金黃色葡萄球菌拮抗細(xì)菌的分離鑒定及拮抗活性分析

鄭佩瑤，田 羽，王 娟，鄧 麗，肖 丹，劉建蕊，韓雨霏，李 祝*

（貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是葡萄球菌屬的一種兼性厭氧革蘭氏陽性細(xì)菌，廣泛分布于自然界[1]。金黃色葡萄球菌作為一種食源性病原菌，是多種動物和人類容易感染的常見病原體[2-3]，從而造成食品污染。其引起食物中毒的機(jī)理是產(chǎn)生大量毒素和酶[4]。因此金黃色葡萄球菌的防治一直是研究人員關(guān)注的問題。之前對金黃色球菌感染疾病的治療藥物主要為抗生素[5]，如四環(huán)素、紅霉素和環(huán)丙沙星等[5-6]。近年來，抗生素在金黃色葡萄球菌的感染疾病中大量使用，使很多耐藥菌產(chǎn)生，其傳播已經(jīng)成為了逐漸嚴(yán)重的全球性問題[7]。金黃色葡萄球菌抗菌素耐藥性增強(qiáng)，因此治療選擇變得越來越有限[8]。而用物理方法殺滅金黃色葡萄球菌較為穩(wěn)妥，但多種方法均因?yàn)榻?jīng)濟(jì)損耗大、操作繁瑣等原因，不能作為防治的首選[9]。

如今由于微生物種類多、來源廣及成本低，所以越來越多的研究人員開始從微生物代謝產(chǎn)物中尋找新的抗菌藥物[10]。如從豬腸道中分離的到一株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）PB-2可以產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，對金黃色葡萄球菌的抑制效果十分明顯[11]，干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）的發(fā)酵產(chǎn)物也對金黃色葡萄球菌具有拮抗活性[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)計(jì)劃從自然發(fā)酵薺菜中分離出細(xì)菌，通過點(diǎn)接法和牛津杯法篩選得到對金黃色葡萄球菌有拮抗作用的細(xì)菌，隨后對其進(jìn)行鑒定和發(fā)酵產(chǎn)物粗提物的提取，并對其提取物成分進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，以了解其具有拮抗活性的成分，并對篩選菌株在未來的應(yīng)用提出展望。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和原料

自然發(fā)酵芥菜：貴州省畢節(jié)市家鄉(xiāng)美農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）PJ-1：由貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離、篩選、鑒定和保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

乙醇（分析純）：生工生物工程（上海）有限公司；乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、氯化鈉（均為分析純）：重慶川東化工集團(tuán)有限公司；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5 g/L，pH 自然，121 ℃濕熱滅菌30 min。固體培養(yǎng)基加瓊脂20 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD型單人單面超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；Allegra X-30R型離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特有限公司；BIOMATE 3S型紫外分光光度計(jì)：美國Thermo Fisher公司；Bio-Rad S1000 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：上海菲特科學(xué)器材有限公司；RE-5298型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器有限公司；DDB303A型電導(dǎo)率儀：上海雷磁儀器廠；7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）：美國Agilent公司；JY300HE型電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；CAMX PLU型酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司；Gel Doc XR+凝膠成像儀：北京賽百奧科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 拮抗細(xì)菌的分離

將從自然發(fā)酵芥菜中分離篩選出的拮抗細(xì)菌分別在裝有牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的平板上劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d。

1.3.2 拮抗細(xì)菌的篩選

①點(diǎn)接法測定抑菌圈直徑：挑取指示菌PJ-1接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，使其OD600nm值控制為0.6～0.8。待牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基冷卻至50 ℃時(shí)，向其中加入為培養(yǎng)基體積1%的PJ-1菌懸液，混勻倒入平板中，待其凝固后在平板上點(diǎn)接拮抗細(xì)菌，使拮抗細(xì)菌之間的距離為2.5 cm，30 ℃培養(yǎng)2 d測其抑菌圈直徑，不接拮抗細(xì)菌為空白對照。

②牛津杯法測定抑菌圈直徑：分別挑取9株拮抗細(xì)菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，使其OD600nm值控制為0.6～0.8。吸取制備好的拮抗細(xì)菌菌懸液1 mL接種于裝有50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的錐形瓶中，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，8 000 r/min離心10 min，取其上清液用0.22 μm的水系濾膜過濾后置于4 ℃冰箱冷藏備用。待牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基冷卻至50 ℃時(shí)，向其中加入培養(yǎng)基體積1%的PJ-1菌懸液混勻，將牛津杯置于平板上，倒入混合液，待其凝固后取去牛津杯，向其孔中分別加入100 μL各拮抗細(xì)菌的抗菌發(fā)酵液，30 ℃培養(yǎng)3 d測其抑菌圈直徑，加無菌水為空白對照。

