茅臺鎮(zhèn)某酒廠高溫大曲微生物多樣性與感官品質關聯(lián)性分析

楊 晨，楊栩松，郭 壯，田龍新，劉菊珍，周加平，葉明波，王玉榮*

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市釀酒生物技術與應用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽 441053；3.醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053；4.湖北東方明珠酒業(yè)有限責任公司，湖北 襄陽 441053）

高溫大曲是以小麥、大麥和豌豆為主要原料，經(jīng)過研磨、混合、定型、培養(yǎng)、成熟和干燥而成，富含大量的微生物、酶及風味化合物[1]。大曲的質量決定了白酒的質量，曲中的微生物及其代謝產(chǎn)物可顯著影響白酒的風味和口感[2]，因而越來越多的學者圍繞高溫大曲微生物類群與風味品質之間的關聯(lián)性進行系統(tǒng)研究。LI H等[3]研究發(fā)現(xiàn)，茅臺大曲中細菌屬主要為高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、微球菌屬（Micrococcus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、黃桿菌屬（Flavobacterium）和糖單孢菌屬（Saccharomonospora），且這些菌屬之間通過分泌代謝產(chǎn)物等相互作用促進了乙酸甲酯、棕櫚酸異丙酯、亞油酸乙酯和苯乙醇等風味化合物的產(chǎn)生。沈世明等[4]對高溫大曲微生物群落結構及其風味物質進行分析，發(fā)現(xiàn)高溫大曲中優(yōu)勢菌屬主要為克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）、海洋桿菌屬（Oceanobacillus）、Bacillus、絲衣霉菌屬（Byssochlamys）和畢赤酵母屬（Pichia），其中Bacillus和Oceanobacillus等細菌屬可促進亞油酸、草莓酸和癸酸等酸類物質和吡嗪類物質的產(chǎn)生，Pichia等酵母屬可促進酯類物質的產(chǎn)生。由此可見，高溫大曲中不同微生物的代謝作用可賦予醬香型白酒不同的風味品質。作為中國醬香白酒核心產(chǎn)區(qū)的茅臺鎮(zhèn)，其擁有上千家酒廠企業(yè)，任愛容等[5]的研究結果表明，茅臺鎮(zhèn)不同酒廠生產(chǎn)的高溫大曲細菌菌群多樣性存在明顯差異，因而增加大曲樣品研究的數(shù)量和廠家來源，對后續(xù)更好地解析茅臺鎮(zhèn)大曲微生物與風味品質之間的關系具有重要的意義。

近年來，第二代高通量測序技術已被廣泛應用于解析窖泥[6]、酒曲[7]、酒醅[8]及大曲[9]微生物群落組成以及動態(tài)演替規(guī)律。作為一種快速、全面和易于操作的仿生學設備[10]，基于氣體傳感器或化學傳感器的組合，電子鼻或電子舌模仿了人的鼻子或舌頭[11]，已廣泛應用于食品風味的評價研究中。

本研究采用MiSeq高通量測序技術對茅臺鎮(zhèn)某酒廠高溫大曲的微生物類群進行解析，結合常規(guī)檢測方法、電子鼻和電子舌對大曲的理化指標、氣味及滋味進行測定，并進一步建立了微生物類群與酒曲感官指標之間的相關性，以期為高溫大曲微生物資源的進一步挖掘提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫大曲樣品：于2022年9月中旬采集自貴州省遵義市仁懷市茅臺鎮(zhèn)某知名酒業(yè)制曲車間，所采集的6份樣品均為同一批次黃色大曲。樣品隨機選取，編號為M1～M6，取樣后及時粉碎，并置于-20 ℃下低溫保存。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；5×TransStartTMFastPfuBuffer、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mix和FastPfuFly DNA聚合酶：北京全式金生物技術有限公司；引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）/806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和ITS1F（5'-CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）/ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）：均由上海桑尼生物科技有限公司合成；MiSeq高通量測序配套試劑：美國Illumina公司；參比溶液、陰陽離子溶液、內部溶液：日本Insent公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

