11種國產(chǎn)高鹽稀態(tài)醬油的氨基酸組分和揮發(fā)性物質(zhì)的特征性分析

戴璐瑤，許睿琦，蘇志林，陳書婧，吳昊霖，吳劍榮*

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

醬油是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，我國生產(chǎn)醬油的歷史已長達(dá)兩千多年[1]，如今傳統(tǒng)醬油的生產(chǎn)工藝和原料受到歷史發(fā)展[2]、地理條件以及飲食習(xí)慣的影響，已經(jīng)具有明顯的地域差異[3]，不同地區(qū)逐漸形成獨具特色的流派[4-7]。廣式醬油起源于以廣東為主的珠江三角洲地區(qū)[8]，是中國傳統(tǒng)釀造醬油的一個重要流派[9]。現(xiàn)代廣式高鹽稀態(tài)醬油在日式醬油生產(chǎn)技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行創(chuàng)新，以大豆和小麥粉為主要原料，采用大型圓盤制曲、深層稀醪發(fā)酵和壓榨提取與滅菌等工藝[4，10]。在發(fā)酵和陳化過程中，原料中的蛋白質(zhì)降解為谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸，而多糖降解為葡萄糖等單糖，進(jìn)而影響醬油的風(fēng)味和口感[11]。

風(fēng)味品質(zhì)對消費者的接受度和偏好性起著至關(guān)重要的作用，風(fēng)味主要是由產(chǎn)品的香味和滋味特征決定的，與醬油中的揮發(fā)性化合物和氨基酸有關(guān)[12]。醬油發(fā)酵過程中，微生物所分泌的酶催化蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的氨基酸是醬油的重要組成部分[13]，是評價我國醬油質(zhì)量等級的重要指標(biāo)，具有改善醬油口感和功能的作用。醬油中的揮發(fā)性香氣成分是決定其質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一[10]，醇、酯、酸、酚、醛、酮、吡嗪、呋喃等香氣物質(zhì)使得醬油具有獨特的風(fēng)味體系和調(diào)味效果[14]。醬油中的揮發(fā)性物質(zhì)品目繁多，呈香機(jī)制錯綜復(fù)雜，大部分揮發(fā)性成分在醬油中的含量極低，但由于其閾值較低，對醬油的風(fēng)味具有極其重要的貢獻(xiàn)作用[11]。

得益于珠三角的充足陽光和高溫，所釀制醬油因其醬香、豉香濃郁，風(fēng)味獨特，越來越受到消費者的青睞[15]。而我國其他不同省市也有企業(yè)采用高鹽稀態(tài)釀造醬油工藝，由于緯度高，主要采用類似日式工藝，這些不同地區(qū)的高鹽稀態(tài)醬油在風(fēng)味品質(zhì)方面存在一定區(qū)別[16]。目前對不同類型的醬油進(jìn)行分類鑒別的研究有很多，如CHEN Y Q等[17]通過9種理化指標(biāo)結(jié)合聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘分析等多元統(tǒng)計方法，對不同工藝和地域的醬油實現(xiàn)了鑒別；ZHU L等[18]通過紅外光譜構(gòu)建醬油糖類、蛋白質(zhì)和氨基酸等整體營養(yǎng)指紋圖譜結(jié)合偏最小二乘分析能夠快速判別不同種類的醬油；XU L B等[19]通過28種揮發(fā)性物質(zhì)含量結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析對15個驗證集樣品檢驗，結(jié)果表明可根據(jù)發(fā)酵程度和地理區(qū)域成功進(jìn)行分類，預(yù)測準(zhǔn)確率為100%。

本研究以不同產(chǎn)地的廣式和非廣式高鹽稀態(tài)醬油為研究對象，解析高鹽稀態(tài)醬油中氨基酸組成和揮發(fā)性組分，利用偏最小二乘判別分析建立廣式醬油的產(chǎn)地溯源模型，確定廣式醬油的有效溯源指標(biāo)?；卺u油中的揮發(fā)性組分解析高鹽稀態(tài)廣式醬油風(fēng)味的獨特性，對實現(xiàn)廣式醬油的產(chǎn)品保護(hù)和區(qū)分具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

