濃香型白酒窖內不同空間位置原酒風味物質初步分析

王 軒，張 鯤*，秦 輝，蔡小波，孔 翔，劉林培，何 旭，陳 勇，甘健君，曾茂闖

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部可再生能源開發(fā)與利用重點實驗室，四川 成都 610041）

濃香型白酒是以泥窖為發(fā)酵容器，經(jīng)續(xù)糟配料、多菌密閉共酵模式生產(chǎn)出的蒸餾酒[1]。原酒作為酒醅發(fā)酵結束后提取濃縮得到的最終產(chǎn)物，其成分主要為乙醇、水以及含量在2%左右的風味物質，雖然這些風味物質含量占比較少，但是對酒的風格具有重要影響[2]。原酒的品質、風味、出酒率與酒醅中釀酒微生物多樣性密切相關。酒醅中的微生物來源主要是大曲、生產(chǎn)環(huán)境以及窖池，由于窖池是一個密閉的生態(tài)環(huán)境，研究表明窖底泥中微生物多樣性與窖壁泥存在明顯差異，發(fā)酵過程中不同醅層的微生態(tài)環(huán)境存在一定差異，在微生物區(qū)系的演變過程中產(chǎn)生代謝物質差異，導致不同醅層所產(chǎn)原酒的酒質不同[3-4]。鄭佳等[5]研究發(fā)現(xiàn)，窖泥中香氣物質含量與其所處窖池空間位置有關，如上層、中層、下層與窖底的窖泥香氣成分組成存在明顯的差異，己酸乙酯、己酸、丁酸、乙酸等物質隨窖池深度增加而增加，也從側面反映出不同空間位置原酒風味物質存在差異。

濃香型白酒的典型特征風味化合物包括己酸、乙酸、丁酸和乳酸及其相應的乙酯，其中己酸乙酯和己酸對其典型風味貢獻最大[6]。段明松等[7]的研究表明，下層原酒中風味物質的含量最高，其中己酸乙酯、正己醇、異戊醇、正丁醇和己酸等主要風味物質含量依次高于中層、上層原酒。沈才萍等[8]的研究顯示，不同空間位置發(fā)酵糟醅產(chǎn)酒產(chǎn)質并不相同，上層產(chǎn)酒率高但質量較差，中層產(chǎn)酒率低質量較好，下層產(chǎn)酒率高且質量好。尹倩倩等[9]的研究顯示，上、下層原酒主要風味物質含量存在差異，利用正交偏最小二乘判別分析（orthogonalpartialleastsquares-discriminationanalysis，OPLS-DA）模型確定己酸乙酯、乳酸乙酯和正丁醇等15種物質為上下層原酒主要差異風味物質，通過相關性分析確定氧氣為造成上下層原酒風味差異的關鍵因子。馬世源等[10]運用PLS-DA結合氣味活性值（odor activity value，OAV）分析顯示，己酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸丁酯為上、下醅層原酒共有的關鍵特征風味物質。以上研究表明，不同空間位置原酒之間存在一定差異，由于窖池空間的特殊性，其深度往往超過2 m，僅對上、下兩層原酒的風味物質進行分析還不能完全體現(xiàn)窖池空間的差異性，因此還需要深入挖掘不同空間位置原酒，如上、中、下層原酒的之間的典型風味物質以及差異性分析，為后續(xù)深入研究提供理論依據(jù)。

本研究采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用技術對上、中、下層原酒風味物質進行檢測，利用層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析等多元統(tǒng)計方法對不同空間位置原酒之間的風味物質構成特點和差異進行分析，為揭示濃香型白酒不同空間位置發(fā)酵特點提供數(shù)據(jù)支撐及控制原酒品質提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣取自瀘州某酒廠，選取9口老窖池（窖齡40年左右，封窖采用不銹鋼蓋），待發(fā)酵期結束后，由經(jīng)驗豐富的摘酒工進行分段摘酒。氫氧化鈉、無水乙醇、濃硫酸等（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；乙酸正戊酯、叔戊醇、2-乙基正丁酸等標準品（色譜純）：上海安譜有限公司。

1.2 儀器與設備

STO210pH計：奧豪斯儀器（上海）有限公司；DL-1000W電子萬用爐：北京市永光明電器制造有限公司；7890A-5975B Agilent氣相色譜-質譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 摘酒工藝

