的差異,兩種操作方式醋酸發(fā)酵階段檢測(cè)出的香氣成分總數(shù)相差不大,但種類有一定的差異。手工翻醅醋酸發(fā)酵階段共檢出33種香氣成分,包括4種醇類、4種酸類、8種酯類、6種醛類、4種雜環(huán)類和7種其他類。機(jī)械翻醅醋酸發(fā)酵階段共檢出35種香氣成分,包括7種醇類、4種酸類、8種酯類、1種酮類、5種醛類、2種雜環(huán)類和8種其他類。兩種操作方式醋酸發(fā)酵階段香氣成分的組成均以酸類、醇類、酯類為主,機(jī)械翻醅醋醅風(fēng)味較優(yōu)于手工翻醅。