11種國產(chǎn)高鹽稀態(tài)醬油樣品：均購自無錫市超市。其中6種非廣式醬油（NG），編號分別為S1（氨基酸態(tài)氮≥1.1 g/100 mL）、S2～S5（氨基酸態(tài)氮≥1.2 g/100 mL）、S6（氨基酸態(tài)氮≥0.7 g/100 mL）；5種廣式醬油（G），編號為S7（氨基酸態(tài)氮≥1.25 g/100 mL）、S8～S10（氨基酸態(tài)氮≥1.0 g/100 mL）、S11（氨基酸態(tài)氮≥1.2 g/100 mL）。

萬字烹調(diào)用濃口醬油（特級，氨基酸態(tài)氮≥0.80g/100mL）：日本龜甲萬株式會社；萬字純釀造醬油（特級，氨基酸態(tài)氮≥0.80 g/100 mL）：昆山統(tǒng)萬微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、Agilent Hypersil ODS色譜柱：美國Agilent公司；TSQ8000三重四級桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 醬油中氨基酸的測定

樣品預(yù)處理：用三氯醋酸（trichloroacetic acid，TCA）稀釋醬油樣品，使稀釋液中TCA終含量為5%，靜置3 h后用濾紙過濾，取1 mL濾液于1.5 mL離心管中，在15 000 r/min離心30 min，取上清，過0.22 μm水膜，裝入液相瓶中用于檢測。

HPLC條件：Agilent Hypersil ODS色譜柱（5 μm，4.0 mm×250 mm）；樣品檢測采用OPA-FMOC柱前衍生。流動相A和流動相B配制參考文獻(xiàn)[20]的方法。采用梯度洗脫，流動相流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；紫外檢測波長：338 nm，脯氨酸在波長262 nm處檢測；氨基酸根據(jù)保留時間進(jìn)行定性，含量以外標(biāo)法定量。

1.3.2 揮發(fā)性組分的檢測

樣品前處理：稱取5.00 g樣品于15 mL樣品瓶中，添加10 μL的2-辛醇（50 mg/L）作為內(nèi)標(biāo)，加蓋密封待檢。在60 ℃恒溫預(yù)熱15 min。將CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶萃取30 min，萃取后再插入進(jìn)樣口，解吸4 min。

氣相色譜條件：TG-WAXMS A石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序為起始柱溫40 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升至230 ℃，保持8 min。載氣為高純氦氣（He），恒流模式，流速1.2 mL/min，進(jìn)樣溫度270 ℃。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；質(zhì)譜掃描范圍45～400 amu；質(zhì)譜接口溫度200 ℃，采用不分流模式。

定性定量方法：質(zhì)譜數(shù)據(jù)與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）標(biāo)準(zhǔn)譜庫2014進(jìn)行比對鑒定，再結(jié)合相同分析條件下正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的出峰情況計算出各個峰的相對保留指數(shù)，與文獻(xiàn)報道的保留指數(shù)對比綜合定性。使用Xcalibur軟件對GC-MS的結(jié)果進(jìn)行處理，各揮發(fā)性化合物的相對含量采用峰面積歸一法計算。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理每個樣品做3個平行，結(jié)果取平均值，采用Origin 2020軟件進(jìn)行繪圖析。醬油中氨基酸特征采用稀疏偏最小二乘-判別分析（sparse partial least squares-discriminant analysis，sPLS-DA）模型進(jìn)行分析。GC-MS測定結(jié)果用SIMCA 14.0對樣品中揮發(fā)性成分的相對含量進(jìn)行偏最小二乘-判別分析法（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高鹽稀態(tài)醬油的氨基酸的特征性分析

2.1.1 高鹽稀態(tài)醬油的氨基酸含量與組成

生產(chǎn)醬油原料中的蛋白質(zhì)逐漸水解成的多肽和氨基酸，慢慢形成醬油特有的風(fēng)味和口感[21]。在評估食品的營養(yǎng)價值時，氨基酸在食品中占有舉足輕重的地位[22]。不同食物蛋白的氨基酸組成比例不同，其營養(yǎng)價值的高低與所含的氨基酸種類、必需氨基酸的含量及比例等因素有關(guān)[23]。利用高效液相色譜法檢測11個不同品牌高鹽稀態(tài)醬油的氨基酸含量，結(jié)果見表1。

表1 不同醬油樣品中的游離氨基酸含量Table 1 Free amino acid contents in different soy sauce samples mg/mL

