清香型白酒中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯的檢測

張 琴，銀 瑩，2*，楊宛宜，楊星華，黃陳程，李加濤，2，余 宏，2

（1.成都產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院有限責(zé)任公司，四川 成都 610100；2.成都市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，四川 成都 610100）

白酒是中國的國酒，在中國傳統(tǒng)文化中占有獨(dú)特的地位。白酒是一種以糧谷為主要原料，以酒曲為發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾制成的傳統(tǒng)蒸餾酒[1-4]。白酒現(xiàn)已形成12種香型，分別為清香、濃香、醬香、米香、鳳香、芝麻香、藥香、特香、豉香、兼香、老白干香和馥郁香型白酒[5-7]，其中清香型白酒被視為中國白酒的起源，其清香純正、醇厚綿甜、協(xié)調(diào)爽凈、回味悠長的特點(diǎn)深受消費(fèi)者的喜愛[8-11]。

乙酸乙酯與乳酸乙酯是清香型白酒的兩種主體酯類物質(zhì)，它們的含量和比例與清香型白酒的風(fēng)味品質(zhì)密切相關(guān)[12-13]?，F(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10781.2—2022《白酒質(zhì)量要求第2部分：清香型白酒》理化要求部分，對乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量做出了明確的規(guī)定，檢驗(yàn)的方法標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 10345—2022《白酒分析方法》。甲醇是白酒中重要的衛(wèi)生指標(biāo)[14]，飲用甲醇超標(biāo)的白酒，會對人體造成極大傷害，表現(xiàn)為頭痛、眩暈、疲勞、嘔吐、視力模糊、失明，甚至死亡[15-17]，國家市場監(jiān)管總局發(fā)布的《2020版國家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》規(guī)定了甲醇含量為白酒中必檢項(xiàng)目[18]，檢測方法為GB 5009.266—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中甲醇的測定》。白酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯與甲醇對應(yīng)不同的檢測方法，這樣降低了工作效率和儀器的利用率。因此對標(biāo)準(zhǔn)中的方法進(jìn)行優(yōu)化，建立一種操作簡單、準(zhǔn)確度高、精密度好，適用于清香型白酒中甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯快速檢測的方法具有重要意義。

現(xiàn)有對白酒中風(fēng)味物質(zhì)分析檢測的方法有氣相色譜（gas chromatography，GC）法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法、氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）法、電子鼻和氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion migration spectrometry，GC-IMS）技術(shù)等[19-25]，因氣相色譜法對碳?xì)浠衔镉休^好的響應(yīng)及穩(wěn)定的信號，且操作簡便、成本較低、分離效果好、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)廣泛用于白酒中各類風(fēng)味物質(zhì)的分析[26-28]。孟慶順等[29]用氣相色譜法同時測定了白酒中8種醇類和酯類風(fēng)味物質(zhì)，韓旭等[30]建立了白酒中同時檢測己酸乙酯和己酸的毛細(xì)管氣相色譜分析方法，吳麗華等[31]利用白酒毛細(xì)管色譜柱氣相色譜法，分析了白酒中酯類、醇類、有機(jī)酸類、醛類等29種微量成分。

本研究選取清香型白酒中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯這三種物質(zhì)為檢測目標(biāo)，建立氣相色譜（GC）內(nèi)標(biāo)法同時測定清香型白酒中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯含量的方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察，以期建立同時檢測清香型白酒中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯的方法，提高檢測效率，在滿足清香型白酒三大重要指標(biāo)同時達(dá)到快速、準(zhǔn)確檢驗(yàn)的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10個不同酒精度酒樣[1#（42%vol）、2#（45%vol）、3#（50%vol）、4#（52%vol）；5#（55%vol）、6#（57%vol）、7#（58%vol）、8#（60%vol）、9#（61%vol）、10#（65%vol）]：某白酒企業(yè)提供。

甲醇、乙酸乙酯、乙醇（均為色譜純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；乳酸乙酯（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；叔戊醇（純度99%）：阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；乙酸正戊酯（色譜純）：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2030氣相色譜儀：日本島津公司；CP225D電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UPR-Ⅱ-10TNP超純水機(jī)：四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取0.5 g甲醇，2.5 g乙酸乙酯、2.5 g乳酸乙酯，至100 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇定容至刻度，充分混勻，其中，甲醇質(zhì)量濃度為5000 mg/L，乙酸乙酯、乳酸乙酯的質(zhì)量濃度為25 000 mg/L，0～4 ℃密封保存。

混合內(nèi)標(biāo)溶液：分別準(zhǔn)確稱取2.0 g叔戊醇、2.0 g乙酸正戊酯至100 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇定容至刻度，充分混勻，內(nèi)標(biāo)溶液的質(zhì)量濃度為20 000 mg/L，0～4 ℃密封保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別準(zhǔn)確移取甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL于5個10 mL的容量瓶中，然后加入0.1 mL叔戊醇、乙酸正戊酯混合內(nèi)標(biāo)溶液，以體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液定容至刻度，依次配制成甲醇質(zhì)量濃度為50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、乙酸乙酯和乳酸乙酯質(zhì)量濃度為250 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L、2 000 mg/L、2 500 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

移取9.9 mL樣品置于10 mL容量瓶中，加入0.1 mL混合內(nèi)標(biāo)（20 000 mg/L），充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 分析檢測

甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯的檢測采用氣相色譜法。

色譜條件：CP-WAX57CB色譜柱（50.0 m×0.25 mm×0.20 μm）；進(jìn)樣量1.0 μL；進(jìn)樣口溫度250 ℃；分流比50∶1；氫火焰離子化檢測器（hydrogen flame ionization detector，F(xiàn)ID）250 ℃；柱箱梯度升溫程序?yàn)槌鯗?0 ℃，以3.5 ℃/min升到80 ℃，以35 ℃/min升到180 ℃，保持2.5 min。

定性、定量分析：根據(jù)甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯的單標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時間進(jìn)行定性，內(nèi)標(biāo)法定量。采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到樣品中各待測組分的質(zhì)量濃度與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度的比值Ii，再根據(jù)待測組分對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的濃度ρi，計算樣品中各待測組分的含量Xi進(jìn)行定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：將配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液參考色譜條件測定各組分的峰面積。以甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，以甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯峰面積與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制其標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，獲得其回歸方程。其中，甲醇以叔戊醇為內(nèi)標(biāo)，乙酸乙酯、乳酸乙酯以乙酸正戊酯為內(nèi)標(biāo)。樣品中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量計算公式如下：

式中：Xi為樣品中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量，g/L；Ii為從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯質(zhì)量濃度與對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度的比值；ρi為甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度，mg/L；1 000為單位換算系數(shù)。

1.3.4 方法學(xué)考察

（1）線性方程、檢出限及定量限

按照1.3.1中配制好混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液后，用1.3.3的色譜工作條件進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液中各組分的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，各組分峰面積與其對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并且分別按照信噪比S/N=3和S/N=10計算得到方法的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），采用逐級稀釋法確定甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯的最低檢出濃度。

（2）樣品的精密度及加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)：在清香型酒樣中加入一定質(zhì)量濃度的甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2的方法進(jìn)行樣品前處理，用1.3.3的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測定后，計算各組分的精密度試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

加標(biāo)回收率試驗(yàn)：在已測定本底值的清香型酒樣中分別準(zhǔn)確加入一定質(zhì)量濃度的甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2的方法進(jìn)行樣品前處理，用1.3.3的色譜條件進(jìn)行測定后計算其加標(biāo)回收率。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

利用LabSolution查看色譜圖、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Origin81軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 定性分析結(jié)果

按照1.3.3的色譜條件對甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯3種單標(biāo)溶液進(jìn)行測定，確定各物質(zhì)的出峰順序和保留時間。按照1.3.1配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，根據(jù)保留時間定性。3種標(biāo)準(zhǔn)品和2種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的混合溶液氣相色譜圖見圖1。從圖1可知，甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯和其對應(yīng)的2種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)能夠完全分離，峰形尖銳，在17 min內(nèi)完成檢測。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of mixed standard solution

2.1.2 線性關(guān)系、檢出限及定量限

對混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯峰面積與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出各組分回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，計算檢出限及定量限，結(jié)果見表1。由表1可知，各組分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均＞0.999。甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯檢出限分別為0.12mg/L、0.74 mg/L、0.66 mg/L，定量限分別為0.39 mg/L、2.44 mg/L、2.18 mg/L，說明該方法檢出限較低，靈敏度高。

表1 各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限Table 1 Standard curve regression equation, correlation coefficient,linear range, detection limit and quantification limit of each component

2.1.3 精密度試驗(yàn)

用同一酒樣，按照1.3.2的步驟配制樣品，再按照1.3.3色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積計算各組分的含量，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。由表2可知，甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯含量測定結(jié)果的RSD分別為2.29%、0.59%、1.03%，表明該方法精密度良好。

表2 各組分的精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 Precision test results of each component (n=6)

2.1.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取同一酒樣，測定本底值后，分別準(zhǔn)確加入低、中、高質(zhì)量濃度的甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液后，平行測定6次，計算各組分的加標(biāo)回收率及RSD，結(jié)果見表3。由表3可知，甲醇的平均加標(biāo)回收率為94.3%～100.4%，乙酸乙酯的平均加標(biāo)回收率為93.4%～100.2%，乳酸乙酯的平均加標(biāo)回收率為96.3%～99.8%，加標(biāo)回收率測定結(jié)果的RSD分別為1.35%～2.89%、0.45%～2.82%、0.59%～2.33%，均＜3%，滿足分析要求。表示該方法準(zhǔn)確度高。

表3 各組分的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Experimental results of adding standard recovery rate of each component (n=6)

2.2 樣品的測定

對10個不同酒精度的清香型白酒樣品，按照方法1.3.2制備3組待測平行樣，分別按照1.3.3條件進(jìn)行進(jìn)樣，測定3種化合物的含量并計算平行樣品中甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯含量的RSD，結(jié)果見表4。由表4可知，各樣品中的甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯在3次平行測定中含量的RSD值均＜3%，說明該方法在實(shí)際樣品檢測中精密度能較好的滿足檢測要求。

表4 樣品測定結(jié)果Table 4 Determination results of samples

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了氣相色譜內(nèi)標(biāo)法同時測定清香型白酒中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯含量的方法。甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯能夠?qū)崿F(xiàn)有效分離，在17 min內(nèi)完成檢測；在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999，甲醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯檢出限（LOD）分別為0.12 mg/L、0.74 mg/L、0.66 mg/L；定量限（LOQ）分別為0.39 mg/L、2.44 mg/L、2.18 mg/L。其精密度試驗(yàn)結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.59%、1.03%、2.29%；加標(biāo)回收率分別為94.3%～100.4%、93.4%～100.2%、96.3%～99.8%。檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于清香型白酒中甲醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯快速分析檢測。