高山被孢霉產(chǎn)多不飽和脂肪酸發(fā)酵條件優(yōu)化

賈路遙，盧曉霆*，宋遙遙

（長春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012）

多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是指碳鏈中含有兩個或兩個以上雙鍵的脂肪酸，主要包括亞油酸（linoleic acid，LA）、亞麻酸（linolenic acid，LNA）及其衍生物[1-3]。PUFAs是人及動物生長發(fā)育所必需的脂肪酸，對人體有重要的生理功能[4-6]。PUFAs能調(diào)節(jié)人體的脂質(zhì)代謝，治療和預(yù)防心腦血管疾病，促進(jìn)生長發(fā)育[7-9]，此外對抗癌、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老、減肥、美容等方面均具有重要的生理作用[10-12]。目前PUFAs主要從植物種子、海洋魚油和一些哺乳動物中提取，但加工處理復(fù)雜且污染嚴(yán)重[13-15]。微生物作為PUFAs的又一主要來源，相比植物種子、海洋魚油和一些哺乳動物，微生物具有生長周期短、培養(yǎng)簡單、PUFAs含量高的特點(diǎn)[16-18]，使得利用微生物生產(chǎn)PUFAs成為近幾年來人們研究的熱點(diǎn)，尤其是日本、英國等國家已經(jīng)先后問世了PUFAs中花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）的發(fā)酵產(chǎn)品[19-21]。國內(nèi)在這一領(lǐng)域的研究起步較晚，雖然在發(fā)酵生產(chǎn)PUFAs方面有了一定的研究，但是還存在菌體生物量和油脂產(chǎn)量偏低的問題，與國外發(fā)達(dá)國家相比還有著不足和差距，離大規(guī)模生產(chǎn)存在一定的距離[22-23]。

玉米粉水解糖液作為發(fā)酵工業(yè)物美價廉的重要原料，含有葡萄糖、蛋白質(zhì)、脂肪及多種維生素、礦物質(zhì)和微量元素等[24-26]。目前國內(nèi)外微生物主要以葡萄糖為碳源發(fā)酵生產(chǎn)PUFAs，相比葡萄糖，玉米糖具有成本低，含營養(yǎng)物質(zhì)豐富等優(yōu)點(diǎn)[27-28]。

本研究以高山被孢霉（Mortierella alpina）3.12824為發(fā)酵菌株，玉米糖為碳源，酵母膏為氮源，以生物量和油脂產(chǎn)量為評價指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)對菌株3.12824產(chǎn)PUFAs發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。采用氣相色譜（gaschromatography，GC）法分析油脂中脂肪酸組成，為高山被孢霉3.12824工業(yè)化生產(chǎn)PUFAs提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

高山被孢霉（Mortierella alpina）3.12824：中國普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[29]：馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、瓊脂20.0 g/L。121 ℃滅菌20 min。

液體種子培養(yǎng)基[30-31]：葡萄糖30.0 g/L、酵母膏6.0 g/L、KH2PO43.0 g/L、NaNO33.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 6.0。裝液量200 mL/L，121℃滅菌30min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[30-31]：玉米糖70.0 g/L、酵母膏10.0 g/L、KH2PO43.8 g/L、NaNO33.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 6.0。裝液量200 mL/L，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖、鹽酸、磷酸二氫鈉（均為分析純）：北京化工廠；酵母粉（生化試劑）：上海麥克林生化科技有限公司；硫酸鎂（分析純）：天津市津北精細(xì)化工有限公司；無水乙醇、石油醚（均為分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氫氧化鈉、硝酸鈉（均為分析純）、瓊脂粉（生化試劑）：天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

NTX-80B霉菌培養(yǎng)箱：天津市宏諾儀器有限公司；BgT-8A糖化儀：杭州博日科技有限公司；BSD-TX270恒溫振蕩器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療醫(yī)療設(shè)備廠；RE 5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；JD-05高速萬能粉碎機(jī)：上海市九鼎工貿(mào)有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵：北京科偉永興儀器有限公司；LH-T55數(shù)顯折光儀：杭州陸恒生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株3.12824發(fā)酵制備油脂工藝流程及操作要點(diǎn)

菌種斜面試管保藏→菌種傳代活化→菌體種子液制備→菌體分散接種→菌體發(fā)酵液制備→真空抽濾分離菌體→收集濕菌體→菌體干燥→干菌體→菌體粉碎→索氏提取→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器脫水脫溶→油脂