由表1可知，同一樣品中不同氨基酸的含量差異巨大。根據(jù)氨基酸總含量排序，不同品牌醬油樣品依次是S5＞S3＞S7＞S9＞S4＞S2＞S10＞S11＞S1＞S8＞S6，其含量為55.86～121.06 mg/mL。

一般來說，根據(jù)發(fā)酵醬油的生產(chǎn)工藝，谷氨酸占總氨基酸的比例約為18%～25%[24]，但在所有樣品中，谷氨酸的比例超過30%，故而認(rèn)為所有樣品均加入增鮮劑谷氨酸鈉。排除谷氨酸的影響后，所有樣品中16種不同氨基酸占總氨基酸的比例見圖1。

圖1 不同醬油樣品中游離氨基酸占總氨基酸含量的比例Fig.1 Ratio of free amino acids and total amino acids in different soy sauce samples

由圖1可知，不同醬油樣品的游離氨基酸比例有所差異，Asp、Leu、Ala比例最高，占7%～15%；Ser、Val、Ile、Phe、Lys和Pro比例較高，占6%～8%；Gly、Thr次之，占4%～6%；Tyr、Met、His、Arg比例最低，約為1%～3%；His、Gly、Thr、Phe、Ser、Met、Ala、Lyr、Val、Glu等氨基酸在廣式醬油和非廣式醬油之間有明顯差異。

2.1.2 醬油中必需氨基酸的分析

必需氨基酸是衡量人類膳食蛋白質(zhì)品質(zhì)的重要指標(biāo)，醬油中含有構(gòu)成人體蛋白質(zhì)的所有必需氨基酸[25]，這表明醬油是人類攝取必需氨基酸的重要飲食途經(jīng)。由于HPLC無法定量色氨酸，所以僅評價其余7種必需氨基酸對醬油的營養(yǎng)價值。由表2可知，S1樣品含量最高（28.61 mg/mL），S9樣品含量最低（11.59 mg/mL）。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（food and agriculture organization of the united nations，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）以人體不同必需氨基酸的含量為參考，規(guī)定攝入人體的蛋白質(zhì)中必需氨基酸占總氨基酸40%，必需氨基酸占非必需氨基酸60%[26]，它是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)中氨基酸的理想配比。在本研究采集的樣品中，前者的比例為11.00%～32.52%，后者的比例為12.36%～48.19%，S1醬油樣品的氨基酸比例最接近這兩個數(shù)值，說明其營養(yǎng)價值在所有樣品中最高。按照FAO/WHO對必需氨基酸的含量對不同品牌醬油樣品質(zhì)量進(jìn)行排序，從高到低依次為S1＞S6＞S4＞S2＞S11＞S8＞S10＞S7＞S3＞S5＞S9。不同品牌醬油中7種必需氨基酸占總氨基酸的百分比見表2。

由表2可知，11種醬油樣品中絕大多數(shù)樣品必需氨基酸的比例不能達(dá)到WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)譜規(guī)定的含量，尤其是Met的含量（0.60%～1.67%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于規(guī)定的3.5%，說明醬油中Met的含量普遍較低。S1樣品中的必需氨基酸含量最高，Thr、Lys的含量接近WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)，而Val、Ile、Leu的含量滿足WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)，說明其氨基酸營養(yǎng)價值明顯優(yōu)于其他樣品，進(jìn)一步證明了醬油S1的質(zhì)量較高。

2.1.3 醬油中呈味氨基酸的分析

不同品牌醬油滋味的差別取決于其所含的各種呈味氨基酸，醬油風(fēng)味的優(yōu)劣取決于呈味氨基酸的含量和比例。根據(jù)味道的差異可以將氨基酸分為鮮味氨基酸（Asp、Glu）、甜味氨基酸（Gly、Ala、Ser、Pro、Thr）和苦味氨基酸（Tyr、Phe、Val、Leu）[23]。不同醬油中呈味氨基酸的測定結(jié)果見表3。由表3可知，在醬油中呈味氨基酸的含量從大到小依次為鮮味類、甜味類和苦味類。鮮味氨基酸的含量最高，11種樣品里的含量均在42%以上，因而對醬油的風(fēng)味貢獻(xiàn)也最大，其中Glu含量最高，為33.65%～78.39%；甜味氨基酸的含量次之，為9.28%～23.50%；苦味氨基酸的含量最低，為5.77%～18.14%。其中，Phe和Tyr具有特殊的香氣，能夠為醬油提供特殊風(fēng)味。通過分析能夠得出醬油的滋味以鮮味氨基酸為主，甜味氨基酸為輔，而醬油的香味則與芳香族氨基酸Phe和Tyr有關(guān)，醬油鮮美的滋味與醇厚的香味與這些呈味氨基酸密切相關(guān)。