HR83鹵素水分測定儀：梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；AW-1水分活度儀：無錫碧波電子設備廠；PEN3電子鼻、SA402B電子舌：德國Airsense公司；Veriti FAST聚合酶鏈式應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國ProteinSimple公司；PE300 MiSeq高通量測序平臺：美國Illumina公司；R930機架式服務器：美國DELL公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 理化指標的測定

根據(jù)輕工業(yè)行業(yè)標準QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》對高溫大曲的酸度、氨基酸態(tài)氮、灰分和淀粉含量進行測定；使用鹵素水分測定儀測定大曲中水分含量；使用水分活度儀測定大曲中水分活度。

1.3.2 感官品質的評價

氣味指標的測定：準確稱取高溫大曲樣品12 g于電子鼻專用瓶中，將其置于室溫下平衡1 h后，參照席啦等[12]的測定方法使用PEN3電子鼻對其風味指標進行測定。

滋味指標的測定：準確稱取高溫大曲樣品30 g于250 mL燒杯中，按照1∶4的比例加入120 mL去離子水并于室溫下放置30 min后，在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，取上清，使用SA402B電子舌對大曲的5個基本味（酸味、苦味、澀味、咸味和鮮味）和3個回味（苦的回味、鮮的回味和澀的回味）進行測定[13]，設置大曲M4為對照組。

1.3.3 宏基因組DNA提取、PCR擴增及高通量測序

按照提取試劑盒的說明對高溫大曲樣品中微生物的基因組DNA進行提取，參照GUO Z等[14-15]的方法，使用加入核苷酸標簽（Barcord）的338F/806R引物和ITS1F/ITS2R引物分別對細菌16S rRNA的V3-V4區(qū)和真菌ITS區(qū)進行PCR擴增，之后將檢測合格的PCR產(chǎn)物低溫寄送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行雙末端測序。

1.3.4 生物信息學分析

參照DENG L等[16]的方法對測序返回的雙端序列進行拼接和高質量序列篩選，利用QIIME（V1.9.1）平臺對保留序列進行微生物群落注釋和多樣性評價[17]。首先按照97%相似度使用UCLUST進行聚類生成操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），繼而去除嵌合體，然后基于各數(shù)據(jù)庫對具有代表性的序列進行同源性比對完成物種注釋，最終計算樣品中微生物類群的α多樣性指數(shù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

雷達圖和柱形圖均使用Origin 2017繪制，曲線圖使用R（v4.1.3）繪制，瀑布圖使用Excel 2016繪制，相關性網(wǎng)絡圖使用Cytoscape（v3.7.2）繪制。

2 結果與分析

2.1 高溫大曲樣品理化性質分析

理化性質不僅是判斷大曲是否適合發(fā)酵的主要標準，亦是鑒別大曲品質的重要參考依據(jù)[18]。對茅臺鎮(zhèn)某酒廠高 溫大曲樣品的理化指標進行測定，結果見表1。

表1 高溫大曲樣品理化指標的測定結果Table 1 Determination results of physicochemical indexes of high-temperature Daqu samples

由表1可知，茅臺鎮(zhèn)某酒廠高溫大曲的平均水分含量為9.09%，水分活度為0.53，酸度為1.52 mmol/10 g，氨基酸態(tài)氮含量為3.90 g/kg，灰分含量為1.83 g/100 g，淀粉含量為59.00%，6份高溫大曲樣品的理化指標均符合貴州省地方標準DB52/T 871—2014《醬香型白酒釀酒用大曲》要求。其中，酸度和灰分指標的變異系數(shù)均＞10%，在6份高溫大曲樣品間存在較大差異。由此可見，同一批次生產(chǎn)的高溫大曲曲塊之間其部分理化性質存在明顯差異。

2.2 高溫大曲樣品感官品質分析

采用電子鼻和電子舌進一步對6份高溫大曲樣品的感官品質特性進行評價，結果見圖1。

圖1 高溫大曲樣品風味品質（A）和滋味品質（B）雷達圖Fig.1 Radar map of flavor quality (A) and taste quality (B) of high-temperature Daqu samples