一段酒：從第一滴酒餾出開始，摘酒量為3 kg；二段酒：從二段酒的第一滴酒開始到酒花從“豌豆花”轉為“口水花”時，為二段酒，混勻取樣；三段酒：從第三段的第一滴酒開始到酒花從“口水花”轉為“斷花”時，為第三段酒。四段酒：從第四段的第一滴酒開始到酒花從“斷花”到表面油珠鋪滿截止，為第四段酒。分別取上層糟源的2段酒樣共9個，編號為（A-S～I-S）、中層糟源的2段酒樣共9個，編號為（A-Z～I-Z）、下層糟源的2段酒樣共9個，編號為（A-X～I-X），進行理化分析和色譜分析，分別測定上層、中層、下層9個樣本的平均值，分別以編號S-2、Z-2、X-2表示。

1.3.2 理化指標檢測

酒樣總酸、總酯測定：參考GB/T 10345—2022《白酒分析方法》。

1.3.3 揮發(fā)性風味物質的定性與定量分析

參考T/CBJ 002—2016《固態(tài)法濃香型白酒原酒》采用氣相色譜法測定揮發(fā)性風味物質。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

為探究不同醅層原酒風味物質的差異，利用Metabo-Analyst進行HCA；利用Origin（2018）進行PCA；采用SIMCA（14.1）進行OPLS-DA，分別建立模型，觀察組間分離情況，并找尋組間差異物質。利用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行方差分析，顯著性界值P＜0.05，從而判斷數(shù)據(jù)差異。

2 結果與分析

2.1 原酒理化指標分析

通過對上、中、下層原酒的總酸及總酯含量進行檢測，結果見圖1。由圖1可知，上層、中層、下層原酒總酸、總酯含量逐層遞增，下層原酒總酸含量為（1.56±0.28）g/L，與上層、中層原酒存在顯著差異（P＜0.05）。下層原酒總酯含量分別（4.27±0.64）g/L，與上層、中層原酒存在顯著差異（P＜0.05）?？傰プ兓?guī)律與沈才萍等[8]的研究結果較為一致，可能原因是中、下層糟醅較早進入?yún)捬醢l(fā)酵，且黃水逐漸滲透，酸醇酯化反應，因此總酯含量顯著遞增（P＜0.05）。文獻中指出上層糟醅與封窖泥接觸，發(fā)酵前期酵母和霉菌占優(yōu)，利于糖化，淀粉糖化產(chǎn)物主要轉化為酒精和產(chǎn)酸，因此總酸含量較高。但本次結果總酸變化卻存在一定差異，可能原因是本次取樣窖池封窖裝置為不銹鋼蓋，與封窖泥存在一定差異。

圖1 酒樣總酸和總酯含量的測定結果Fig.1 Determination results of total acid and ester contents of liquor samples

2.2 原酒風味物質分析

通過對上層、中層、下層酒樣共27個原酒樣品中風味物質進行檢測，共檢測出42種風味物質，其中酯類15種，醇類10種，酸類8種，其他類9種，檢測到的物質使用內標法計算含量后繪制熱圖，以展示不同空間位置原酒中風味物質的差異，結果見圖2。將各類揮發(fā)性風味物質含量進行分析，結果見圖3。

由圖2可知，酒樣樣本被分為2個大類，上層與中層原酒聚為一類，下層原酒聚為一類，除少數(shù)樣本未能形成較好的區(qū)分，其余樣本均有較好的分類。由圖2與圖3可知，上層、中層、下層原酒各類風味物質構成比較相似，且均是酯類物質含量最高。酯類物質是濃香型白酒中重要的呈香物質，具有花果香，其種類和含量差異賦予濃香型白酒風味的特征性及多樣性。酯類物質由酰基輔酶A和醇乙酰轉移酶的共同作用下進行生物合成，或者由酸類、醇類物質在酯化酶、脂肪酶等酶類物質協(xié)同催化作用下合成[11]。上層、中層、下層原酒酯類物質含量逐層遞增。下層原酒中己酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、乙酸乙酯含量分別為2565.52 mg/L、153.87 mg/L、42.45 mg/L、2 214.26 mg/L，是中層原酒的1.21倍、2.11倍、1.64倍、1.37倍；是上層原酒的2.59倍、2.89倍、2.11倍、1.26倍。由于窖壁上、中、下層和窖底因微生物群落存在差異，如上層窖壁泥不會接觸到黃水，而黃水線以下的窖泥長期浸泡在黃水中，從而導致不同位置窖泥的微生物群落存在一定差異[12]。張朝正等[13]發(fā)現(xiàn)相同窖齡池底泥的微生物群落多樣性高于池壁泥，從而促進下層糟醅中丁酸乙酯和己酸乙酯的生成。