2.1.4 基于氨基酸成分建立不同產(chǎn)地醬油sPLS-DA辨別模型

使用稀疏PLS-DA（sPLS-DA）算法可用于有效減少高維代謝組學(xué)數(shù)據(jù)中的變量（代謝物）數(shù)量，以產(chǎn)生穩(wěn)健且易于解釋的模型，可以通過控制模型中的組分?jǐn)?shù)量和每個組分中的變量數(shù)量來控制模型的稀疏程度。先對各個氨基酸根據(jù)sPLS解釋成分方差分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，成分1（Phe、Gly、Ser、Ala、Val、Tyr、Met、T、Glu、Thr等氨基酸有較大的權(quán)重）方差為18.3%，成分2（Gly、Val、Tyr、E、Lys、Arg等氨基酸有顯著的權(quán)重）方差為15.9%，成分3（和E/T有關(guān)）方差21.4%，成分4（和E/N有關(guān)）方差17%，成分5（與Gly、A以及E/T、E/N有關(guān)的氨基酸有顯著關(guān)聯(lián)性）方差14.4%。各個主成分的含量集中在20%左右（14.4%～21.4%），較為均衡，所以模型可信度較高，主成分降維效果較好。

圖2 稀疏偏最小二乘法-判別分析解釋成分方差分析Fig.2 Variance analysis of sparse partial least squares-discriminant analysis interpretive component

以這幾個主成分來對醬油進(jìn)行分類，結(jié)果見圖3。由圖3可知，95%置信區(qū)間重疊較小，對11個樣品進(jìn)行非廣式與廣式區(qū)分效果較好。廣式醬油的發(fā)酵過程比非廣式醬油的發(fā)酵過程復(fù)雜，經(jīng)歷陽光房曝曬過程，從而確保氨基酸的完整性和多樣性；非廣式醬油的較高緯度和陽光照射強(qiáng)度低等因素可能導(dǎo)致了兩種醬油成分出現(xiàn)較大差異。

圖3 稀疏偏最小二乘法-判別分析二維得分圖Fig.3 Two-dimensional score diagram of sparse partial least squares-discriminant analysis

sPLS-DA模型為特定成分選擇的變量圖見圖4。變量是按其負(fù)荷的絕對值排列的。使用交叉驗證（cross variation，CV）評估的sPLS-DA模型的性能圖，使用指定數(shù)量的變量創(chuàng)建的成分?jǐn)?shù)量增加。

圖4 交叉驗證模型載荷（a）和稀疏偏最小二乘法-判別分析分類誤差率（b）Fig.4 Cross-validate model load(a)and sparse partial least squaresdiscriminant analysis classification error rate (b)

由圖4可知，以成分1、2、3、5作為劃分廣式、非廣式的依據(jù)誤差率均為45.5%，以成分4劃分誤差率為36.4%。廣式醬油中苯丙氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸含量較低，非廣式醬油中甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、谷氨酸、蘇氨酸含量較低[27]。

2.2 基于揮發(fā)性物質(zhì)建立不同產(chǎn)地醬油PLS-DA判別模型

進(jìn)一步對不同品牌醬油中的揮發(fā)性物質(zhì)含量進(jìn)行偏最小二乘判別分析，以探究廣式醬油與非廣式醬油揮發(fā)性成分的差異。在11種醬油樣品中共檢測到240種揮發(fā)性物質(zhì)，通過過濾50%以上的樣品中都沒有檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)一共得到91種揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)果見表4。

表4 不同醬油樣品中揮發(fā)性成分含量Table 4 Volatile components contents in different soy sauce samples%

將廣式醬油與非廣式醬油的11個樣品得到的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析。以表4中的91種揮發(fā)性物質(zhì)含量為X變量，以樣品的種類為Y變量，對樣本進(jìn)行PLS-DA分析，構(gòu)建溯源模型。PLS-DA模型中，該模型中R2X和R2Y分別表示在X軸方向和Y軸方向上對變量的解釋能力，Q2表示模型對分組的預(yù)測能力[22]，該模型中R2X、R2Y和Q2分別為0.443、0.932、0.666，說明建立的PLS-DA模型能有效解釋廣式醬油不同產(chǎn)區(qū)之間的差異，且該模型的產(chǎn)地識別預(yù)測精度可達(dá)到93.2%。PLS-DA模型第1、第2主成分得分圖見圖5。