操作要點(diǎn)：

菌種活化：將高山被孢霉3.12824接種到PDA斜面上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，形成厚度適中的白色絨毛狀菌落，4 ℃保存。

種子液的制備：用移液槍向活化后的高山被孢霉斜面加入20 mL無菌水，無菌接種環(huán)刮去斜面上的孢子制成孢子懸液，接種于裝有200 mL種子培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，于25 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，得到種子液。

發(fā)酵液的制備：培養(yǎng)結(jié)束的種子液倒入高溫滅菌燒杯中，用分散機(jī)8 000 r/min打散種子液20 s，而后用移液槍取體積為10%的種子液于裝液量為200 mL/L發(fā)酵培養(yǎng)基中。25 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，得到發(fā)酵液。

菌體收集、干燥：將發(fā)酵液用真空泵抽濾，所得菌體加蒸餾水洗滌3次，于70 ℃烘干至恒質(zhì)量，得干菌體，并計(jì)算菌體生物量（菌體干質(zhì)量/發(fā)酵液體積）。

油脂的制備：干菌體用研缽磨碎成粉末后，于索氏提取器中石油醚60 ℃不斷冷凝回流提取5 h，收集全部回流液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收石油醚，得到油脂，并計(jì)算油脂產(chǎn)量（油脂干質(zhì)量/發(fā)酵液體積）。

1.3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

在碳源為玉米糖70.0 g/L、氮源為酵母膏10.0 g/L、微量元素KH2PO43.8 g/L、NaNO33.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、培養(yǎng)溫度26 ℃、培養(yǎng)時間6 d、pH 6.0、裝液量200 mL/L基礎(chǔ)條件下，固定其他因素，分別改變碳源添加量、氮源添加量、初始pH值、發(fā)酵溫度、裝液量、發(fā)酵時間，研究各單因素對菌株發(fā)酵生物量及油脂產(chǎn)量的影響。

（2）正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，以生物量及油脂產(chǎn)量為評價指標(biāo)，分別考察發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）、初始pH值（C）、裝液量（D）4個因素對高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響，發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.3 油脂脂肪酸組成測定

采用氣相色譜法分析高山被孢霉3.12824產(chǎn)油脂中脂肪酸組成。

氣相色譜條件：毛細(xì)管色譜柱，聚二氰丙基硅氧烷強(qiáng)極性固定相（100 m×0.25 mm×0.2 μm）；火焰離子檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）；進(jìn)樣器溫度為280 ℃，載氣為氮?dú)猓∟2），進(jìn)樣體積1.0 μL。

定性定量分析：采用保留時間定性，歸一化法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 氮源添加量對菌株3.12824發(fā)酵的影響

對高山被孢霉而言，培養(yǎng)基中氮源質(zhì)量濃度對菌絲體生長和油脂積累影響很大，碳源質(zhì)量濃度相同的條件下，氮源質(zhì)量濃度過高或過低都不利于油脂的積累。在其他條件不變的情況下，考察酵母膏添加量（6.0 g/L、8.0 g/L、10.0 g/L、12.0 g/L、14.0 g/L）對菌株3.12824生物量及油脂產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 酵母膏添加量對生物量和油脂產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of yeast extract addition on biomass and oil production

由圖1可知，隨著酵母膏添加量在6～12.0 g/L范圍內(nèi)的提高，生物量逐漸升高，油脂產(chǎn)量也逐漸增加；當(dāng)酵母膏添加量為12.0 g/L時，生物量達(dá)到23.00 g/L，而油脂產(chǎn)量達(dá)到最高值8.74 g/L；酵母膏添加量＞12.0 g/L之后，生物量隨之稍有增加，但油脂產(chǎn)量隨之降低。其原因?yàn)槌渥愕牡词咕w生長不受抑制，生物量小幅度提高，導(dǎo)致碳源可能主要用于菌體生長方向，脂類合成方向受阻，從而使油脂產(chǎn)量降低。綜合考慮，酵母膏最適添加量為12.0 g/L。

2.1.2 碳源質(zhì)量濃度對菌株3.12824發(fā)酵的影響

高山被孢霉胞內(nèi)油脂的主要存在形式是甘油三酯，而甘油三酯主要元素為碳。在其他條件不變的情況下，考察玉米糖添加量（65.0 g/L、70.0 g/L、75.0 g/L、80.0 g/L、85.0 g/L）對菌株3.12824生物量及油脂產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 玉米糖添加量對生物量和油脂產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of corn sugar addition on biomass and oil production