1.3.3 拮抗細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)鑒定

拮抗細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察：挑取拮抗細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色并觀察。

拮抗細(xì)菌DNA的提?。悍謩e挑取一環(huán)拮抗細(xì)菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中30 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，按索萊寶細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書按步驟進(jìn)行。

PCR擴(kuò)增：以DNA為模板，使用細(xì)菌通用引物27F和1492R對菌株的16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）如下：2×TaqPCR Master Mix 15 μL、DNA模板3 μL，上下游引物各2 μL和ddH2O 28 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性1 min，退火到58 ℃保持40 s，72 ℃延伸1 min，終延伸72 ℃、10 min，設(shè)置為35個(gè)循環(huán)，于4 ℃停止。PCR擴(kuò)增所用引物的序列為27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。將最終擴(kuò)增所獲得的產(chǎn)物送往上海市生工生物工程有限公司完成檢測。

系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建：將得到的序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）進(jìn)行基于局部比對算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對查找相似序列，選擇相似性＞99%的序列下載，用MEGA7.0軟件鄰接（neighbor-joining，N-J）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 拮抗細(xì)菌粗提物的制備及拮抗活性測定

粗提物的制備：分別挑取一環(huán)由上述實(shí)驗(yàn)篩選出具有良好拮抗活性的拮抗細(xì)菌接種于100 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，6 000 r/min離心5 min取上清并過0.22 μm水系濾膜后，選用有機(jī)溶劑乙酸乙酯對其發(fā)酵液進(jìn)行萃取，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干得各拮抗細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯粗提物，準(zhǔn)確稱取0.15 mg溶解于5 mL二甲基亞砜（DMSO）中備用。

細(xì)菌乙酸乙酯粗提物對PJ-1拮抗活性的測定：起主要拮抗作用的為菌株發(fā)酵產(chǎn)物，因發(fā)酵產(chǎn)物為水相物質(zhì)，很難得到其干物質(zhì)，且在用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干過程中很多活性物質(zhì)可能會因溫度過高而失活，且水相不便用GC-MS進(jìn)行成分分析，所以采用乙酸乙酯對其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行萃取。用生長速率法篩選各拮抗細(xì)菌的乙酸乙酯粗提物的拮抗活性，將PJ-1菌懸液以5%的接種量分別接種于裝有5 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的試管中，分別加入溶于DMSO中的上述各拮抗細(xì)菌的乙酸乙酯粗提物50 μL，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，對照組加50 μL DMSO進(jìn)行培養(yǎng)。用紫外分光光度計(jì)在波長600 nm處測其吸光度值，并用以下公式計(jì)算其抑菌率：

1.3.5 拮抗細(xì)菌乙酸乙酯粗提物的成分分析

稱取萃取旋干后的由1.3.4篩選得到的拮抗細(xì)菌的乙酸乙酯粗提物10 mg溶于1 mL甲醇中，超聲振蕩充分溶解，并用0.22μm有機(jī)濾膜過濾，采用GC-MS進(jìn)行揮發(fā)性成分分析。

GC-MS條件[13]：HP-5MS色譜柱（30m×0.25μm，0.25mm），初始溫度50℃保持2min，以5℃/min升溫至240℃保持15min，運(yùn)行時(shí)間55 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He，純度99.999%）；柱前壓7.65 psi，載氣流量1.0 mL/min，不分流，溶劑延遲時(shí)間5.0 min。離子源為電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，發(fā)射電流34.6 μA，倍增器電壓1 624 V，接口溫度280 ℃，質(zhì)量范圍29～500 amu。

定性定量方法：使用Wiley數(shù)據(jù)庫進(jìn)行化合物的鑒定分析，選出正負(fù)匹配度＞800的化合物。采用面積歸一法定量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

使用Office 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和圖表制作，使用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用DataAnaylysis軟件對GC-MS離子圖進(jìn)行譜圖解析，用IBM SPSS Statistics 2019進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)顯著性均為P＜0.05，實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌對PJ-1拮抗活性的分離與篩選