白酒中的醇類香氣物質以高級醇為主，高級醇對酒的風格以及飲用的舒適度起到重要影響，適量的高級醇可提高酒的厚重感并增加酒的協(xié)調性[14]。醇類物質為發(fā)酵過程中氨基酸脫氨或糖脫羧反應的結果，同時也是酯類物質生成的前體物質[15]。下層原酒中正己醇、正丁醇、正丙醇分別為186.96 mg/L、688.50 mg/L、318.15 mg/L，是中層原酒的2.05倍、1.96倍、1.33倍；是上層原酒的3.19倍、3.13倍、1.49倍。而上層原酒中3-甲基丁醇（異戊醇）為317.15 mg/L，是中層、下層原酒的1.10倍、1.19倍。有研究表明，白酒中高級醇的合成與酵母、梭菌等的物質代謝有關，如濃香型白酒發(fā)酵過程形成正丁醇的主要微生物是貝氏梭菌（Clostridium beijerinckii），該丁醇產(chǎn)生菌通過糖代謝合成途徑（Harris途徑）合成，且該菌在窖壁泥中的含量決定了窖池中正丁醇生成量[16]；少孢哈薩克斯坦酵母（Kazachstania）與濃香型白酒中正丙醇的合成有關[17]。白酒發(fā)酵過程中，上層糟醅的產(chǎn)酒率要更高一些，同時3-甲基丁醇（異戊醇）和異丁醇的生成與乙醇發(fā)酵呈正相關關系，以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為代表的酵母菌可以通過氨基酸合成代謝途徑（Harris途徑）和氨基酸分解代謝途徑（Ehrlich途徑）合成異戊醇[18-19]，這可能是上層原酒中3-甲基丁醇（異戊醇）比中下層原酒高的原因。

白酒中的有機酸是重要的呈香呈味物質，適量的有機酸會使酒體更加協(xié)調，酸含量偏低，酒味寡淡，余味較短；酸含量高則酒體較粗糙[20]。酸類物質主要是微生物利用淀粉、蛋白質等物質通過一系列生化反應生成，它不僅可以助香、維持酯類物質合成平衡、改善白酒風味，同時還具有提升白酒健康成分的作用[10]。研究顯示，在發(fā)酵結束時下層酒醅中的有機酸含量均比上、中層酒醅高[9，21]。下層原酒中己酸、丁酸、乙酸的含量分別為166.16 mg/L、127.06 mg/L、872.14 mg/L，是中層原酒的1.87倍、2.07倍、1.23倍；是上層原酒的2.56倍、3.60倍、1.34倍。WANG C D等[22]報道乳酸桿菌屬的相對豐度隨窖池深度增加而減小，梭菌屬隨窖池深度而增加。產(chǎn)甲烷古菌與梭狀芽孢桿菌科微生物之間的協(xié)同關系和種間電子傳遞，可以促進梭菌科微生物的生長。研究表明，梭菌科微生物能將有機質轉化為酸類物質，如丁酸和己酸[23]。同時由于黃水在發(fā)酵過程中不斷自然下滲，也導致下層糟醅中酸類等物質的含量高于上層、中層。

其他類物質含量也隨窖池深度增加而增加。乙縮醛具有奶酪香氣，對白酒風味有積極的貢獻作用；乙醛具有辛辣、醚樣氣味，稀釋后具有果香、咖啡香、酒香、青香。在各醅層中含量呈遞增的趨勢。3-羥基-2-丁酮呈水果香、霉腐味和木香，在各醅層中含量分別為9.89 mg/L、14.03 mg/L、17.55 mg/L。它可由雙乙酰還原得到，同時也有學者推測認為3-羥基-2-丁酮可以作為酒體風味物質的前體物質，與其他代謝物共同作用生成特殊特征風味物質，如可能生成四甲基吡嗪[24]。