由圖2可知，當(dāng)玉米糖添加量為65～80.0 g/L時，生物量和油脂產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)玉米糖添加量為80.0 g/L時，生物量和油脂產(chǎn)量達(dá)到最高值，分別為23.00 g/L和8.51 g/L；當(dāng)玉米糖添加量＞80.0 g/L之后，生物量和油脂產(chǎn)量有所下降。因此，最適玉米糖添加量為80.0 g/L。

2.1.3 初始pH值對菌株發(fā)酵3.12824的影響

初始pH值會改變細(xì)胞膜電荷，影響其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時還影響代謝過程中酶的活性。高山被孢霉生產(chǎn)油脂的pH值為4～8，在其他條件不變的情況下，分別考察初始pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）對菌體生物量和油脂產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 初始pH值對生物量和油脂產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of initial pH value on biomass and oil production

由圖3可知，當(dāng)初始pH值為5.5～6.5時，生物量及油脂產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)初始pH值為6.5時，生物量及油脂產(chǎn)量達(dá)到最大值，分別為22.50 g/L和8.45 g/L；當(dāng)初始pH值＞6.5之后，生物量及油脂產(chǎn)量有所下降。因此，最適初始pH值為6.5。

2.1.4 發(fā)酵時間對菌株3.12824發(fā)酵的影響

發(fā)酵時間對菌株發(fā)酵十分重要，培養(yǎng)時間過短，菌體無法良好生長，導(dǎo)致油脂無法很好的積累。培養(yǎng)時間過長，發(fā)酵成本變高，同時出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，導(dǎo)致油脂進(jìn)入培養(yǎng)基中，很難收集。在其他條件不變的情況下，考察發(fā)酵時間（6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）對菌體生物量和油脂產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對生物量和油脂產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on biomass and oil production

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵時間在6～7 d，隨著培養(yǎng)時間延長，菌體生物量和油脂產(chǎn)量明顯提高；當(dāng)發(fā)酵時間在7 d時達(dá)到菌體生物量和油脂產(chǎn)量最大值，分別為24.00 g/L和8.40 g/L；當(dāng)發(fā)酵時間在7～10 d時，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌體生物量和油脂產(chǎn)量均稍有下降。隨著培養(yǎng)時間延長，菌絲體利用發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)逐步累積代謝油脂，油脂產(chǎn)量也有明顯提高，發(fā)酵時間過長，菌絲體不再生長，且產(chǎn)生自溶現(xiàn)象，導(dǎo)致生物量及油脂產(chǎn)量也逐步下降。因此，最適發(fā)酵時間為7 d。

2.1.5 發(fā)酵溫度對菌株3.12824發(fā)酵的影響

當(dāng)發(fā)酵溫度過低時，菌絲生長受到抑制。其原因是低溫不利于菌株吸收利用碳源，導(dǎo)致整個發(fā)酵過程中菌株生長緩慢；此外，菌株在低溫條件下存在更長的延滯期，這也是生物量降低的因素之一。在其他條件不變的情況下，考察發(fā)酵溫度（23 ℃、24 ℃、25 ℃、26 ℃、27 ℃）對菌體生物量和油脂產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 發(fā)酵溫度對生物量和油脂產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on biomass and oil production

由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為23～25 ℃時，生物量和油脂產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到25 ℃時，高山被孢霉生物量和油脂產(chǎn)量達(dá)到最大值，分別為22.12 g/L和8.42 g/L；當(dāng)發(fā)酵溫度＞25 ℃之后，生物量及油脂產(chǎn)量逐步降低。其原因?yàn)楦呱奖绘呙股L是一個高需氧的過程，發(fā)酵液溶氧能力會隨著溫度的升高緩慢降低，當(dāng)發(fā)酵溫度太高，發(fā)酵液中低的溶氧量會抑制菌株生長，導(dǎo)致菌體生物量降低，油脂產(chǎn)量降低。因此，最適發(fā)酵溫度為25 ℃。