由圖1A可知，僅有W1W和W2S這2個電子鼻傳感器對高溫大曲樣品具有響應強度，表明高溫大曲樣品的揮發(fā)性風味物質中乙醇、有機硫化物和萜類物質的相對豐度較高。W1W傳感器對M4大曲樣品的響應值高達21，而對其他5份大曲樣品的響應值均＜13，由此可見，6份高溫大曲樣品揮發(fā)性風味物質差異主要體現(xiàn)在有機硫化物和萜類物質上。由圖1B可知，高溫大曲樣品在酸味、咸味和鮮味指標上的差異較大，在苦味、后味A（澀味的回味）、后味B（苦味的回味）和豐度（鮮味的回味）指標上的差異較小。由此可見，6份高溫大曲樣品滋味指標差異主要體現(xiàn)在酸味、咸味和鮮味這3個基本味上。王利萍等[19]對貴州懷仁地區(qū)醬香型白酒大曲中的風味和滋味物質進行分析，發(fā)現(xiàn)大曲揮發(fā)性風味物質差異主要體現(xiàn)在氮氧化物、有機硫化物和萜類物質上，其滋味物質差異主要體現(xiàn)在酸味、咸味和鮮味上，該結論與本研究結果具有一定相似性。亦有研究指出，大曲中含有大量醇類、醛酮類、吡嗪類和醚酚類等風味物質[20]。

2.3 高溫大曲樣品微生物類群α多樣性分析

基于Illumina MiSeq高通量測序技術，從6份高溫大曲樣品共獲得318 131條高質量16S rRNA基因序列和448 244條高質量ITS序列，使用UCLUST聚類分析后，共得到13 596個細菌OTU和4 832個真菌OTU。本研究首先通過Chao 1指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)對茅臺鎮(zhèn)某酒廠高溫大曲樣品中的微生物物種豐富度和多樣性進行分析，結果見圖2。

圖2 高溫大曲樣品微生物菌群Chao 1指數(shù)（A）和香農(nóng)指數(shù)（B）分析結果Fig.2 Analysis results of Chao 1 index (A) and Shannon index (B) of microorganism flora in high-temperature Daqu samples

由圖2可知，隨著測序深度的增加，雖然6份高溫大曲樣品中細菌與真菌類群的Chao 1指數(shù)一直處于上升趨勢，但其香農(nóng)指數(shù)早已進入穩(wěn)定狀態(tài)，因而本研究的測序深度足以捕捉大曲樣品中大多數(shù)微生物類群的多樣性并滿足后續(xù)分析的要求。經(jīng)α多樣性分析可知，納入本研究的高溫大曲樣品細菌和真菌菌群的平均Chao 1指數(shù)分別為1 388和546，細菌和真菌菌群的平均香農(nóng)指數(shù)分別為5.10和2.76。由此可見，在同一測序深度下時，細菌類群豐富度和多樣性均高于真菌類群。

2.4 高溫大曲樣品微生物群落結構分析

高溫大曲樣品中細菌類群共鑒定到18個門、35個綱、58個目、114個科和197個屬；其真菌類群共鑒定到4個門、9個綱、14個目、32個科和48個屬。為明確茅臺鎮(zhèn)某酒廠高溫大曲的微生物類群特征，對其微生物群落結構進行解析，結果見圖3。將在6份高溫大曲中相對含量＞1.0%的細菌屬和真菌屬定義為優(yōu)勢菌屬，相對含量＜1.0%的菌屬歸為其他。

圖3 基于屬水平高溫大曲樣品中細菌（A）及真菌（B）菌群結構Fig.3 Bacterial (A) and fungal (B) flora structure of high-temperature Daqu samples based on genus level