2.3 主成分分析結果

通過PCA可初步了解樣品組間和組內之間的相似性或差異度大小，不同空間位置原酒揮發(fā)性成分PCA結果見圖4。

圖4 不同空間位置原酒揮發(fā)性風味成分主成分得分圖Fig.4 Principal component scores of volatile flavor components in original liquor at different spatial positions

由圖4可知，上層原酒主要分布在橫坐標以下，與中層、下層原酒樣本組間分離趨勢明顯，這說明雖然三種不同空間位置原酒的風味物質種類以及數(shù)量較為一致，但含量方面存在明顯差異。同時，從組內差異上來看，下層部分酒樣與中層部分酒樣位置也比較接近，結果與聚類分析較為一致?？赡苡捎诒敬谓殉氐姆饨逊绞讲捎玫氖遣讳P鋼蓋，在微生物的多樣性以及含量上與傳統(tǒng)封窖泥存在較大差異，并且中、下層酒醅接觸氧氣的機會最少，厭氧功能微生物代謝最強烈，并且黃水的不斷沉積，導致中、下層原酒質量與上層原酒質量明顯不同。由圖2聚類熱圖與圖4不同空間位置酒樣PCA顯示有部分樣本較為接近，出現(xiàn)這一原因可能是，雖然9口窖池所采用的原輔料、生產(chǎn)工藝均是一致的，但是由于樣本來自9口不同的窖池，可能受每個窖池釀酒性能的不同而導致出現(xiàn)這一情況。

2.4 不同醅層原酒揮發(fā)性成分正交偏最小二乘分析

2.4.1 上層原酒與中層原酒揮發(fā)性成分正交偏最小二乘分析為進一步探討不同醅層原酒之間的差異化合物，將上層原酒與中層原酒風味物質數(shù)據(jù)進行OPLS-DA，結果見圖5。判別模型中擬合優(yōu)度R2和預測優(yōu)度Q2分別表示在隨機化Y變量模型下對數(shù)據(jù)的解釋程度和對模型的預測能力，通過計算，本實驗模型Y軸累積解釋率R2Y=0.896，Q2=0.637，說明該模型擬合效果較好。

圖5 上層與中層原酒揮發(fā)性風味成分OPLS-DA結果Fig.5 OPLS-DA results of volatile flavor components in the upper and middle layers of the original liquor

由圖5A可知，上層原酒與中層原酒沿橫坐標有明顯區(qū)分，上層原酒分布在置信區(qū)間左側，中層原酒分布在置信區(qū)間右側，說明上層與中層原酒之間風味物質存在明顯差異。同時，為驗證該模型是否過度擬合數(shù)據(jù)，進行置換檢驗（n=200）；由圖5B可知，R2=0.623，Q2=-0.538，Q2＜0表明此模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，模型預測能力良好[26]。變量重要性投影（variable importance in project，VIP）值可用于衡量各代謝物積累差異對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，VIP≥1為常見的差異代謝物篩選標準[27]；由圖5C可知，共有15種風味物質VIP值＞1，分別是己酸乙酯（2.20）、正己醇（2.02）、正丁醇（1.81）、正戊醇（1.62）、苯乙酸乙酯（1.59）、2-戊酮（1.58）、異丁醇（1.38）、乙酸丙酯（1.34）、異丁醛（1.26）、3-甲基丁醇（1.19）、丁酸（1.12）、乙酸（1.10）、壬酸（1.06）、戊酸乙酯（1.05）、糠醛（1.04）。

2.4.2 上層原酒與下層原酒揮發(fā)性成分正交偏最小二乘分析

將上層原酒與下層原酒風味物質數(shù)據(jù)進行OPLS-DA，結果見圖6。判別模型中Y軸累積解釋率R2Y=0.934，預測優(yōu)度Q2=0.777，說明該模型擬合效果較好。

圖6 上層與下層原酒揮發(fā)性成分OPLS-DA結果Fig.6 OPLS-DA result of volatile components in the upper and lower layers of the original liquor