2.1.6 裝液量對菌株3.12824發(fā)酵的影響

高山被孢霉屬好氧菌，發(fā)酵生產(chǎn)油脂過程中有很大的氧需求量。裝液量主要是通過改變氧供給來影響菌株發(fā)酵。裝液量過多，培養(yǎng)液液面與空氣接觸面積變小，相對氧氣量就會變少，進(jìn)而會導(dǎo)致由于氧氣不足而抑制菌體生長和發(fā)酵產(chǎn)油脂；裝液量過少，培養(yǎng)液液面與空氣接觸面積變大，氧氣量充足，但菌體的生長會因營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏而受限制。在其他條件不變的情況下，考察裝液量（100 mL/L、150 mL/L、200 mL/L、250 mL/L、300 mL/L）對菌體生物量和油脂產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 裝液量對生物量和油脂產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of liquid medium volume on biomass and oil production

由圖6可知，當(dāng)裝液量為100～200 mL/L時，高山被孢霉生物量及油脂產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)裝液量為200 mL/L時，高山被孢霉生物量及油脂產(chǎn)量達(dá)到最大值，分別為20.62 g/L和6.75 g/L；當(dāng)裝液量為200～300 mL/L時，高山被孢霉生物量及油脂產(chǎn)量有所下降。因此，最適裝液量為200 mL/L。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上。在培養(yǎng)基玉米糖添加量80.0 g/L、酵母膏添加量12.0 g/L、KH2PO43.8 g/L、NaNO33.4 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L的條件下，考察發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）、初始pH值（C）、裝液量（D）四個因素對高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，影響生物量的4因素主次順序?yàn)锽＞A＞D＞C，最佳發(fā)酵條件為A2B2C2D2。影響油脂產(chǎn)量的4因素主次順序?yàn)锽＞D＞A＞C，最佳發(fā)酵條件組合為A2B2C2D2。因此，得到最佳發(fā)酵條件為裝液量200 mL/L、發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵溫度25 ℃、初始pH 6.5。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，生物量為26.05 g/L，油脂產(chǎn)量為9.37 g/L。

由表3可知，影響菌株發(fā)酵生物量和油脂產(chǎn)量的4個因素中，發(fā)酵時間對生物量、油脂產(chǎn)量均有顯著影響（P＜0.05），培養(yǎng)溫度、裝液量、初始pH值均無顯著影響（P＞0.05）。

2.3 油脂脂肪酸組成

采用氣相色譜分析高山被孢霉產(chǎn)油脂中脂肪酸組成，結(jié)果見圖7和表4。由圖7和表4可知，油脂中不飽和脂肪酸C18：1、C18：2、C18：3、C20：4、C20：4的含量分別為17.72%、5.73%、0.75%、5.83%、39.93%，總含量超過69.00%，其中多不飽和脂肪酸（C18：2、C18：3、C20：3、C20：4）的總含量超過52.00%，花生四烯酸含量最為豐富，含量達(dá)到39.93%，可進(jìn)一步作為功能性油脂深入研究。

圖7 高山被孢霉產(chǎn)油脂脂肪酸組成分析氣相色譜圖Fig.7 Gas chromatogram of fatty acids analysis in oil produced by Mortierella alpina

表4 高山被孢霉所產(chǎn)油脂中脂肪酸組成分析結(jié)果Table 4 Composition analysis results of fatty acids in oil produced by Mortierella alpina

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了高山被孢霉產(chǎn)多不飽和脂肪酸的最佳發(fā)酵條件，試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)碳源玉米糖液添加量為80.0 g/L、氮源酵母膏添加量為12.0 g/L、KH2PO4為3.8 g/L、NaNO3為3.4 g/L、MgSO4·7H2O為0.5 g時，影響生物量主次順序?yàn)锽＞A＞D＞C，即發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞裝液量＞初始pH值，影響油脂產(chǎn)量主次順序?yàn)锽＞D＞A＞C，即發(fā)酵時間＞裝液量＞發(fā)酵溫度＞初始pH值。高山被孢霉產(chǎn)多不飽和脂肪酸的最佳發(fā)酵條件為裝液量200 mL/L、發(fā)酵時間為7 d、發(fā)酵溫度25 ℃、初始pH值為6.5，在此優(yōu)化條件下，菌株發(fā)酵生物量和油脂產(chǎn)量分別達(dá)到26.05 g/L和9.37 g/L。通過氣相色譜分析油脂中脂肪酸組成，油脂中不飽和脂肪酸C18：1、C18：2、C18：3、C20：3、C20：4的含量分別為17.72%、5.73%、0.75%、5.83%、39.93%，總含量超過69.00%，其中多不飽和脂肪酸（C18：2、C18：3、C20：3、C20：4）的總含量超過52.00%。