2.1.1 菌株分離

從自然發(fā)酵芥菜中分離純化得到33株細(xì)菌，篩選得到9株對金黃色葡萄球菌PJ-1有拮抗活性的細(xì)菌，分別編號為SC-1～SC-9。

2.1.2 點(diǎn)接法篩選

由圖1可知，9株拮抗細(xì)菌都對金黃色葡萄球菌PJ-1表現(xiàn)一定的拮抗活性，其中菌株SC-3抑菌圈直徑為20.23 mm，SC-9為18.15 mm，SC-4為16.02 mm，SC-8為15.87 mm，SC-5為14.83mm，SC-2 為14.81 mm，SC-6 為12.33 mm，SC-1 為10.83 mm，菌株SC-7對金黃色葡萄球菌PJ-1的拮抗活性最小，抑菌圈直徑為9.41 mm。根據(jù)點(diǎn)接法篩選結(jié)果可以看出，SC-3、SC-9對金黃色葡萄球菌PJ-1的拮抗活性較好，其中菌株SC-3對金黃色葡萄球菌PJ-1的拮抗活性最佳。

圖1 9株細(xì)菌對金黃色葡萄球菌PJ-1拮抗活性的點(diǎn)接法篩選結(jié)果Fig.1 Results of dot junction screening of antagonistic activity of 9 strains against Staphylococcus aureus PJ-1

2.1.3 牛津杯法篩選

牛津杯法可測定過濾菌體后代謝物對病原菌的拮抗活性，抗菌物質(zhì)主要為拮抗細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物[14]。9株拮抗細(xì)菌對金黃色葡萄球菌PJ-1拮抗活性見圖2。由圖2可知，9株菌株對金黃色葡萄球菌PJ-1的抑菌圈直徑均在27.0 mm以上，SC-9對金黃色葡萄球菌PJ-1的拮抗活性最好，抑菌圈直徑為49.12 mm，其次為SC-6，抑菌圈直徑為42.12 mm，SC-5的抑菌圈直徑為41.05 mm，SC-2的抑菌圈直徑為39.12 mm，SC-7的抑菌圈直徑為38.08 mm，SC-3的抑菌圈直徑為37.26 mm，SC-4的抑菌圈直徑為37.10 mm，SC-8為36.83 mm。SC-1在該篩選方法中的拮抗活性最小，抑菌圈直徑為27.50 mm。篩選結(jié)果表明，SC-9，SC-6對金黃色葡萄球菌PJ-1的拮抗活性較好。

圖2 9株細(xì)菌對金黃色葡萄球菌PJ-1拮抗活性的牛津杯法篩選結(jié)果Fig.2 Results of Oxford cup screening of antagonistic activity of 9 strains against Staphylococcus aureus PJ-1

牛津杯法篩選可知所有菌株對金黃色葡萄球菌PJ-1的抑菌圈直徑均高于用點(diǎn)接法初篩，由此可推測抗菌物質(zhì)主要為其代謝產(chǎn)物。并且除SC-1外，所有菌株對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均高于所報(bào)道的31.5 mm[15]。研究報(bào)道細(xì)菌如芽孢桿菌具有產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶和H2O2的能力[16-18]。此外，幾乎所有的芽孢桿菌都可產(chǎn)生一種抗菌多肽，稱抗菌素[19]。因此推測菌株對金黃色葡萄球菌PJ-1的拮抗活性可能與它們產(chǎn)以上所述物質(zhì)相關(guān)。

2.2 拮抗細(xì)菌的鑒定

由上述兩種方法篩選出具有良好拮抗活性的3株拮抗細(xì)菌，分別為SC-3、SC-6和SC-9。拮抗細(xì)菌的菌落均呈乳白色、形狀為圓形，細(xì)菌菌落邊緣粗糙干燥、無光澤，拮抗細(xì)菌皆不透明。經(jīng)染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)所有菌株均為革蘭氏陽性細(xì)菌，呈乳白色，形狀均為圓形，其革蘭氏染色結(jié)果見圖3。

圖3 不同拮抗細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果Fig.3 Gram staining results of different antagonistic bacteria

利用MEGA7.0構(gòu)建3株拮抗細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，3種菌參與構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。由圖4可知，結(jié)合形態(tài)特征和生理生化鑒定，鑒定菌株SC-3為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），菌株SC-6為莫海威芽孢桿菌（Bacillus mojavensis），菌株SC-9為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖4 3株拮抗細(xì)菌基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 3 antagonistic bacteria based on 16S rDNA gene sequence