由圖6A可知，上層原酒與下層原酒沿橫坐標有明顯區(qū)分，上層原酒分布在置信區(qū)間左側，下層原酒分布在置信區(qū)間右側，說明上層與下層原酒之間風味物質存在明顯差異。由圖6B可知，擬合優(yōu)度R2=0.539，Q2=-0.541，Q2＜0表明此模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，模型預測能力良好。由圖6C可知，共有20種風味物質VIP值＞1，分別是己酸乙酯（1.87）、丁酸乙酯（1.76）、丁酸（1.56）、2,3-丁二醇（1.52）、正己醇（1.49）、己酸（1.48）、正丁醇（1.40）、正戊醇（1.38）、辛酸乙酯（1.27）、戊酸乙酯（1.23）、2-戊醇（1.23）、乙酸（1.22）、正丙醇（1.15）、2-丁醇（1.12）、庚酸乙酯（1.11）、異丁醛（1.06）、乙酸乙酯（1.05）、甲酸乙酯（1.04）、糠醇（1.02）、糠醛（1.01）。

2.4.3 中層原酒與下層原酒揮發(fā)性成分正交偏最小二乘分析將中層原酒與下層原酒風味物質數(shù)據(jù)進行OPLS-DA，結果見圖7。判別模型中Y軸累積解釋率R2Y=0.887，預測優(yōu)度Q2=0.661，說明該模型擬合效果較好。

由圖7A可知，中層原酒與下層原酒沿橫坐標有明顯區(qū)分，中層原酒分布在置信區(qū)間左側，下層原酒分布在置信區(qū)間右側，說明中層與下層原酒之間風味物質存在明顯差異。由圖7B可知，擬合優(yōu)度R2=0.562，Q2=-0.578，Q2＜0表明此模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，模型預測能力良好。由圖7C可知，共有18種風味物質VIP值＞1，分別是丁酸乙酯（1.73）、己酸（1.52）、2,3-丁二醇（1.51）、正己醇（1.47）、2-戊醇（1.44）、正丙醇（1.41）、庚酸乙酯（1.40）、己酸乙酯（1.32）、丁酸（1.31）、正丁醇（1.31）、乙醛（1.30）、乙酸乙酯（1.28）、壬酸（1.26）、辛酸乙酯（1.20）、月桂酸乙酯（1.18）、2-丁醇（1.16）、乙酸（1.10）、戊酸乙酯（1.08）。

2.5 不同空間位置原酒差異化合物分析

將不同空間位置原酒之間的差異物質作維恩分析，結果見圖8。由圖8可知，共得到28種具有代表性的差異風味物質，上層與中層共有15種差異風味物質；上層與下層共有20種差異風味物質；中層與下層共有18種差異風味物質；上、中、下層共有6種差異風味物質，分別為己酸乙酯、戊酸乙酯、正己醇、正丁醇、丁酸、乙酸。這些差異風味物質共同造成了不同空間位置原酒之間風格與口感特點的差異。

圖8 不同空間位置原酒差異揮發(fā)性風味成分維恩分析Fig.8 Venn analysis of difference volatile flavor components in original liquor at different spatial positions

3 結論

本研究對不同空間位置原酒理化指標及風味物質進行檢測，應用GC-MS結合多元統(tǒng)計分析方法對各原酒之間的風味物質進行分析。結果顯示，不同空間位置原酒之間總酸、總酯含量隨著窖池深度不斷增加，三者存在顯著差異（P＜0.05）。PCA結果顯示，上層原酒與中、下層原酒組間分離趨勢明顯。OPLS-DA與Venn分析顯示，不同空間位置原酒中共得到28種具有代表性的差異風味物質，其中己酸乙酯、戊酸乙酯、正己醇、正丁醇、丁酸、乙酸為上、中、下層原酒共有的6種差異風味物質，并且含量隨窖池深度逐層遞增，而3-甲基丁醇則呈相反趨勢。由于濃香型原酒的風味受諸多因素的影響，比如生產(chǎn)的原輔料、釀造工藝、微生物等。因此，后續(xù)還需要對不同空間位置的糟醅、窖泥、原酒進行關聯(lián)分析，探尋三者之間的聯(lián)系，為提高濃香型原酒的品質提供更多參考依據(jù)。