由圖3A可知，高溫大曲樣品中有12個優(yōu)勢細菌屬，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）、克羅彭斯特德菌屬（Kroppenstedtia）、慢生芽孢桿菌屬（Lentibacillus）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、糖多孢菌屬（Saccharopoly-spora）、巖石芽孢桿菌屬（Scopulibacillus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）、紅球菌屬（Rhodococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、黏液乳桿菌屬（Limosilactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus），其平均相對含量分別為13.96%、13.52%、11.01%、8.93%、8.63%、8.62%、6.72%、5.52%、4.00%、3.38%、2.40%和1.81%。由圖3A亦可知，高溫大曲樣品中出現(xiàn)了Oceanobacillus、Scopulibacillus、Rhodococcus、Weissella、Limosilactobacillus和Pediococcus相對含量分布明顯不均一的現(xiàn)象。Oceanobacillus在M1大曲樣品中相對含量為30.28%，而在其他大曲樣品中相對含量均＜10.0%；Scopulibacillus和Rhodococcus在M4大曲樣品中相對含量分別為21.70%和24.77%，而在其他大曲樣品中相對含量均＜6.0%；Weissella、Limosilactobacillus和Pediococcus在M6大曲樣品中相對含量分別為22.60%、19.91%和13.43%，而在其他大曲中相對含量均＜0.5%。由此可見，雖然高溫大曲樣品為同一批次生產(chǎn)，但其細菌類群存在一定的差異。

由圖3B可知，高溫大曲中有7個優(yōu)勢真菌屬，分別為嗜熱真菌屬（Thermomyces）、曲霉菌屬（Aspergillus）、踝節(jié)菌屬（Rasamsonia）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、Leiothecium和假絲酵母屬（Candida），其平均相對含量分別為49.49%、12.25%、10.68%、7.51%、6.88%、2.83和1.28%。由圖3B亦可知，高溫大曲樣品中7個優(yōu)勢真菌屬亦均出現(xiàn)了相對含量分布明顯不均一的現(xiàn)象，例如Aspergillus在M1～M3大曲樣品中的相對含量分別為12.28%、20.72%和40.34%，而在其他大曲中相對含量均＜0.1%，類似現(xiàn)象在Thermomyces、Rasamsonia、Saccharomycopsis、Byssochlamys、Leiothecium和Candida中均存在。由此可見，雖然高溫大曲為同一批次生產(chǎn)，但其真菌類群亦存在一定差異。

本研究將存在于所有高溫大曲樣品中的OTU，定義為核心OTU，并將平均相對含量＞1.0%的核心OTU定義為核心優(yōu)勢OTU。進一步在OTU水平上對高溫大曲樣品核心微生物類群進行解析，結果見圖4。

圖4 高溫大曲樣品中細菌（A）和真菌（B）核心優(yōu)勢OTU瀑布圖Fig.4 Core dominant OTU waterfall diagram of bacteria (A) and fungi (B) in high-temperature Daqu samples

由圖4A可知，高溫大曲樣品細菌菌群中有129個核心OTU，其中核心優(yōu)勢OTU有18個，分別隸屬于Kroppenstedtia（12.00%）、Bacillus（10.14%）、Scopulibacillus（8.58%）、Saccharopolyspora（8.27%）、Lentibacillus（7.15%）、Thermoactinomyces（6.58%）、Rhodococcus（5.26%）、Oceanobacillus（4.62%）、Weissella（3.93%）、Pediococcus（2.35%）和不可鑒定的放線菌門（unclassfield_Actinobacteria）（2.12%），累積平均相對含量高達71.00%。由圖4B可知，高溫大曲樣品真菌菌群中有23個核心OTU，其中核心優(yōu)勢OTU有7個，分別隸屬于Thermomyces（47.83%）、Aspergillus（9.15%）、Saccharomycopsis（6.26%）、Byssochlamys（6.10%）、Rasamsonia（5.67%）和不可鑒定的酵母目（unclassfield_Saccharomycetales）（1.41%），累積相對含量高達76.42%。由此可見，雖然高溫大曲樣品間微生物類群的相對含量存在一定差異，但其共有大量的核心菌群。