2.3 拮抗細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯粗提物的拮抗活性篩選及成分分析

3株拮抗細(xì)菌的發(fā)酵產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取得到其粗提物對金黃色葡萄球菌PJ-1的拮抗活性見圖5。由圖5可知，3株拮抗細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯粗提物中，貝萊斯芽孢桿菌SC-3對PJ-1的拮抗活性最好，抑菌率為75.04%；莫海威芽孢桿菌SC-6次之，抑菌率為64.93%；解淀粉芽孢桿菌SC-9對PJ-1不具有拮抗活性。因此選用貝萊斯芽孢桿菌SC-3的乙酸乙酯粗提物（AE）作為抗菌粗提物進(jìn)行以下的機(jī)制研究。

圖5 3株拮抗細(xì)菌乙酸乙酯粗提物對金黃色葡萄球菌PJ-1的拮抗活性Fig.5 Antagonistic activity of crude extracts of three antagonistic strains from ethyl acetate on Staphylococcus aureus PJ-1

2.4 貝萊斯芽孢桿菌SC-3發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯粗提物成分分析

貝萊斯芽孢桿菌SC-3發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯粗提物的GC-MS分析總離子流色譜圖見圖6。由圖6可知，用Data Analysis對各峰圖進(jìn)行分析，確定了AE的主要成分和其百分含量。主要成分見表1。

表1 貝萊斯芽孢桿菌SC-3發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯提取物的主要成分Table 1 Main components of acetate extract of Bacillus velezensis SC-3 fermentation product

圖6 貝萊斯芽孢桿菌SC-3發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯提取物的GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.6 Total ion chromatogram of ethyl acetate extract of Bacillus velezensis SC-3 fermentation product analysis by GC-MS

由表1可知，AE共檢測出了24種化合物，鑒定出了17種主要成分，主要物質(zhì)為10-羥基-2-癸烯酸（41.993%）、1,4-二氮雜2,5-二氧雜-3-異丁基雙環(huán)[4.3.0]壬烷（8.798%）、3-甲基二氧哌嗪（8.257%）、L-亮氨酸（5.829%）、醋酸（1.937%）、1,2-戊二醇（1.774%）和丙酸甲酯（1.438%）等。

其中10-羥基-2-癸烯酸是一種生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗氧化、提高人體免疫力等功能，可被應(yīng)用于食品、醫(yī)療及日化等多個(gè)行業(yè)[20]。1,4-二氮雜2,5-二氧雜-3-異丁基雙環(huán)[4.3.0]壬烷對肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）生物膜形成具有較強(qiáng)的抑制作用[21]。氧哌嗪類化合物常被用于革蘭氏陰性細(xì)菌感染的疾病，也可用于球菌等感染的疾病，其抗菌譜廣且過敏現(xiàn)象較少[22]。L-亮氨酸是人和動物自身不能合成的必需氨基酸之一，具有抗癌、抗病毒、抑制細(xì)菌生長等生物活性功能，人畜無害，常被作為食品添加劑應(yīng)用于食品生產(chǎn)和加工[23]。一些特定的細(xì)菌可生產(chǎn)或分泌醋酸，有研究報(bào)道0.5%的醋酸濃度即可對細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用[24]。1,2-戊二醇主要應(yīng)用于殺菌劑丙環(huán)唑的制備，其次可應(yīng)用于增塑劑、乳化劑、表面活性劑和嬰兒護(hù)理產(chǎn)品等領(lǐng)域[25]。丙酸甲酯是一種具有多種用途的酯類原料，常用作萃取劑、食品或化妝品的香料、增塑劑等，具有安全無毒的特性[26]。因此可知AE中主要的物質(zhì)為具有拮抗活性的安全物質(zhì)，其具有一定的分離價(jià)值，有望作為抗菌藥物運(yùn)用在食源性金黃色葡萄球菌的防治上。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從自然發(fā)酵芥菜中分離出的細(xì)菌中，貝萊斯芽孢桿菌SC-3對PJ-1抑制效果最為顯著。對貝萊斯芽孢桿菌SC-3的乙酸乙酯粗提物（AE）進(jìn)行GC-MS分析得其中的主要物質(zhì)為10-羥基-2-癸烯酸（41.993%）、1,4-二氮雜2,5-二氧雜-3-異丁基雙環(huán)[4.3.0]壬烷（8.798%）、3-甲基二氧哌嗪（8.257%）、L-亮氨酸（5.829%）、醋酸（1.937%）、1,2-戊二醇（1.774%）和丙酸甲酯（1.438%）等，都是具有拮抗活性的安全物質(zhì)，其具有一定的分離價(jià)值，有望作為抗菌藥物運(yùn)用在食源性金黃色葡萄球菌的防治上。