圖5 基于揮發(fā)性物質(zhì)不同醬油樣品偏最小二乘法-判別分析模型得分圖Fig.5 Score plot of partial least squares-discriminant analysis model of different soy sauce samples based on volatile components

由圖5可知，廣式醬油與非廣式醬油樣本完全分離，分類效果好。PLS-DA模型載荷圖見圖6。

圖6 基于揮發(fā)性物質(zhì)不同醬油樣品偏最小二乘法-判別分析模型載荷散點圖Fig.6 Loading scatter plot of partial least squares-discriminant analysis model of different soy sauce samples based on volatile components

由圖6可知，C8（2,6-二甲基吡嗪）、C49（甲醇）、C64（呋喃）、C44（辛乙烯二醇單正十二烷基酯）、C1（山梨酸）、C36（2-丁酮）、C7（鄰甲氧基苯酚）與廣式醬油相關(guān)性較高。C87（（2R,3R）-2,3-丁二醇）、C39（2,3,5,6-四甲基吡嗪）與非廣式醬油相關(guān)性較高。

變量重要性投影（variable important in the projection，VIP）值能夠量化PLS-DA的各個變量（X變量）對樣品分類判別（Y變量）的貢獻(xiàn)程度，VIP＞1的變量被認(rèn)為是貢獻(xiàn)較大的變量[28]。由圖7可知，PLS-DA的VIP得分有36個變量的VIP值＞1，其中C82（十二烷）、C8（2,6-二甲基吡嗪）、C48（辛酸乙酯）、C36（2-丁酮）、C39（2,3,5,6-四甲基吡嗪）、C7（鄰甲氧基苯酚）、C1（山梨酸）、C47（5-甲基-2-己酮）、C49（甲醇）、C88（十八酸乙酯）、C87（（2R,3R）-2,3-丁二醇）是對樣品分類有較大貢獻(xiàn)的物質(zhì)（VIP＞1.5），說明這11種物質(zhì)是區(qū)別廣式醬油與非廣式醬油的重要揮發(fā)性成分。

圖7 偏最小二乘法-判別分析模型的變量重要性投影值Fig.7 Variable important in projection values of partial least squares-discriminant analysis model

從上述分析結(jié)果來看，兩個模型都能較好區(qū)分國內(nèi)的廣式醬油和非廣式醬油。目前國內(nèi)非廣式醬油大多采用類似日本龜甲萬公司的醬油工藝，即在深層發(fā)酵時就加入酵母菌以產(chǎn)生較多風(fēng)味。分別測試兩種龜甲萬醬油（日本進(jìn)口和蘇州龜甲萬）的特征風(fēng)味參數(shù)，發(fā)現(xiàn)龜甲萬醬油中乙醇含量較高。另外，兩種龜甲萬醬油中乙酸乙酯、異戊醇、苯乙醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚等含量較高，而龜甲萬醬油中2,3-丁二醇和2,3,5,6-四甲基吡嗪含量很低，與國產(chǎn)非廣式醬油的揮發(fā)性組成特征不太一致。

3 結(jié)論

本研究分析了11種國產(chǎn)高鹽稀態(tài)醬油中的17種氨基酸含量（不計谷氨酸含量），天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸含量最高，占8%～14%；醬油中鮮味類氨基酸對醬油的滋味貢獻(xiàn)最大。用sPLS-DA模型進(jìn)行氨基酸分類辨別分析發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸在非廣式中含量較高；甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸在廣式成分中占比較高。分析不同產(chǎn)地來源的高鹽稀態(tài)醬油揮發(fā)性成分，共檢測到91種香氣物質(zhì)，采用偏最小二乘法進(jìn)行判別分析，對醬油產(chǎn)地識別預(yù)測精度可達(dá)到93.2%。其中，2,6-二甲基吡嗪、甲醇、呋喃、辛乙烯二醇單正十二烷基酯、山梨酸、2-丁酮、鄰甲氧基苯酚等8種揮發(fā)性成分與廣式醬油相關(guān)性較高；而（2R,3R）-2,3-丁二醇和2,3,5,6-四甲基吡嗪與非廣式醬油相關(guān)性較高。