HE G等[21]研究表明，大曲優(yōu)勢菌群的代謝活動對茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒的獨特風味至關重要，其中，Kroppenstedtia、Bacillus和Lentibacillus為醬香型白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群和功能菌群，在釀造過程中，會分泌多種水解酶，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶等以促進大分子的水解以及吡嗪類、酯類和醇類等風味化合物的產(chǎn)生[22]。高溫大曲在制曲過程中其培養(yǎng)溫度在60 ℃以上，甚至高達70 ℃，Thermoactinomyces、Scopulibacillus和Oceanobacillus均 屬于耐熱微生物，亦均可分泌蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等，對醬香型白酒風味的生成具有一定的貢獻[23]。有研究亦表明，Thermoactinomyces還可生產(chǎn)出獨具醬香風味的愈創(chuàng)木酚[24]。Weissella和Pediococcus均屬于乳酸菌，在大曲發(fā)酵過程中經(jīng)代謝活動可生成乙酸乙酯和乳酸乙酯等風味物質[25]。張翰之等[26]研究表明，Aspergillus為絲狀真菌，能夠產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶等多種酶類，對大曲的糖化力、液化力和酯化力發(fā)揮著重要的作用。Thermomyces為高溫大曲中的優(yōu)勢菌屬，在醬香型白酒釀造過程中可產(chǎn)生多種重要酶類，以促進微生物的生長代謝及酒體生香[16]。Saccharomycopsis不僅具有分泌淀粉酶和蛋白酶等多種水解酶的能力，還具有分泌β-葡萄糖苷酶的能力，且該菌屬的生長代謝可對乙酸乙酯的產(chǎn)生具有促進作用，從而使得酒體的風味更加協(xié)調和飽滿[27]。

2.5 高溫大曲樣品中優(yōu)勢菌屬與其感官品質的相關性分析

在對高溫大曲微生物類群進行解析的基礎上，進一步對高溫大曲中優(yōu)勢菌屬與氣味和滋味指標之間的相關性進行分析，結果見圖5。

圖5 高溫大曲樣品優(yōu)勢菌屬與感官品質間相關性分析網(wǎng)絡圖Fig.5 Correlation analysis network diagram between dominant bacteria genera and sensory quality of high-temperature Daqu samples

由圖5可知，Kroppenstedtia和Aspergillus均與芳香型化合物和乙醇等風味物質的生成呈顯著正相關（P＜0.05），Kroppenstedtia與苦味呈極顯著負相關（P＜0.01）；Oceanobacillus與苦味的回味呈顯著負相關（P＜0.05）；Bacillus與鮮味呈極顯著正相關（P＜0.01）；Byssochlamys與豐度呈現(xiàn)極顯著正相關（P＜0.01）；Rasamsonia與苦味的回味呈顯著負相關（P＜0.05）。有研究表明，Aspergillus可促進正丁醇和2-甲基丁酸乙酯的形成，Bacillus可促進四甲基吡嗪和2,3-丁二醇的形成[28]。由此可見，Kroppenstedtia和Aspergillus對高溫大曲芳香類風味物質的形成具有一定的積極作用，Bacillus對鮮味的形成和Byssochlamys對鮮味回味的形成亦具有一定的積極作用。

3 結論

理化性質研究發(fā)現(xiàn)，本研究中6份高溫大曲樣品的理化指標均符合貴州省地方標準要求，但酸度和灰分指標差異較大，變異系數(shù)＞10%。風味物質分析發(fā)現(xiàn)，6份高溫大曲樣品的風味在乙醇、有機硫化物、萜類物質、酸味、咸味和鮮味上差異較為突出。高通量測序結果發(fā)現(xiàn)，細菌類群豐富度和多樣性均高于真菌，其中細菌主要隸屬于Bacillus、Kroppenstedtia、Lentibacillus、Oceanobacillus、Saccharopolyspora、Scopulibacillus、Thermoactinomyces、Rhodococcus、Weissella、Limosilactobacillus、Pediococcus和Staphylococcus，而真菌主要隸屬于Thermomyces、Aspergillus、Rasamsonia、Saccharomycopsis、Byssochlamys、Leiothecium和Candida。相關性分析發(fā)現(xiàn)，Kroppenstedtia和Aspergillus均與芳香類風味物質呈顯著正相關，Bacillus與鮮味呈顯著正相關?？傮w上，積極挖掘和培育具有提升酒曲風味和滋味特性的Kroppenstedtia、Aspergillus和Bacillus菌株，對于后續(xù)提高貴州地區(qū)酒曲的品質具有積極意義。